Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Нарушение рецептивности эндометрия как причина репродуктивных неудач (литературный обзор) 23
1.1 Проблема бесплодного брака. Маточный фактор бесплодия в генезе репродуктивных проблем 23
1.2 Условия успешной имплантации эмбриона 24
1.3 Факторы, определяющие рецептивность эндометрия 25
1.4 Гормональная регуляция рецептивности эндометрия 27
1.5 Молекулярные маркёры паракринной регуляции рецептивности эндометрия 29
1.6 Современные представления о терапии «тонкого» эндометрия 39
1.7 Ультразвуковое кавитационное орошение полости матки в восстановлении эндометрия при его заболеваниях 43
Глава 2. Клиническая характеристика пациенток групп наблюдения .48
Глава 3. Морфофункциональное состояние эндометрия у пациенток с репродуктивными неудачами, обусловленными гипоплазией эндометрия 65
3.1 Морфологическая картина «тонкого» эндометрия у пациенток с маточной формой бесплодия и невынашиванием беременности 65
3.2 Результаты ультраструктурного исследования «тонкого» эндометрия у пациенток с маточной формой бесплодия и невынашиванием беременности 69
3.3 Результаты иммуногистохимического исследования эндометрия в предполагаемое «окно имплантации» .72
Глава 4. Эффективность комплексного лечения пациенток с бесплодием и невынашиванием беременности, ассоциированными с «тонким» эндометрием . 81
4.1 Клиническая динамика заболевания на фоне различных методов лечения «тонкого» эндометрия 81
4.2 Динамика ультразвуковой картины эндометрия на фоне методов лечения 87
4.3 Динамика показателей морфологической структуры эндометрия на фоне проводимого лечения .90
4.4 Ультраструктурная характеристика эндометрия в динамике проведенной терапии .95
4.5 Иммуногистохимическая картина показателей рецептивности эндометрия в динамике комплексной терапии 99
4.6 Состояние микробиоты репродуктивного тракта после комплексной терапии 109
4.7 Репродуктивные исходы стандартной и комплексной терапии .114
Глава 5. Обсуждение полученных результатов 119
Заключение 140
Выводы 140
Практические рекомендации 142
Список сокращений 145
Список литературы 147
- Молекулярные маркёры паракринной регуляции рецептивности эндометрия
- Морфологическая картина «тонкого» эндометрия у пациенток с маточной формой бесплодия и невынашиванием беременности
- Клиническая динамика заболевания на фоне различных методов лечения «тонкого» эндометрия
- Репродуктивные исходы стандартной и комплексной терапии
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Частота бесплодных браков в Российской Федерации составляет 10-15% по обращаемости, а с учетом активного выявления достигает 30% (Байбарина Е.Н., 2015; Радзинский В.Е., 2017).
Остается стабильно высокой частота самопроизвольного прерывания беременности в России – от 15 до 23% всех зарегистрированных беременностей, при этом около 50% выкидышей приходится на долю привычного невынашивания беременности (Статистический сборник «Здравоохранение в России», 2015).
Маточный фактор лидирует в структуре непреодолённых причин бесплодия. Отсутствие полноценной имплантации при переносе эмбрионов хорошего качества составляет до 70% причин неудач в программах ВРТ (Edwards RG, 2006; Боярский К.Ю., Гайдуков С.Н., 2013).
Актуальной проблемой является отсутствие единых клинических протоколов лечения заболеваний эндометрия, связанных с нарушением его рецептивности. Описанные в литературе способы воздействия на рецептивность эндометрия разрозненны, имеют низкую доказательную базу (Прегравидарная подготовка: клинический протокол / Под ред. В.Е. Радзинский и др. — М.: Status Praesens, 2016).
Эффективность гормональной терапии «тонкого» эндометрия недостаточна: 52,2% (смешанная группа пациенток с тонким эндометрием как в сочетании с НЛФ, так и в циклах ЭКО) (Радзинский В.Е., Ордиянц И.М., Побединская О.С., 2015) и 49,3% (пациентки с тонким эндометрием) (Межевитинова Е.А., 2016).
В многочисленных экспериментах показано, что низкочастотный ультразвук обладает потенциально важным эффектом воздействия на функциональную активность эпителиальных клеток, который может заметно влиять на восстановление тканей и процессы регенерации в естественных условиях (Сухих Г.Т., 2010; Антушева Т.И., 2013; Богданова А.М., 2017).
Степень ее разработанности. Трудности медикаментозного лечения больных с гипоплазией эндометрия обусловили поиск новых технологий и возможностей лечения данной патологии (Кузнецова И.В., 2015; Применение эстрогенов в программах ВРТ: научно-практические рекомендации РАРЧ, 2015; Радзинский В.Е., 2017). Низкая эффективность имеющихся на сегодняшний день лечебных мероприятий объясняется отсутствием конкретных этиологических факторов и понимания патогенетических механизмов.
Имеются единичные исследования, посвященные улучшению рецептивности эндометрия у пациенток с неразвивающейся беременностью с использованием ультразвукового кавитационного орошения полости матки (Мелкозерова О.А., Башмакова Н.В., Погорелко Д.В., Чистякова Г.Н., 2015), применения метода в постабортной реабилитации (Плотко Е.Э.,
Ворошилина Е.С., 2014), при послеродовом эндометрите (Подолян О.Ф., Царегородцева М.В., 2015), что позволяет предположить его эффективность и в лечении заболеваний, обусловленных гипоплазией эндометрия.
