Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Аналитический обзор литературы 15
1.1. Роль и значение определения содержания химических соединений в биологических средах в структуре гигиенических и диагностических исследований 15
1.2. Основные методические приемы и особенности при выполнении исследований по определению химических соединений в биосредах 19
1.3. Обзор методов определения химических соединений в биосредах 26
1.4. Некоторые свойства и механизм токсического действия исследуемых соединений 53
Глава 2. Объекты, исходные материалы, объемы и методы исследований 83
Глава 3. Методические особенности разработки методов определения органических соединенй в биосредах 91
3.1. Методические особенности определения ряда предельных и ароматических углеводородов (гексан, гептан, бензол, толуол, о-,м-, п-ксилол, этилбензол) 92
3.2. Основные методические особенности и этапы разработки метода определения стирола в крови с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 95
3.3. Методические разработки и рекомендации по определению предельных спиртов (метилового, этилового, бутилового и изо-бутилового) в биосредах 104
3.4. Методические особенности и практические рекомендации по 107 определению ацетона в биосредах (кровь, моча)
3.5. Методические особенности определения формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в биосредах (кровь, моча) 109
3.6. Методические приемы, используемые при определении ароматических аминосоединений в биосредах 120
3.7. Методические приемы, используемые при определении фенола и его производных в биосредах 123
Глава 4. Разработка методов атомно-абсорбционного определения ряда тяжелых металлов в биологических средах 142
4.1. Разработка методов определения тяжелых металлов методом атомно-абсорбционного анализа в режиме пламенной атомизации 144
4.1.1. Обоснованием способа определения марганца, свинца, цинка, никеля, меди, хрома, кадмия, железа в моче, желчи, желудочном соке (прямая элементометрия) 148
4.1.2. Исследования по определению содержания ряда тяжелых металлов в биологических средах с использованием различных модификаций способов перевода биологического материала в анализируемый раствор (кровь, волосы) 152
4.2. Разработка методов определения тяжелых металлов атомно- абсорбционным анализом в режиме электротермической атомизации на примере метода определения ванадия в крови 161
4.2.1. Выбор и установление аналитических параметров для определения ванадия 163
4.2.2. Отработка рекомендаций по установлению температурно-временной программы работы печи для определения ванадия 167
4.2.3. Регистрация аналитического сигнала и построение градуировочной зависимости 174
4.2.4. Отработка и апробация методических подходов определения ванадия в крови 177
Глава 5. Разработка и обоснование фоновых региональных уровней содержания химических соединений в биологических средах 181
5.1. Методические основы разработки критериальных подходов к установлению фоновых уровней содержания химических соединений в биологических средах детей 182
5.1.1. Выбор контрольной территории 182
5.1.2. Критерии отбора детей в контрольную группу 183
5.1.3. Химико-аналитические исследования по определению содержания химических соединений в биосредах 184
5.1.4. Методика расчета фоновых уровней содержания химических соединений в организме 185
5.2. Разработка фоновых уровней содержания химических соединений в биологических средах 186
5.2.1. Разработка фоновых уровней содержания металлов в биосредах детского населения 187
5.2.2. Анализ данных и расчет фоновых уровней содержания фторидов в моче 193
5.2.3. Определение фоновых уровней содержания органических соединений ксенобиального происхождения в биосредах 194
5.2.4. Разработка фоновых уровней содержания метаболических органических соединений в биологических средах 199
Глава 6. Ранжирование и оценка анторпогеннои нагрузки территорий пермского региона по результатам биомониторинга детского населения для задач обеспечения гигиенической безопасности 208
6.1. Общая характеристика Пермской области и отдельных промышленных территорий как объектов исследований (экологические и медико-демографические аспекты) 208
6.2. Обоснования выбора показателей антропогенной нагрузки при проведении биомониторинга детского населения 219
6.3. Ранжирование и сравнительная оценка результатов химико-аналитических исследований в рамках биомониторинга детского населения Пермского региона 225
Глава 7. Формирование доказательной базы негативного влияния экологических факторов на состояние здоровья населения 239
7.1. Оценка экологической ситуации п. Павлово Пермского региона 240
7.2. Основные результаты медико-экологического обследования... 243
7.3. Алгоритм формирования доказательной базы негативного влияния токсикантной нагрузки 250
7.4. Оценка токсикантной нагрузки после комплекса лечебных мероприятий 257
Глава 8. Гигиеническая оценка зависимостей в системе "окружающая среда - здоровье" с использованием элементов оценки риска для обоснования критериальных и оценочных величин подсистемы медико-биологического мониторинга .. 264
8.1. Общая характеристика г. Чусового как объекта исследования 265
