Введение к работе
Актуальность проблемы. Обеспечение эпидемической безопасности водопользования в отношении кишечных инфекций, распространяющихся водным путем, является первостепенной задачей микробиологического контроля качества воды. Надежность системы контроля, как основы профилактических мероприятий, обусловлена научно-обоснованными показателями и эффективными методами обнаружения и количественного учета возбудителей кишечных инфекций и их индикаторов (Рахманин Ю.А. и др,.2006;.Недачин А.Е. и др.,2007; Рахманин Ю.А., 2009).
Вместе с тем, до настоящего времени отмечаются вспышки кишечных инфекций при соответствии качества воды установленным требованиям (Недачин А.Е. и др.,2002, 2005; Сгаип G.F. at al. 2002). Это может быть связано с появлением устойчивых штаммов патогенных бактерий, их способностью к размножению, в частности сальмонелл, в чистых водах, и как результат - с нарушением количественных соотношений индикаторных и патогенных бактерий {Гинсбург А.Л. и др., J999). Поэтому требуется совершенствование существующей нормативно-методической базы в направлении повышения адекватности оценки эпидемической безопасности водопользования.
В этом направлении, а также с целью унификации с международным сообществом, в последние годы происходит пересмотр нормативных требований к качеству воды по бактериологическим показателям, что определяет необходимость разработки и стандартизации методов определения бактериологических показателей: колиформные бактерии и глюкозоположительные колиформные бактерии, как основные надежные индикаторные показатели эпидемической опасности водопользования; E.coli, как показатель фекального загрязнения водных объектов.
Методы, утвержденные в МУК 4.2.1018-01, по ряду параметров не отвечают современному уровню: длительные сроки анализа (2-3 суток); низкая воспроизводимость результатов из-за субъективной выборки колоний; отсутствие учета изменчивости культуральных и биохимических свойств бактерий. Аналогичные проблемы существуют и в международных методических документах (ИСО 9308-1:2000). Кроме того, низкое качество выпускаемых отечественными производителями питательных сред требует разработки способов повышения их
чувствительности, ростовых качеств, дифференцирующих свойств в целях увеличения надежности бактериологического анализа.
Перспектива разработки ускоренных методов определения колиформных бактерий заключается в использовании на этапе идентификации специфичности их ферментативных свойств (RompreA., 2002). Отсутствие фермента цитохромоксидазы у представителей семейства Enterobacteriaceae дает возможность их надежной дифференциации с посторонней водной оксидазоположительной микрофлорой. Однако, представление о бактерицидносте оксидазных реактивов препятствует эффективному внедрению в методические документы экспрессного теста определения оксидазной активности бактерий непосредственно на мембранном фильтре. Разработка ускоренных методов определения Е. coli может быть основана на наличии у этих бактерий специфических ферментов - глюкуронидазы и триптофаназы.
Метод определения спор Clostridium perfringens, предложенный в Директиве 98/83/ЕС, сложен в выполнении, требует наличия анаэростата, делает методику малопригодной для выполнения рутинных анализов практическими лабораториями, в связи с чем возникает необходимость совершенствования метода выделения спор сульфитредуцирующих клостридий для повышения эффективности обнаружения анаэрбных бактерий в условиях обычного термостатирования.
Разработка в настоящее время новых средств обеззараживания воды ставит задачу увеличения надежности оценки их эффективности с учетом изменения биологических свойств микроорганизмов, на которых основаны методы их индикации (Ситщына О.О. и др., 2008, Артемова Т.З. и др., 2010). Основная проблема связана с возникновением стрессированных форм бактерий после недостаточно эффективного обеззараживания, которые не определяются общепринятыми методами, и контролирующие органы не получают достоверную информацию о безопасности воды. В дальнейшем при благоприятных условиях происходит реактивация - восстановление жизнеспособности стрессированных бактерий, что создает возможность эпидемических осложнений {Талаева Ю.Г. 1979; Павлова И.Б. и др., 2004).
На основании вышеизложенного целью работы являлась разработка методических приемов повышения гигиенической надежности санитарно-бактериологических методов анализа воды с учетом ферментативных и
культуральных свойств бактерий, а также их способности к реактивации после обеззараживания воды.