Основной терапией гипопластических процессов эндометрия является назначение препаратов эстрогенов, в том числе и с применением альтернативных путей их доставки (трансдермальный и вагинальный) (Берестовой O.A.; 2012; Allahbadia G.A.,2012; Громова О.А.; 2013; Shao R., 2014). В литературе представлены данные о том, что аспирин в малых дозах (80 мг/сутки) может достоверно повышать частоту успешных имплантаций (Weckstein L. N., 1997). Некоторые авторы указывают на увеличение кровотока в сосудах матки у пациенток с необъяснимым бесплодием при терапии 100 мг аспирина, начиная с 3 дня менструального цикла (Алиева, К.У., 2011; Волкова Е.Ю., 2014). Для лечения пациенток с повторными импланационными неудачами использовали вагинальный силденафил цитрат. Предполагалось, что силденафил способен увеличить частоту имплантации за счет усиления кровоснабжения эндометрия (Sher G., 2002; Zinger М, 2006). Имеются исследования об успешном внутриматочном применении растворов колониестимулирующего гранулоцитарного фактора (GCF). По имеющимся на сегодняшний день данным, Г-КСФ повышает концентрацию в эндометрии тромбоцитарного фактора роста эндотелиальных клеток, играющего ключевую роль в стимуляции ангиогенеза (Ziebe S.A, 2013). В работе Н.Г. Грищенко доказана эффективность внутриматочного введения оксида азота с целью оптимизации подготовки пациенток с ранее безуспешными программами ЭКО на фоне «тонкого» эндометрия (Грищенко Н.Г., 2012).
Наше внимание привлекла возможность использования орошения полости матки растворами, кавитированными ультразвуком низкой частоты, учитывая большой спектр его биологического и физического лечебного воздействия. Метод основан на потенции ультразвуковых колебаний в жидкостных средах (Милованов А.П., 2010; Радзинский В.Е., 2017).
Указанные эффекты низкочастотного ультразвука и накопленный опыт использования данного метода определил наш научный интерес в изучении возможностей применения энергии низкочастотного ультразвука с целью восстановления рецепторного аппарата эндометрия у пациенток с маточной формой бесплодия и невынашиванием беременности.
Цель исследования: улучшить исходы лечения пациенток с маточной формой бесплодия и невынашиванием беременности, обусловленными «тонким» эндометрием.
Задачи исследования:
1. Определить клинико-анамнестические особенности пациенток, страдающих маточной формой бесплодия и невынашиванием беременности, обусловленными «тонким» эндометрием.
2. Изучить морфофункциональное состояние эндометрия у пациенток с
репродуктивными неудачами, ассоциированными с «тонким» эндометрием.
3. Оценить эффективность в составе комплексного лечения низкочастотного
ультразвукового орошения полости матки у пациенток с бесплодием и невынашиванием
беременности, обусловленными «тонким» эндометрием, в отношении улучшения его
рецептивности.
4. Исследовать репродуктивные исходы у пациенток с репродуктивными неудачами,
обусловленными «тонким» эндометрием, после комплексного лечения с использованием
низкочастотного ультразвукового орошения полости матки.
Научная новизна. Разработана новая научная идея, значительно обогащающая
современную концепцию преодоления репродуктивных неудач и восстановления
рецептивности эндометрия у пациенток с гипоплазией эндометрия.
Выявлена зависимость маркёров рецептивности эндометрия и ангиогенеза от вида нарушения репродуктивной функции, обусловленной гипоплазией эндометрия.
Изучены эффекты кавитированных растворов в отношении восстановления морфологической и ультраструктурной картины «тонкого» эндометрия.
Доказан эффект низкочастотного ультразвука в отношении восстановления показателей рецептивности эндометрия у пациенток с репродуктивными неудачами, который заключается в увеличении уровней экспрессии маркёров ангиогенеза, фактора, ингибирующего лейкемию, рецепторов к прогестерону в строме эндометрия и снижении маркёров хронического эндометрита на фоне нормализации показателей локального иммунитета в эндометрии.
Определены маркёры рецептивности эндометрия, определяющие его имплантационный потенциал: наличие зрелых пиноподий, фактор, ингибирующий лейкемию, маркёры ангиогенеза - CD34, VEGF A.
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость исследования обоснована тем, что на основании полученных данных существенно расширены представления о патогенезе «тонкого» эндометрия и его роли в нарушении репродуктивной функции. Применительно к проблематике диссертации результативно использован комплекс современных высокоинформативных методов исследования. Разработан и научно обоснован комплексный подход к восстановлению рецептивности эндометрия при маточной форме бесплодия и невынашивании беременности, который включает циклическую гормональную терапию и низкочастотное ультразвуковое орошение полости матки кавитированными растворами. Доказана перспективность его использования в клинической практике.