8.2. Оценка состояния окружающей среды и здоровья населения г. Чусового 272
8.3. Установление содержания химических соединений в биосредах, соответствующего приемлемому уровню риска для здоровья по критерию функциональных изменений 278
8.4. Установление уровней содержания химических соединений в биосредах, соответствующих приемлемому уровню риска для здоровья по критерию связи заболеваемости с маркерами экспозиции 290
Обсуждение результатов 295
Выводы 308
Библиография
- Основные методические приемы и особенности при выполнении исследований по определению химических соединений в биосредах
- Методические особенности определения формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в биосредах (кровь, моча)
- Обоснованием способа определения марганца, свинца, цинка, никеля, меди, хрома, кадмия, железа в моче, желчи, желудочном соке (прямая элементометрия)
- Выбор контрольной территории
Введение к работе
Угроза здоровью человека, связанная с загрязнением окружающей среды, является в настоящее время одной из самых актуальных проблем [16, 118, 177, 178, 180,182, 202, 203]. Несмотря на то, что интенсификация роста промышленного производства вносит существенный положительный вклад в улучшение здоровья населения, ее последствия также неизбежно сопряжены с неблагоприятным воздействием на организм и здоровье человека [135, 197, 191].
По данным ВОЗ загрязнение окружающей среды обусловливает во всем мире примерно 25% всех болезней, при этом на долю детей приходится более 60% заболеваний, вызванных этой причиной [418].
Одним из подходов для оценки степени неблагоприятного воздействия и диагностики экозависимых изменений состояния здоровья населения является определение химических соединений в биосредах человека [82, 101]. В докладах экспертов Всемирной организации здравоохранения по критериям качества окружающей среды в связи с воздействием на организм человека наиболее токсичных соединений рекомендуется проводить биомониторинг с определением их содержания в биосредах [30, 214].
Определение химических соединений в биосредах, являясь одним из основных принципов диагностики экозависимых состояний, позволяет оценить эффективность комплексов лечебно-профилактических технологий [101]. Кроме того, определение химических соединений в биосредах, наряду с расчетными, тестовыми методами, натурными исследованиями, может быть использовано для оценки комплексной антропогенной нагрузки на территории, при планировании природоохранных мероприятий и при проведении санитарно-гигиенического мониторинга [150].
Исследование биосред человека на содержание компонентов антропогенной нагрузки в большей степени определяется созданием надежных и эффективных методических приемов, внедрением новых
аналитических способов контроля содержания химических соединений широкого спектра, в том числе органических соединений различных классов, неорганических соединений, тяжелых металлов в биологических средах [82, 279].
Методы определения химических соединений в биосредах должны отличаться высокой селективностью, низким пределом обнаружения и высокой информативностью (надежностью) получаемых результатов при идентификации и количественном определении химических соединений различных классов [89,91].
Высокая чувствительность и селективность этих методов наряду с оптимальными условиями пробоподготовки отработанными и рекомендованными для каждого определяемого соединения позволяют получить достоверную информацию о концентрации различных химических веществ (эндогенного и экзогенного происхождения) [61, 82, 210, 279, 281, 425].
Методические приемы, положенные в основу методов определения химических соединений в биологических средах, должны обеспечивать точность, достоверность результатов и, вместе с тем, должны быть доступными, недорогими и индикативными. Доступность методов позволяет повысить массовость исследований и сформировать наиболее полную картину присущих данному региону элементных нарушений, идентифицировать контаминанты, характерные для локального антропогенного воздействия [29].
Вместе с тем, большинство существующих в настоящее время методов определения химических соединений в биологических средах отличаются недостаточной селективностью, низкой чувствительностью, трудоемкостью выполнения и находят применение, как правило, в исследованиях по судебной медицине и экспериментальных токсикологических исследованиях [32,61,133,248].
Разработка методов определения химических соединений в биосредах требует определения исследуемых соединений на фоне макроколичества биологического материала сложного состава (сложной матрицы). В процессе выполнения исследований, как правило, приходится изолировать и количественно определять несколько микрограммов анализируемого компонента в присутствии относительно высоких количеств органических соединений и мешающих ионов [230].
Кроме того, разработка методов определения химических соединений в биосредах связана с отработкой специальных приемов, позволяющих повысить чувствительность и произвести эффективное выделение определяемого соединения из биологической матрицы сложного состава, поэтому особое внимание при разработке методов уделяется специальным способам пробоподготовки [61,133].