Задачи исследования: 1.Обосновать параметры экспрессного теста определения оксидазной активности и разработать на его основе ускоренные методы индикации колиформных бактерий в воде.
2.Модифицировать ускоренные методы определения Е. coli, основанные на специфичности ферментативной активности бактерий.
3.Усовершенствовать метод индикации спор сульфитредуцирующих клостридий в воде в условиях обычного термостатирования.
4.Разработать методические приемы повышения гигиенической надежности оценки эффективности процессов обеззараживания воды. Научная новизна работы.
Впервые установлены количественные зависимости степени ингибирования ферментативных реакций колиформных бактерий от типа оксидазного реагента, используемого в экспрессном тесте определения оксидазной активности, продолжительности контакта бактерий с ним, а также длительности последующего пребывания на питательной среде.
Впервые выявлена зависимость способности бактерий к реактивации после обеззараживания воды от вида и дозы реагента, времени экспозиции.
Обоснована необходимость учета индикаторных и патогенных бактерий с измененными культуральными и биохимическими свойствами для повышения гигиенической надежности оценки обеззараживания воды. Определены признаки, характеризующие изменчивость Е. coli, сальмонелл, энтерококков, стафилококков. Практическая значимость.
На основании экспериментальных и натурных исследований оптимизирована система санитарно-бактериологического контроля качества воды различного вида водопользования в направлении повышения её эпидемической надежности.
Разработан ускоренный метод индикации в воде основных нормируемых показателей - колиформных бактерий на основе совершенствования экспрессного теста определения оксидазной активности. Метод позволяет получать ответ через 18 - 24 часа (вместо 2-3 суток), а также эффективные и экономичные ускоренные методы определения колиформных бактерий, Е. coli и спор сульфитредуцирующих
клостридий с использованием отечественных питательных сред. Эти методы включены, наряду с международными, в ГОСТ Р 52426 - 2005 «Вода питьевая. Обнаружение и количественный учет Escherichia coli и колиформных бактерий. Часть I. Метод мембранной фильтрации» (справка № 343-05 от 07.02.2007).
Материалы диссертационной работы использованы при подготовке проекта МУ «Санитарно-эпидемиологическая экспертиза средств дезинфекции воды» (справка №.11-5/279 от 12.05.2009).
Результаты диссертационной работы включены в программу циклов повышения квалификации, проведенных в 2006 - 2009 гг. для специалистов бактериологических лабораторий Роспотребнадзора и Водоканалов РФ по обучению методам санитарно-микробиологического контроля качества воды различного назначения. (Акт № 01-6/274 от 12.05.2010).
Работа выполнена в лаборатории санитарной микробиологии и паразитологии НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН в рамках плановых тем № г/р 0120.0502725, НИР 098, а также при финансовой поддержке Правительства Москвы.
Апробация материалов диссертации. Результаты исследований доложены и обсуждены на: II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (г. Рязань,29 мая-1 июня 2007 г); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 75-летию Научно-исследовательского института дезинфектологии Роспотребнадзора (г. Москва, 22-23 мая 2008 г); Втором Санкт-Петербургском международном экологическом форуме «ЭкоФорум-2008» (Санкт-Петербург, 2008 г); Пленуме научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ «Методологические проблемы изучения, оценки и регламентирования биологических факторов в гигиене окружающей среды»(г. Москва, 16-17 декабря 2009 г).
Основные положения, выносимые на защиту: 1. Зависимость степени ингибирования ферментативных реакций колиформных бактерий от типа оксидазного реагента, используемого в экспрессном тесте определения оксидазнои активности. Методические приемы по устранению негативного влияния диметил-п-фенилендиамина дигидрохлорида с а-нафтолом.
-
Модификация методов определения колиформных бактерий, Е. coli, спор сульфитредуцирующих клостридий в воде с учетом специфичности их ферментативной активности и культуральных свойств.
-
Методические подходы для адекватной оценки эффективности обеззараживания воды с учетом реактивации и изменчивости свойств индикаторных и патогенных бактерий.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 3 в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 214 страницах компьютерной верстки и состоит из введения, обзора литературы, методов исследования, 7 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и 16 приложений. Диссертация иллюстрирована 21 таблицей, 20 рисунками. Библиографический указатель включает 262 источника, из них 113 иностранных авторов.