Практическая значимость полученных результатов исследования заключается в том, что предложенный комплекс лечебных мероприятий с использованием циклической гормональной
терапии и низкочастотного ультразвукового орошения полости матки кавитированными растворами при маточной форме бесплодия и невынашивании беременности, обусловленных «тонким» эндометрием, позволяет в 2,2 раза повысить эффективность восстановления морфофункционального состояния эндометрия (p<0,05), избежать использования ВРТ у 76,47% пациенток с бесплодием и у 80,00% пациенток с невынашиванием (p<0,05), способствует восстановлению репродуктивной функции у 73,91% пациенток с бесплодием и у 79,55% пациенток с невынашиванием беременности, завершению у них беременности срочными родами соответственно в 88,24% и в 85,71% наблюдений (p<0,05).
Методология и методы исследования. Исследование проведено на базе
гинекологического отделения ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт охраны
материнства и младенчества» Минздрава России с 2015 по 2017 г. Проведено проспективное
когортное рандомизированое контролируемое исследование. Пациентки были
рандомизированы слепым методом. Для решения поставленных задач в нашем исследовании все женщины с бесплодием и привычным невынашиванием были разделены на две когорты.
В исследование были включены 144 пациентки. Дизайн исследования представлен на рисунке 1. Первую когорту составили 90 пациенток с бесплодием и невынашиванием беременности, обусловленными гипоплазией эндометрия, в лечении которых использовали комплексную программу, включающую циклическую гормональную терапию и применение ультразвукового орошения полости матки кавитироваными растворами. Из них 46 пациенток с бесплодием, обусловленным гипоплазией эндометрия (первая группа) и 44 пациентки с невынашиванием беременности, обусловленным гипоплазией эндометрия (вторая группа).
Вторую когорту составили 26 пациенток с бесплодием и невынашиванием беременности, обусловленными гипоплазией эндометрия, в лечении которых использовалась стандартная схема, включающая применение циклической гормональной терапии.
Контрольную группу составили 28 фертильных, условно здоровых пациенток репродуктивного возраста, у которых не было гинекологических заболеваний, были в анамнезе срочные роды, овуляторный цикл и не было случаев невынашивания беременности. Контрольной группе пациенток не применялось ни одного из видов лечения.
Критерии включения: женщины репродуктивного возраста 18-45 лет, невынашивание беременности в анамнезе (один и более самопроизвольный выкидыш, и регрессирующая беременность), маточная форма бесплодия, обусловленная гипоплазией эндометрия, гипоплазия эндометрия (М-ЭХО на 20-22 день менструального цикла менее 8 мм), овуляторный цикл, нормокоагуляция.
I КОГОРТА: Комплексная терапия
Контрольная КОГОРТА
II КОГОРТА: Стандартная терапия
Первая группа:
Женщины с бесплодием
и «тонким» эндометрием
n=46
Вторая группа:
Женщины с
невынашиванием и
«тонким» эндометрием
n=44
Здоровые
небеременные
женщины
n=28
Женщины с бесплодием и
невынашиванием
беременности,
получавшие, циклическую
гормональную терапию
n=26
Иммуноферментный анализ, УЗИ органов малого таза на ЛГ7+ день менструального цикла с оценкой М-ЭХО
УЗИ органов малого
таза на ЛГ7+ день
цикла с оценкой
М-ЭХО
На ЛГ7+ день менструального цикла - pipelle-биопсия эндометрия
Гистологическое и иммуногистохимическое исследование, исследование пиноподий методом сканирующей электронной
микроскопии
(Вторая группа)
(Первая группа)
Циклическая гормональная
терапия + низкочастотное
ультразвуковое орошение
полости матки
Циклическая гормональная терапия (Стандартная терапия)
Циклическая гормональная
терапия + низкочастотное
ультразвуковое орошение
полости матки
УЗИ на ЛГ7+ день менструального цикла с оценкой М-ЭХО
На ЛГ7+ день менструального цикла - pipelle-биопсия эндометрия
Гистологическое и иммуногистохимическое исследование,
исследование пиноподий методом сканирующей электронной микроскопии.
Рисунок 1 - Дизайн исследования
Критерии исключения: возраст более 45 лет, онкологические заболевания, тяжёлая экстрагенитальная патология, заболевания свёртывающей системы крови, бесплодие и невынашивание, не ассоциированное с гипоплазией эндометрия.
Под «тонким» понимаем эндометрий гипопластического типа, имеющий по данным ультразвукового исследования толщину М-ЭХО менее 8 мм на ЛГ7+ день менструального цикла. Диагноз хронического эндометрита устанавливали при наличии верификации в эндометрии маркёра CD138+.
Циклическая гормональная терапия проводилась по схеме: с 3 по 25 день менструального цикла назначались препараты эстрадиола 17- в дозе 1-4 мг в сутки, с 14 по 25 день дидрогестерон в дозе 20 мг в сутки.
Низкочастотное ультразвуковое орошение проводилось в первую фазу цикла на 7-9 день менструального цикла кратностью №5 процедур, курсом №3. «Озвученной» средой являлся физиологический раствор. Для проведения кавитационного орошения использовался аппарат «Фотек» АК 100-25 с усовершенствованным маточным наконечником АА 211.
С целью обоснования эффективности комплексного подхода к улучшению рецептивности эндометрия использовались общенаучные и специальные методы исследования. Изучался соматический и акушерско-гинекологический анамнез. Лабораторные методы включали микробиологическое исследование и иммуноферментный анализ.
Все пациентки были обследованы в соответствии с Приказом Минздрава России от 12 ноября 2012 г. № 572н.