Наряду с вышеизложенным, при анализе биосред следует учитывать тот факт, что ряд соединений, в основном относящихся к классу органических веществ в обычных условиях не присутствуют в организме человека. Они определяются в биосредах только в случае влияния антропогенных источников воздействия на организм человека - это ксенобиотики [20, 144, 187].
Среди рассмотренных в данной работе соединений это ряд ароматических и предельных углеводородов - бензол, толуол, о-, м-, п-ксилол, этилбензол, гептан, стирол. Ряд кислородсодержащих соединений, таких как ацетон, фенол, формальдегид, метиловый спирт характеризуются тем, что наряду с антропогенными источниками поступления в организм, являются метаболитами других, как правило, более сложных органических соединений и практически всегда присутствуют в исследуемых биосредах [23,31,60,75].
Кроме того, в биосредах человека присутствует большой спектр макро-и микроэлементов, металлов, таких как медь, цинк, магний, свинец, хром, марганец, никель и т.д., которые присутствуют в организме в определенном
диапазоне концентраций и сдвиг этого диапазона под влиянием антропогенных источников воздействия в ту или другую сторону может вызывать негативные последствия для человека [59, 60, 218,228, 229].
Методы определения химических соединений в биосредах, наряду с клинико-диагностическими, эпидемиологическими, статистическими и другими методами исследований позволяют в комплексе решать вопросы по изучению общих механизмов взаимодействия организма человека с химическими факторами окружающей среды и выявлению риска для здоровья при малых уровнях воздействия различных контаминантов [21,41, 150,261,269,273].
Наряду с разработкой методов определения контаминантов в биосредах нерешенным является вопрос о критериях оценки содержания химических соединений в биосредах при выполнении гигиенических и медико-биологических исследований с учетом территориальных особенностей. Одним из вариантов оптимального решения этого вопроса является разработка методических подходов по установлению региональных фоновых уровней содержания химических соединений в биосредах детского населения.
В процессе отработки концепции оценки риска здоровью при формировании доказательной базы негативного влияния экологических факторов на состояние здоровья населения одним из приоритетных этапов исследований также является определение химических соединений в биологических средах населения [182,273].
Определение химических соединений в биосредах может быть использовано при реализации концепции оценки риска здоровью и установлении уровней соответствующих приемлемому риску, которые могут быть использованы в качестве критериев при проведении медико-биологического мониторинга.
Все вышеизложенное определило актуальность настоящих исследований и позволило определить цель настоящей работы - разработка научно-
методических основ химико-аналитического обеспечения контроля содержания химических соединений в биологических средах для задач гигиенических и медико-биологических исследований в экологии человека.
Для достижения поставленной цели в работе решены следующие основные задачи исследования:
научно обосновать концептуальные основы и системный алгоритм химико-аналитического обеспечения медико-биологических и гигиенических исследований для задач экологии человека;
разработать систему научно-методических принципов химико-аналитического определения ряда соединений классов ароматических углеводородов, алифатических спиртов, алифатических альдегидов, фенолов, кетонов, ароматических аминов в биологических средах человека (кровь, моча) на уровне микроконцентраций для задач социально-гигиенического мониторинга;
создать научно-методическое и критериальное обеспечение химико-аналитического контроля содержания тяжелых металлов и микроэлементов в биологических средах человека с высокой чувствительностью, с низким пределом определения на фоне сложной матрицы для задач биомониторинга населения;
обосновать научно-методическую основу критериальной оценки контаминантной нагрузки организма на основе системных зависимостей с факторами воздействия на организм;
оценить гигиеническую эффективность разработанных методических подходов и принципов контроля в условиях региональной модели для задач классификации и ранжирования гигиенических проблем и закономерностей их формирования;
внедрить в практику гигиенических исследований, социально-гигиенического мониторинга, медицины окружающей среды и экологии человека предложенную систему химико-аналитического обеспечения.
Теоретическая значимость данной работы заключалась в том, что в результате проведенных исследований сформировано новое научное направление по химико-аналитической диагностике контаминантной нагрузки биосред населения в области гигиены и экологии человека.
Научная новизна работы заключалась в следующем!
впервые разработана оригинальная комплексная модель подсистемы биологического мониторинга, как составная часть социально-гигиенического мониторинга регионального уровня;
создана новая система высокочувствительных и селективных методов определения 26 органических соединений - представителей классов ароматических углеводородов, алифатических спиртов, алифатических альдегидов, фенолов, кетонов, ароматических аминов с чувствительностью определения на уровне 0,001-0,09 мг/дм и 9 металлов в биологических
средах человека на уровне 0,0015-0,05 мг/дм ;
впервые проведены классификация и ранжирование гигиенических проблем, связанных с выявлением приоритетных территорий по антропогенной нагрузке, на основании исследования биосред населения с использованием в качестве оценочных величин региональные фоновые уровни содержания химических соединений в биосредах.;
предложены принципы гигиенической оценки закономерностей формирования нарушений здоровья, обусловленных контаминантной нагрузкой внутренних сред организма, заключающиеся в анализе зависимостей "маркер экспозиции - маркер ответа" с использованием показателей риска;
обоснована методическая и критериальная оценка антропогенной и фоновой котаминантной и микроэлементной нагрузки 36 химических соединений широкого спектра;
создана новая диагностическая система, основанная на элементах доказательной медицины, для задач социально-гигиенического мониторинга (подсистема медико-биологического мониторинга) и медицины окружающей
среды (клинико-лабораторные исследования, оценка эффективности лечебно-профилактических мероприятий).
На защиту выносятся следующие положения:
Научно-методические основы химико-аналитических определений содержания химических соединений классов ароматических углеводородов, ароматических аминов, алифатических спиртов, алифатических альдегидов, кетонов, тяжелых металлов и микроэлементов в биосредах человека для медико-биологических исследований в экологии человека,
Методические основы критериальной оценки содержания химических соединений в биосредах, алгоритм формирования и определения фоновых уровней содержания химических соединений в биосредах детей для сравнительной оценки риска антропогенной нагрузки на территории, состояния здоровья населения и проведения социально-гигиенических мероприятий.
Возможность оценки антропогенной нагрузки на человека впервые предложенным комплексом исследований, включающим определение химических соединений в биосредах и формированием доказательной базы медико-биологического ответа.
Практическая значимость работы заключается в создании нового направления диагностических исследований - химико-аналитических исследований по определению содержания химических соединений в биосредах отдельных групп населения, проживающих в условиях высокой антропогенной нагрузки.
Определение химических соединений в биосредах является одним из основных принципов диагностики экозависимых состояний, позволяет оценить эффективность комплексов элиминационных технологий и лечебно-профилактических мероприятий, направленных на выведение контаминанта из организма и улучшение состояния здоровья, позволяет решать проблемы обеспечения санитарно-гигиенической безопасности населения и контроля за эффективностью природоохранных мероприятий.
Результаты выполненных комплексных аналитических исследований применены на практике при разработке гигиенических рекомендаций для ряда целевых комплексных программ регионального и муниципального уровня.
Результаты работы использованы при подготовке ряда законодательных, нормативно-методических, программных и информационных документов различного уровня:
закон Пермской области об областной целевой комплексной программе "Охрана окружающей среды Пермской области" на 2001-2005 гг. (№ 16390263 от 12.07.2001 г.);
государственный доклад "О санитарно-эпидемиологическом благополучии в Пермской области в 2001г. ";
областная целевая программа "Медико-экологическая реабилитация территорий и населения Пермской области на 1998-2000 гг." (утв. Постановлением Администрации Пермской области от 13.03.1998 г.);
областная целевая программа "Охрана окружающей среды Пермской области на 2001-2005 гг." (утв. решением Законодательного собрания Пермской области № 1639-263 от 12.07.2001 г.);
"Ежегодный доклад о состоянии и охране окружающей среды в Пермской области" за 2000, 2001, 2002,2003 гг.;
концепция "Разработка и реализация системы обеспечения экологической безопасности детского населения Пермской области на 2001-2005гг." (утв. решением Госкомэкологии Пермской области от 26.12.2000 г.);
Сборник методических указаний по определению химических соединений в биологических средах, включающий:
газохроматографический метод количественного определения ацетона в биосредах (моча): МУК 4.1.763-99;
газохроматографический метод количественного определения предельных (гексан, гептан) и ароматических (бензол, толуол, этилбензол, о-, м-, п-ксилол) углеводородов в биосредах (моча): МУК 4.1.764-99;
газохроматографический метод количественного определения ароматических (бензол, толуол, этилбензол, о-, м-, п-ксилол) углеводородов в биосредах (кровь): МУК 4.1.765-99;
газохроматографический метод количественного определения ароматических аминосоединений (анилин, Н-метиланилин, о-толуидин, N,N-диметиланилин, N-этиланилин, ^Ы-диэтиланилин) в биосредах (моча): МУК 4.1.766-99;
газохроматографический метод количественного определения ароматических аминосоединений (анилин, ^-метиланилин, о-толуидин, N,N-диметиланилин, N-этиланилин, ^№диэтиланилин) в биосредах (кровь): МУК 4.1.767-99;
методика количественного определения экзогенного фенола в биосредах (моча): МУК 4.1.768-99;
методика количественного определения формальдегида в моче (МУК 4.1.769-99) и в крови (МУК 4.1.770-99) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии;
методика газохроматографического определения концентраций метилового, этилового, изопропилового, пропилового, изобутилового и бутилового спиртов в моче (МУК 4.1.771-99) и в крови (МУК 4.1.772-99);
методика количественного определения ионов фтора в моче с использованием ионселективного электрода: МУК 4.1.773-99;
методика определения содержания железа, цинка, никеля в моче методом атомной абсорбции (МУК 4.1.774-99) и в желчи (МУК 4.1.775-99);
методика определения содержания железа, цинка, никеля, меди и хрома в волосах методом атомной абсорбции (МУК 4.1.776-99);
методика определения содержания цинка, никеля, меди и хрома в женском молоке методом атомной абсорбции (МУК 4.1.778-99) и в крови (МУК 4.1. 777-99);
методика определения содержания марганца, свинца в моче методом атомной абсорбции: МУК 4.1.770-99.