Содержание маркеров функционального состояния эндотелия и регуляторов ангиогенеза
в сыворотке крови оценивали методом иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с
рекомендациями производителей наборов реагентов. Детекцию проводили на
иммуноферментных анализаторах «Wallac 1420 (Victor2)» фирмы «PerkinElmer» (Финляндия) и «Multiskan МСС/340» фирмы Labsystems (Финляндия).
Ультразвуковое исcледование проводилось на аппарате Hawk 2102 EXL Ultrasound Scanner (Denmark) с использованием мультичастичного абдоминального датчика с частотой 3,5-5 МГц 3,5 и 5МГц и вагинального датчика 7 МГц. Определялась толщина М-ЭХО, трёхслойность структуры эндометрия. Исследование проводилось на ЛГ7+ день менструального цикла.
Материалы биоптатов эндометрия для гистологического исследования фиксировали в 10% нейтральном формалине, заключали в парафин, делали срезы толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином.
Для иммуногистохимического исследования использовали двухэтапный стрептавидин-биотин-пероксидазный метод с демаскировкой антигена и применением стандартных наборов моноклональных и поликлональных антител фирмы «Bond RTU Primary» и «DAКO», США. Для визуализации первичных антител использовали безбиотиновую систему детекции Super Sensitive Polymer-HPR Detection System (Biogenex).
Экспрессию рецепторов к эстрогенам и прогестеронам оценивали по 3-балльной шкале (слабая, средняя и выраженная степени). Для анализа результатов ИГХ реакций использовали метод гистологического счета H-score по формуле: HS =1a+2b+3c, где а – % слабо окрашенных клеток, b – % умеренно окрашенных клеток, с – % сильно окрашенных клеток, 1, 2, 3 – интенсивность окрашивания, выраженная в баллах.
Экспрессию CD3 (клон LN10, США), CD20 (клон MJ1, США), CD138 (поликлональные, США), экспрессию CD34 (клон QBEnd/10, Дания) и VEGF (поликлональные, Дания), экспрессию LIF (поликлональные, США), LIFR (поликлональные, США) оценивали путем подсчета позитивных клеток в поле зрения при увеличении 400 при подсчете не менее 10 полей зрения.
Вышеописанные исследования проводились на базе Федерального государственного бюджетного учреждения «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Министерства здравоохранения Российской Федерации (директор – д.м.н., проф., заслуженный врач Р.Ф. Башмакова Н.В.)
Ультраструктурное исследование эндометрия методом сканирующей электронной микроскопии проводилось в период предполагаемого «окна имплантации» (ЛГ+7). Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме UltraCutl 11, окрашивали цитратом свинца (MiHonig, 1961) и изучали в электронном микроскопе JEM 100S. Для исследования в сканирующем электронном микроскопе часть материала после обезвоживания высушивали в критической точке возгонки углекислоты и просматривали в растровом электронном микроскопе «Hitachi-S350», Япония.
Исследование методом сканирующей электронной микроскопией проводилось совместно с «Московским государственным университетом имени М.В.Ломоносова», НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского (директор – академик РАН Скулачев В.П.).
Положения, выносимые на защиту:
1. Предпосылкой формирования «тонкого» эндометрия у женщин с маточной формой
бесплодия и невынашиванием беременности следует считать его ятрогенное механическое
повреждение, которое приводит к развитию воспалительного ответа с исходом в хронический
эндометрит (р<0,05), а в дальнейшем - в гипоплазию эндометрия.
2. Морфологическими маркёрами «тонкого» эндометрия являются дисхроноз созревания
желёз эндометрия, обеднение сосудистой сети, уплотнение стромального компонента; его
ультраструктурными маркёрами следует считать асинхронность и акселерацию созревания
пиноподий, плотные межклеточные контакты, гладкую апикальную поверхность и атипичные
клетки микроокружения; иммуногистохимическими маркёрами являются снижение экспрессии
LIF, LIF-R, CD34, VGEF A (р<0,05), увеличение экспрессии CD3+, CD20+, CD138+ в строме и железах эндометрия (р<0,05).
-
Включение в состав комплексной терапии орошения полости матки кавитированными растворами у пациенток с бесплодием и невынашиванием беременности, обусловленными «тонким» эндометрием, снижает частоту хронического эндометрита (на 80,00% в группе с бесплодием и на 76,94% в группе с невынашиванием, р<0,05), приводит к элиминации патогенной и условно-патогенной микрофлоры из половых путей (у 100% пациенток с бесплодием и у 97,72% с невынашиванием беременности), восстанавливает морфологическую структуру эндометрия и показатели его рецептивности (р<0,05).
-
Комплексный метод лечения, включающий ультразвуковое кавитационное орошение полости матки, по сравнению со стандартной терапией в 2,2 раза эффективнее способствует восстановлению рецептивности эндометрия (p<0,05) и позволяет более результативно (p<0,05) улучшить репродуктивные исходы у пациенток с бесплодием и невынашиванием беременности, обусловленными «тонким» эндометрием (самопроизвольная беременность – 76,47% и 80,00%, против 66,67%; срочные роды – 88,24% и 85,71%, против 44,44%).
Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности и апробация работы. Cтатистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием пакетов прикладных программ «Microsoft Excel» и «Statisticafor Windows 6.0» (Stat Soft, США), а также при помощи программы IBM SPSS Statistics 22.