Основные методические приемы и особенности при выполнении исследований по определению химических соединений в биосредах
Исследование биосред человека определяется созданием надежных и эффективных методических приемов, внедрением новых аналитических способов контроля содержания химических соединений широкого спектра. Методы определения химических соединений в биосредах должны отличаться высокой селективностью, низким пределом обнаружения и высокой информативностью (надежностью) получаемых результатов при идентификации химических соединений различных классов [89,255,279].
Методические подходы при определении химических соединений в биологических средах должны быть точными, обеспечивать достоверные результаты и, вместе с тем, должны быть доступными, недорогими и индикативными. Доступность методов позволяет повысить массовость исследований и сформировать наиболее полную картину присущих данному региону элементных нарушений, баланса эссенциальных и токсических элементов [230,281].
Особенностью определения химических соединений в биосредах является малое, иногда на уровне предела определения, содержание исследуемых соединений на фоне макроколичества биологического материала сложного состава. В процессе выполнения исследований, как правило, приходится изолировать и количественно определять несколько микрограмм анализируемого компонента в присутствии относительно высоких количеств органических соединений и мешающих ионов. Кроме того, создание новых высокочувствительных методов требует привлечения стандартизированных референтных материалов для адекватной оценки полученных результатов [42,346,361,415].
Разработка методов определения химических соединений в биосредах связана с отработкой специальных приемов, позволяющих повысить чувствительность и произвести эффективное выделение определяемого соединения. Прежде чем приступить к обнаружению и количественному определению химических соединений, необходимо выделить их из биоматериала, пользуясь специальными приемами пробоподготовки. Эти приемы основаны на различных способах концентрирования анализируемых соединений [61,91,133].
В зависимости от уровней содержания и физико-химических свойств определяемых веществ, при разработке методов определения химических соединений в биосредах используют такие общепринятые способы концентрирования как отгонка, дистилляция, экстракция в системе жидкость-жидкость, сорбция, дериватизация (получение производных анализируемых соединений), анализ равновесной паровой фазы (АРПФ) [61,133,264].
Методы отгонки и дистилляции, как правило, используются для отделения достаточно летучих соединений, таких как, фенол, формальдегид, метиловый и этиловый спирты, хлороформ, ацетон, хлорфенол, хлорбензол и др. соединений [61,133,250].
В общем виде метод отгонки из раствора используется для группового выделения и концентрирования, он не обладает достаточной селективностью и универсальностью, чтобы его использовать для разделения сложных смесей веществ на индивидуальные компоненты. Основная область применения метода - групповое выделение и концентрирование по отношению к матричным компонентам. Причем, в отличие, например, от осаждения, метод отгонки является более эффективным с точки зрения минимального объема концентрата и отсутствия неконтролируемых потерь при выделении из раствора матричных компонентов [168].
На сегодняшний день одним из наиболее распространенных и часто применяемых в практических исследованиях методов разделения и концентрирования химических соединений в биосредах является метод экстракции. Этот метод наиболее часто применяется для количественного определения экстракционно-фотометрическими или экстракционно-хроматографическими методами. Как известно, в общем виде, экстракция -это процесс извлечения растворителями соответствующих веществ из различных объектов [168].
Степень изолирования исследуемых веществ из биологического материала зависит от растворимости извлекаемых веществ в экстрагенте, структуры (пористости) биологического материала, проникающей способности экстрагентов в клетки и ткани биологического материала, степени его измельчения, интенсивности перемешивания смеси измельченного биологического материала и экстрагента, кратности настаивания биологического материала с экстрагентом, температуры, рН среды и ряда других факторов. Для расчета количества вещества, которое экстрагируется органическими растворителями, при разработке и реализации метода необходимо знать степень экстракции для определяемого вещества из исследуемой биосреды [133].
Методические особенности определения формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в биосредах (кровь, моча)
Определение ацетона в биосредах, описанное в литературе и используемое в настоящее время в практике судебно-медицинской экспертизы, основано на газохроматографическом определении с использованием детектора ионизации в пламени. Вместе с тем, следует отметить недостаточно высокую чувствительность метода, предел определения составляет 32 мг/дм в анализируемом объеме - 5 см . Метод с такой чувствительностью не может быть использован, например, для определения ацетона в биосредах детей при проведении диагностических исследований и оценки уровня антропогенной нагрузки [250].
Для расширения возможности использования этого метода, в целях оптимизации методики был подобран оптимальный режим проведения хроматографического анализа на газовом хроматографе "Цвет-500М" с детектором ионизации в пламени на хроматографической колонке длиной З м из кварцевого стекла. Эффективное разделение ацетона было достигнуто при использовании в качестве твердого носителя полисорба-1 с нанесенной на него неподвижной жидкой фазой ПЭГ- 1540 в количестве 5%. Кроме того, для определения ацетона был выбран оптимальный режим температуры термостата колонок, испарителя и детектора при скорости гелия, используемого в качестве газа-носителя, равной 30 см /мин, расходе водорода, используемом для питания детектора, равном 30 см3/мин, расходе воздуха-300 см /мин (табл. 3.4.1, рис. 3.4.1).
В качестве способа пробоподготовки наиболее оптимальный результат получен при использовании метода анализа равновесной паровой фазы над исследуемым биоматериалом (кровь, моча). Для извлечения ацетона из биологического материала 5 см3 пробы биосреды помещали в герметичный сосуд с резиновой пробкой и навинчивающейся крышкой. В пробу анализируемой крови добавляли 2 см 10%-ного раствора щавелевой кислоты рН=2,0. Сосуд термостатировали на кипящей водяной бане. : пик 1 - ацетон, пик 2 - не идентифицирован
Для определения времени установления равновесного давления паров ацетона над жидкой фазой, было проведено термостатирование стандартных растворов ацетона в крови и моче от 1 до 10 минут. Из установленной экспериментально зависимости концентрации ацетона в паровой фазе от времени термостатирования при 96 С определили оптимальное время термостатирования пробы биосреды, равное 5 минутам.
Модифицированная таким образом методика определения ацетона в биосредах (кровь, моча) позволяет определять 0,05 мкг ацетона в анализируемом объеме пробы. Максимальная погрешность определения ацетона в крови составила 22,97%, в моче 16,5%.
Методические указания по определению ацетона в биосредах приведены в МУК 4.1.763-99 [169].
Для определения микроколичеств предельных альдегидов в биосредах на фоне сложного состава биологической матрицы, содержащей большое число примесей, наиболее целесообразно использовать метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, с помощью которого возможно селективное разделение и анализ карбонильных соединений.
Как известно из практики санитарно-химического анализа объектов окружающей среды [90, 131, 190, 420], для определения формальдегида используется специфическая реакция взаимодействия 2,4-динитрофенилгидразина с карбонильной группой. На этом основании была изучена возможность применения данной реакции для определения формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в моче и крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
В процессе разработки метода, во-первых, были изучены условия количественного превращения формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в 2,4-динитрофенилгидразоны соответствующих альдегидов на фоне сложной матрицы исследуемой биосреды. Опытным путем были подобраны оптимальные объемы реагирующих соединений и отработаны условия проведения реакции, заключающиеся в том, что 2,5 см 0,2%-ного раствора 2.4-динитрофенилгидразина добавляли в 50 см мочи и 2,0 см3 в пробу крови объемом 2,0 см3, разбавленную до 40 см3 бидистиллированной водой, поскольку реакция образования гидразонов протекает в кислой среде, в исследуемые растворы добавляли по 1-2 капли концентрированной соляной кислоты.