Работа выполнена на базе ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» МЗ РФ в рамках основного направления научной деятельности института «Разработка технологий восстановления рецепторного аппарата эндометрия на этапе предгравидарной подготовки у женщин с невынашиванием беременности, бесплодием, в том числе при подготовке к проведению ВРТ» (регистрационный номер НИОКТР АААА-А16-116031810016-4). Степень достоверности полученных результатов подтверждается соблюдением принципов доказательной медицины. Об этом свидетельствует большой объём выборки клинического материала, широкий спектр методов исследования, поэтапно выстроенный дизайн исследования, адекватное применение статистических методов обработки полученных данных.
Основные материалы и положения диссертации были доложены и обсуждены на научно-практической конференции с международным участием IV Конгресса акушеров-гинекологов Уральского Федерального округа (Екатеринбург, октябрь 2015г); на симпозиуме молодых ученых «Бенедиктовские чтения» (Екатеринбург, ноябрь 2016); на международной конференции «Неклассическое ЭКО: пути решения» (Екатеринбург, февраль 2017; на III Общероссийском научно-практическом семинаре «Репродуктивный потенциал России:
уральские чтения» (Екатеринбург, март 2017); на международном форуме университетской науки 2017 года «Мультидисциплинарный подход к репродуктивному здоровью женщин. Возрастные аспекты» (Москва, май 2017).
Апробация диссертационной работы проведена на заседании Ученого Совета
Федерального государственного бюджетного учреждения «Уральский НИИ Охраны
материнства и младенчества» Министерства Здравоохранения Российской Федерации 31
октября 2017 года, протокол № 17, на кафедре акушерства и гинекологии с курсом
перинатологии медицинского факультета Медицинского института федерального
государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Российский университет дружбы народов» Министерства науки и образования Российской Федерации 06 декабря 2017 года, протокол №7.
Участие автора в сборе первичного материала – более 90%, обобщении, анализе и внедрении в практику результатов работы – 100%. Цель и задачи сформулированы лично автором. Дизайн исследования разработан лично автором. Анализ современной отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме проведен лично диссертантом.
Статистическая обработка первичных данных, интерпретация и анализ полученных результатов, написание и оформление рукописи диссертации, представление результатов работы в научных публикациях и в виде докладов на конференциях осуществлялись соискателем лично. Диссертант лично курировал пациенток на стационарном этапе в гинекологическом отделении, проводил обследование женщин, изучение анамнеза жизни, акушерского и гинекологического анамнеза, проводил выполнение пайпель-биопсии эндометрия. Диссертантом лично проводились курсы низкочастотного ультразвукового орошения полости матки. Для анализа была разработана и создана электронная база данных, включающая результаты обследования пациенток.
Комплексный подход к восстановлению рецептивности эндометрия у пациенток с бесплодием и привычным невынашиванием, обусловленными гипоплазией эндометрия, с использованием низкочастотного ультразвукового орошения полости матки внедрён в работу гинекологического отделения и учебный процесс ФГБУ «Уральский НИИ охраны материнства и младенчества» МЗ РФ.
По результатам исследования опубликовано 4 научных статьи, 3 из них в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации для публикации материалов диссертации.
Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав собственного исследования, главы обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и списка литературы. Полученные
результаты иллюстрированы с помощью 44 таблиц и 10 рисунков. Список литературы представлен 175 источниками, из которых 80 - зарубежных авторов.
Молекулярные маркёры паракринной регуляции рецептивности эндометрия
Множество ученых из разных стран пытаются найти факторы, позволившие бы максимально точно прогнозировать исход экстракорпорального оплодотворения, для того, чтобы найти ключ к решению проблемы неэффективного лечения бесплодия [45, 144, 161]. Факторы роста, молекулы клеточной адгезии, цитокины, рецептивность и пиноподии являются наиболее изученными маркерами «окна имплантации» [20, 87, 93].
Пиноподии – гладкие выпячивания, образующиеся на поверхности эпителиальных клеток эндометрия. Пик образования этих структур совпадает с периодом максимальной рецептивности т.е. восприимчивости эндометрия, что и позволяет использовать пиноподии в качестве достоверного маркера «окна имплантации» [1, 95].
В строении эндометриального эпителия происходят изменения, характеризующиеся появлением выпячиваний мембраны — пиноподии [53, 61]. Как предполагают, эндометрий максимально рецептивен становится с 20-го по 24 й дни менструального цикла и проявляется его рецептивность экспрессией белков и пептидов, которые могут служить биомаркерами рецептивности матки [7]. За последние года накапливаются дополнительные данные по циклам ЭКО, когда проводят изучение «окна имплантации» путем подсадки эмбриона в разное время после пика лютеинизирующего гормона [71]. Доказано, что частота успешных беременностей значительно выше при имплантации эмбрионов между 22-м и 24-м днями цикла (8-10-й день после овуляции) по сравнению с имплантацией в сроки 11 дней и более после пика ЛГ [24, 61, 71]. При этом, чем позже время имплантации, тем выше риск раннего прерывания беременности: от 13% для эмбрионов, имплантированных на 9-й день, до 52% — на 11-й день, 82% — после 11-го дня. При исследовании одного и того же биопсийного материала была показана связь формирования пиноподий и других изменений, свидетельствующих о рецептивности эндометрия, а именно с утратой стероидных рецепторов, максимальной экспрессией ab3-интегрина, остеопонтина, лейкемия-ингибирующего фактора (ЛИФ) и рецептора к нему [34, 169, 171].