Извлечение 2,4-динитрофенилгидразонов альдегидов из анализируемой среды проводится методом экстракции. Для выбора наиболее подходящего растворителя-экстрагента была изучена степень экстракции 2,4-динитрофенилгидразонов альдегидов различными растворителями. Степень экстракции определяли по соотношению площадей хроматографических пиков стандартных растворов 2,4-динитрофенилгидразонов альдегидов до и после экстракции.
Обоснованием способа определения марганца, свинца, цинка, никеля, меди, хрома, кадмия, железа в моче, желчи, желудочном соке (прямая элементометрия)
При использовании метода атомно-абсорбционной спектрофотометрии в режиме пламенной атомизации для количественного определения содержания изучаемых металлов в биосредах, как правило, наиболее важным этапом является извлечение определяемых элементов из исследуемого биологического материала и перевод в анализируемый раствор.
Перевод пробы в анализируемый раствор позволяет создать более благоприятные условия для дальнейшей элементометрии определяемых соединений, поскольку биопробы мочи, желчи и желудочного сока имеют многокомпонентный состав, основу которого составляет большое количество белковых фракций, а также ряд неорганических соединений как в макро- так и в микроколичествах, что обуславливает наличие эффекта матрицы при определении исследуемых элементов [284,291].
Вместе с тем, для некоторых типов биосред, являющихся жидкими средами, возможен вариант прямого определения, поскольку он позволяет проводить элементометрию для всех исследуемых металлов из одной пробы, минуя стадию предварительного перевода биологического материала в анализируемый раствор, что существенно сокращает время анализа, однако, с другой стороны это делает необходимым проведение оценки матричного эффекта для исследуемой биосреды при установлении характеристической концентрации для каждого элемента.
В соответствии с изложенным, были разработаны способы прямого атомно-абсорбционного определения марганца, свинца, меди, хрома, кадмия, никеля, железа, цинка в моче, желчи, желудочном соке.
Для оценки точности определения элемента в пробе, имеющей многокомпонентный состав, использовали метод добавок, позволяющий достичь более точного количественного определения, и определить влияние матричной основы на аналитический сигнал. Для этого проведен сравнительный анализ калибровочных кривых, построенных на водных стандартных образцах и калибровочных кривых, построенных методом добавок определенных количеств определяемого элемента в анализируемую пробу. Полученные при этом графики были не параллельны, что обусловлено наличием эффекта матрицы и приводит к погрешности анализа.
В частности, на рисунке 4.1.1.1 показаны градуировочные графики, построенные для определения содержания свинца в моче с использованием водных стандартных образцов (yi=0,0168xi+0,007), и график, построенный по методу добавок на основе мочи (у=0,015х+0,0002). Разница полученных величин Сі и Сг по аналитическому сигналу Dj по двум градуировочным графикам в данном случае не превышает 18,7%
На рисунке 4.1.1.2 и в таблице 4.1.1.1 представлен расчет концентрации марганца в биопробах мочи и желчи по градуировочным графикам, построенным на водных растворах стандартных образцов, и на основе биопроб (моча, желчь) методом добавок. В данном примере максимальная погрешность определения марганца в моче 19,2%, в желчи - 19,2%.
Разработанные методы позволяют проводить определение марганца, свинца, никеля, меди, хрома, железа, цинка, кадмия в моче, желчи, желудочном соке методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии с пламенной атомизацией прямым способом в предложенных выше диапазонах для каждого ингредиента с погрешностью определения для мочи - 19,5%, желчи - 19,3%, желудочного сока- 18,7%, что подтверждает способ оценки матричного эффекта.
Разработанные методы приведены в методических указаниях по определению химических соединений в биологических средах [169].
Для таких типов биосред, как кровь и волосы, в отличие от мочи, желчи и желудочного сока, метод прямой элементометрии с использованием пламенного варианта атомно-абсорбционного анализа невозможен. В этом случае наиболее оптимальным вариантом является извлечение и перевод исследуемых элементов из биологического материала в анализируемый раствор.
Для количественного определения элементов в биопробе необходимо выбрать оптимальный способ перевода биоматериала в анализируемый раствор. При этом анализируемый раствор должен отвечать следующим требованиям: - отсутствие твердых или взвешенных частиц (элемент определяется в жидкой фазе); - уровень содержания исследуемых ингредиентов должен находиться в диапазоне определяемых концентраций для достоверного их количественного определения; - минимальное влияние матричной основы при проведении элементометрии.
Для перевода биопроб волос и крови в анализируемый раствор используют разложение биоматериала либо сильными неорганическими окислителями (кислотная минерализация), либо воздействием высоких температур (термическое озоление). Эти методические приемы не являются универсальными для всех исследуемых в атомной абсорбции элементов и отличаются каждый своими преимуществами для одних элементов и недостатками для других.
В целях оптимизации элементометрии были рассмотрены способы разложения биоматериала: кислотной минерализацией (с использованием сильных неорганических окислителей - концентрированной HNO3 и концентрированной Н2Ог); термическим озолением (450-500С); различным сочетанием способов термического разложения и кислотной минерализации.
Для перевода проб волос в анализируемый раствор использовали способ кислотной минерализации, для разложения биоматериала использовали смесь концентрированной азотной кислоты и перекиси водорода.
Объем биологического материала выбран, с одной стороны, с учетом поэлементного диапазона концентраций определяемых металлов, с другой стороны, с учетом необходимости использования минимального объема биоматериала для анализа.
В ходе исследований обоснован выбор оптимального соотношения окислителей, необходимых для полного растворения биопробы НЫОз .НгОг -3:1, объем окислителей при этом составил 8 см3.
Выбор контрольной территории
Группы детей, проживающих на экологически благополучных территориях, не подверженных антропогенному воздействию, выбранных в соответствии с требованиями, изложенными в разделах 5.1.1, 5.1.2, обследовались на содержание химических соединений в биологических средах (кровь, моча, волосы, желчь, желудочный сок).
Исследование биосред детей на содержание химических соединений проводилось в соответствии с МУК 4.1.763-4.1.779-99, «Определение химических соединений в биологических средах», Минздрав России, Москва, 2000 [169].
Использование вновь разработанных методов определения химических соединений в биологических средах требует обязательной ссылки на используемый метод, который в свою очередь должен соответствовать всем требованиям по метрологическим характеристикам и нормативам точности (правильности и прецизионности) методов и результатов измерений, изложенным в ГОСТ Р ИСО 5725-(1-6) - 2002.
Результаты исследования биосред групп детей, отобранных и проанализированных в соответствии п.п. 5.1.1, 5.1.2, 5.1.3 подвергались статистической обработке с целью определения фоновых уровней содержания химических соединений в биосредах [69].
При обработке данных по установлению фоновых уровней содержания исследуемых соединений в биосредах детей Пермского региона использовали методы параметрического статистического анализа. Поскольку полученные данные характеризовались большим размахом абсолютных величин, был проведен анализ характера статистического распределения определяемых соединений в изучаемых биологических средах.
На основании анализа распределения, во-первых, из всей выборки выделялись резко отличающиеся от остальных значения - так называемые «выбросы», посредством построения и анализа гистограмм частот. Во-вторых, поскольку контрольные группы отбирались с различных территорий, перед расчетом фоновых уровней проверялась гипотеза об отсутствии влияния территориального фактора на содержание определяемых соединений в биосредах. Для этого использовали однофакторный дисперсионный анализ, который основывается на сравнении внутригрупповых и межгрупповых дисперсий.
Оценка характера распределения показателей выполнялась с помощью критерия согласия Пирсона - % [69].
В ходе анализа выяснилось, что статистическое распределение концентраций всех изучаемых соединений в исследуемых средах соответствует или приближено к закону нормального распределения.
После выполнения процедуры подготовки данных для статистической обработки, анализа распределений, устранения резко отличающихся измерений, так называемых «выбросов», проверки гипотезы о нормальности распределения показателей выполняли расчет фоновых уровней.
При расчете фоновых уровней следует сформулировать следующие утверждения: 1. Показатель, характеризующий фоновый уровень содержания вещества в организме, всегда распределен по закону нормального распределения. 2. Фоновый уровень содержания определенного вещества в организме задается некоторым интервалом, имеющим нижнюю и верхнюю границы. 3. Нижняя граница фонового интервала не может быть меньше нуля.
При разработке и рекомендации использования фоновых уровней широкого спектра соединений, относящихся к различным классам химических соединений, следует выделить ряд элементов, таких как металлы, которые относятся к макро- или микроэлементам и всегда присутствуют в биосредах человека в определенных концентрациях [6, 37, 137,151,230,366,398].
Кроме того, среди широкого спектра соединений, определяемых в биосредах человека, следует выделить группу синтетических химических веществ, которые в обычных условиях в биосредах не присутствуют, а определяются в биосредах только в случае присутствия антропогенного источника воздействия. Среди исследуемых в данной работе соединений это - бензол, толуол, о-, м,- п-ксилол, этилбензол, стирол, ароматические амины [88,193,329,351,384,403].