При помощи метода сканирующей электронной микроскопии установлено, что максимальное развитие пиноподий на поверхности мембран желез эндометрия приходится на период «окна имплантации» [1, 13, 95, 141]. Физиологическое значение развития пиноподий до конца не определено, однако есть ряд доказательств, что именно на поверхности пиноподий происходят начальные этапы адгезии бластоцисты к рецептивному эндометрию [68, 95, 102]. Так в проведённых экспериментах бластоцисты преимущественно прикреплялись к зонам эпителия, покрытым пиноподиями [147]. Для успешной имплантации необходимо, чтобы как минимум 50% поверхности эпителия были покрыты пиноподиями [1, 16, 125]. Однако это не было доказано in vivo: при проведении исследования из 10 бластоцист 2 прикрепились к области, свободной от пиноподий, а 7 – к области, покрытой пиноподиями менее, чем на 25% [162].
В литературе имеются данные об особенностях созревания пиноподий у женщин при различных клинических ситуациях. Выяснилось, что в естественном цикле образование пиноподий начинается с пятого дня после пика ЛГ и достигает максимума на седьмой день, а далее пиноподии исчезают. При овариальной стимуляции образование пиноподий начинается на четвёртый день после назначения ХГЧ и зрелости достигает на шестые сутки, после чего количество пиноподий резко падает [152]. А в циклах гормональной заместительной терапии, использующейся в программах переноса замороженных эмбрионов и в программах с донорскими яйцеклетками, пиноподии появляются на седьмой день после назначения прогестерона, и их количество неуклонно возрастает к восьмому дню, после чего число их резко уменьшается. Вышеизложенные данные свидетельствуют о смещении «окна имплантации» в некоторых циклах с овариальной стимуляцией, что может уменьшать вероятность имплантации по сравнению с естественными циклами или циклами с использованием гормональной заместительной терапии [46, 147].
Однако стоит отметить, что попытки внедрить исследование пиноподий в клиническую практику не во всех случаях были удачными, это связано с коротким периодом времени их жизни и относительной дороговизной их изучения [35, 130].
Динамика формирования пиноподий может нарушаться. «Окно имплантации» может сдвигаться по времени, т.е. появляться несколько раньше или позже. Данная ситуация, дисхроноз развития пиноподий, определяет репродуктивные неудачи, аномалии имплантации, невынашивание беременности, нарушение плацентации и может вызывать поздние осложнения гестации [16, 18].
«Окно имплантации» также может быть неполноценным, т.е. количество эндометриальных пиноподий будет недостаточным для имплантации. Это может быть вызвано различными причинами: гормональным дисбалансом, наличием острых или хронических инфекций половой сферы, предыдущими хирургическими вмешательствами [95, 97, 119].
Морфология пиноподий изменяется по мере прогрессирования секреторной фазы менструального цикла. Диаметр пиноподий у человека составляет порядка 6 микрон. Продолжительность существования пиноподий является предметом спора [1]. По некоторым данным они существуют менее 48 часов на протяжении средней лютеиновой фазы менструального цикла, в то время как по другим данным пиноподии появляются вскоре после овуляции и сохраняются до конца лютеиновой фазы [162].
Другой важной функцией пиноподий является высвобождение из везикул в полость матки фактора, ингибирующего лейкемию (LIF) [55, 149]. Созревание и регресс пиноподий тесно связаны с увеличением и уменьшением концентрации прогестерона в сыворотке крови. При этом, при развитии пиноподий, уровень экспрессии прогестерона типа А и В в железистом и поверхностном эпителии снижается. Согласно данным литературы, концентрация эстрогенов в сыворотке и уровень рецепторов эстрогена (, ) в эпителии не коррелирует с процессом формирования пиноподий [7, 151]. Показано, что эстрадиол также влияет на образование пиноподий, причем его действие зависит от времени введения. Так, если вводить высокие дозы эстрадиола одновременно с прогестероном, то пиноподии не образуются [12]. При исследовании биопсийного материала было продемонстрировано, что при наличии однородного эндометрия в позднюю лютеиновую фазу, количество пиноподий было существенно меньше, чем у пациенток с трехслойным эндометрием [13, 39]. Предполагается, что снижение количества пиноподий может играть роль в нарушении имплантации. Показано, что количество пиноподий снижается при наличии хронического эндометрита [123].
Другим маркером имплантации считается появление на поверхности эндометрия белков клеточной адгезии, в частности интегринов, которые способствуют прикреплению бластоцисты к поверхности эндометрия [146, 155]. Показано, что экспрессия интегрина v3 начинается в естественном цикле на седьмой день после пика ЛГ, тогда как в циклах с овариальной стимуляции экспрессия этого фактора адгезии начинается с пятого дня после назначения ХГЧ, что может говорить о смещении «окна имплантации» при применении стимуляции яичников [130]. Кроме того, выяснено, что вначале секреторной фазы цикла (на 16 день менструального цикла в 28 дней) в клетках эпителия и стромы эндометрия наблюдается большое количество рецепторов эстрогенов и прогестерона. К 20-22 дню цикла, который считается временем имплантации бластоцисты, эти рецепторы в клетках эпителия полностью исчезают, а их количество в клетках стромы остается крайне высоким [7]. Интересно отметить, что исчезновение рецепторов в клетках эпителия совпадает с самыми высокими уровнями эстрадиола и прогестерона в крови женщины в течение менструального цикла [32, 126]. Исследователи считают, что именно резкое падение рецепторов к эстрогенам и прогестерону в клетках эпителия вызывает появление на поверхности этих клеток белков клеточной адгезии (интегринов), а также увеличивает чувствительность к факторам роста, выделяемых клетками стромы эндометрия [34]. Это позволяет переключить регуляцию сложного многоуровневого процесса имплантации с системного на более тонкий, паракринный уровень.
Есть доказательства того, что система ИЛ-1 играет важную роль в сигнальном взаимодействии эндометрия и эмбриона в процессе имплантации у человека. Рецептор ИЛ-1 экспрессируется в эндометрии многих видов. Антагонистическое воздействие на биологические эффекты ИЛ-1 приводит к нарушению имплантации у мышей. Это, скорее всего, обусловлено нарушениями со стороны эндометрия, нежели эмбриона. Вероятно, ИЛ-1 оказывает влияние и на другие системы, участвующие в имплантации эмбриона, в том числе инвазию и ангиогенез, что предполагает роль цитокинов этого семейства в раннем эмбриональном развитии [17, 121].
Морфологическая картина «тонкого» эндометрия у пациенток с маточной формой бесплодия и невынашиванием беременности
Гистологическая картина образцов эндометрия у пациенток с бесплодием и невынашиванием беременности до лечения наиболее часто характеризовалась наличием признаков хронического эндометрита, которые выражались в очаговом скоплении лимфоцитов по типу «лимфоидных фолликулов», плазматических клеток, очагами фиброза в строме и стенке сосудов, склеротическими изменениями стенок спиральных артерий эндометрия (Рисунок 2). В первой группе у пациенток с бесплодием признаки хронического эндометрита наблюдались в 32,60%, во второй группе у пациенток с привычным невынашиванием в анамнезе в 29,54%, тогда как в контрольной группе лишь в 7,14%, (р0,05).
При исследовании образцов эндометрия было выявлено, что эндометрий соответствует фазе цикла, однако наблюдается и относительный дисхроноз созревания желез эндометрия, что проявлялось наличием в образцах желез в стадии поздней пролиферации и желез в стадии поздней секреции. Железы в фазе средней секреции, что соответствует ЛГ+7, в дни, когда происходил забор материала при 28-дневном менструальном цикле, в группе с бесплодием наблюдались в 73,91%, в группе с невынашиванием в 47,72%, (р0,05).
В Таблице 17 представлена морфологическая характеристика «тонкого» эндометрия.
Отмечается неравномерное распределение желёз в эндометрии в сравнении с группой контроля, в группе с бесплодием железы распределены равномерно в 48,39%, в группе с невынашиванием беременности в 48,15%, в контрольной группе 82,14%, (р0,05) (Рисунок 3).
Строма рыхлая описана лишь у каждой пятой пациентки с бесплодием и невынашиванием беременности, тогда как в контрольной группе рыхлая строма наблюдалась в 85,71%, (р0,05). Показатели встречаемости плотной стромы в группах наблюдения обратно пропорциональны частоте рыхлой стромы. У пациенток с бесплодием плотная строма представлена в образцах эндометрия при морфологическом исследовании в 73,91%, у пациенток с невынашиванием беременности в 81,81%, а в контрольной группе у 21,42% пациенток, (р0,05).
У пациенток с бесплодием и невынашиванием в отличие от условно здоровых фертильных женщин значительно чаще наблюдается уменьшение просвета сосудов стромального компонента эндометрия, что говорит о склеротическом изменении стенок спиральных артерий эндометрия. Сосудистый компонент стромы по результатам полученных исследований до лечения более выражен в контрольной группе (р0,05).
Почти у половины пациенток в группе с бесплодием при световой микроскопии определялись пиноподии, тогда как в группе с невынашиванием беременности их было значительно меньше. При морфологическом исследовании эндометрия методом световой микроскопии с увеличением 400 определяются микрополипы, которые не видны при ультразвуковом исследовании и при проведении гистероскопии.
Клиническая динамика заболевания на фоне различных методов лечения «тонкого» эндометрия
При клиническом обследовании пациенток первой группы с бесплодием, обусловленным гипоплазией эндометрия, в динамике проведенного комплексного лечения были выявлены достоверно значимые изменения в клинической картине заболевания в когортах стандартной и комплексной программ терапии. Изучение катамнеза женщин обследуемых групп в течение года после лечения показало, что у них уменьшилось количество и частота предъявляемых исходно жалоб, и улучшилась менструальная функция.
Данные клинического обследования пациенток в группе с бесплодием, обусловленным «тонким» эндометрием, в динамике комплексного лечения представлены в Таблице 23.
На фоне проводимого лечения у пациенток с бесплодием достоверно значимо увеличилась продолжительность менструации, выражаемая в днях, р1-2=0,006, р=0,035. Хотя продолжительность самого цикла до и после лечения, а также в сравнении с контрольной группой не изменилась. После проведенного лечения в когорте комплексного лечения у пациенток с бесплодием не наблюдалось нарушения менструального цикла, р=0,001. На фоне проводимой комплексной терапии достоверно значимо, в 5 раз, уменьшилась частота дисменореи, р=0,022.
Изменился также сам характер менструальной функции, объём менструальных выделений. Частота гипоолигоменореи в группах наблюдения после лечения снизилась в 10 раз по сравнению с исходными значениями, (р0,001). Изменилась в положительную сторону динамика синдрома хронических тазовых болей. После лечения достоверно значимо снизилась частота встречаемости болевого синдрома, (р0,001). Достоверно значимо уменьшились патологические выделения из половых путей после проведения курсов кавитационного орошения полости матки (р0,05).
При исследовании данных клинического наблюдения второй группы женщин с невынашиванием беременности, обусловленным гипоплазией эндометрия, выявлена положительная динамика в исчезновении жалоб, уменьшении болевого синдрома, патологических выделений из половых путей и нормализации менструальной функции.
Данные клинического обследования пациенток с невынашиванием беременности, обусловленным «тонким» эндометрием, в динамике комплексной терапии представлены в Таблице 24.
Достоверно значимо увеличилась продолжительность менструальных выделений, (р0,001). Значительно реже отмечено после лечения нарушение менструального цикла, (р0,05). Дисменорея стала наблюдаться у пациенток почти в 3 раза реже. После лечения увеличилась не только продолжительность менструальных выделений, но и их объём. Пациентки достоверно чаще стали отмечать, что менструация стала более обильной и продолжительной.
Частота выявления гипоолигоменореи уменьшилась в этой группе женщин в 6 раз. На фоне лечения в 5 раз уменьшилась частота встречаемости хронической тазовой боли, что говорит о положительном эффекте комплексной терапии. После проведенного лечения значительно улучшились показатели патологических выделений из половых путей, произошло снижение частоты данных жалоб с 56,53% до 2,27%, что является достоверно значимо и сопоставимо с контрольной группой (3,57%), (р0,001).
При клиническом исследовании пациенток, применявших стандартное лечение, которое включало циклическую гормональную терапию, была выявлена более низкая клиническая эффективность. При применении стандартной терапии по-прежнему пациентки предъявляли жалобы на болезненный характер менструации, остался высок процент патологических выделений из половых путей.
Данные клинического обследования пациенток c «тонким» эндометрием, применявших стандартную программу лечения представлены в Таблице 25.
Неэффективным такой способ лечения оказался и в отношении синдрома хронических тазовых болей. На фоне стандартной терапии нет достоверно значимого снижения частоты встречаемости данного синдрома. Характер менструальной функции значительно не изменился. Единственным достоверно значимым положительным эффектом от стандартной терапии оказалось увеличение объёма менструальных выделений. Гипоолигоменорея до лечения наблюдалась у 42,31% женщин, после гормональной терапии 15,38%, (р0,05).
Таким образом действие стандартной схемы лечения оказывает эффект лишь на характер менструальной функции, снижается частота встречаемости гипоолигоменореи, но не меняется клиническая симптоматика пациенток, связанная с болевым синдромом и патологическим характером выделений из половых путей.
Репродуктивные исходы стандартной и комплексной терапии
После применения комплексной терапии, направленной на улучшение рецептивности эндометрия, в течение первого года после лечения беременность наступила у 34 (73,91%) пациенток в группе с бесплодием. Среди пациенток в группе с невынашиванием беременности, из которых 50% страдали вторичным бесплодием, береенность наступила у 35 (79,55%) пациенток.
Сравнительный анализ исходов лечения стандартной и комплексной терапии представлен структурно на Рисунке 10.
Эффективность лечения в плане наступления беременности и её исходов в сравнении комплексной и стандартной терапии представлена в Таблице 44.
После лечения стандартным методом, включающим только циклическую гормональную терапию, по сравнению с комплексным лечением беременность наступила у 9 (34,62%) пациенток, (р0,001). Из числа наступивших беременностей на фоне стандартной терапии в сравнении с комплексным подходом к лечению естественным путём беременность наступала значительно реже. Отмечено, что при применении стандартной терапии пациенткам чаще приходилось применять вспомогательные репродуктивные технологии и в результате ВРТ беременность наступила у 44,44% пациенток в структуре всех наступивших беременностей (9), что значительно больше, чем в группе с бесплодием и в группе с невынашиванием беременности.
Среди наступивших беременностей тем или иным способом после проведения комплексного лечения достоверно значимо больше было срочных родов. После стандартного лечения срочные роды наблюдались в 2 раза реже в сравнении с группами бесплодия и невынашивания беременности, (р0,05). Преждевременными родами при использовании комплексного лечения беременности завершились в 4 раза реже, чем на фоне стандартной терапии.
Самопроизвольные выкидыши наблюдались среди всех наступивших беременностей только у пациенток, применявших стандартное лечение. При применении комплексного лечения неразвивающаяся беременность наблюдалась в группе пациенток с невынашиванием, в том числе из них одна по причине генетического заболевания (синдром Дауна). После стандартного лечения также в 2 наблюдениях беременность завершилась её регрессом, что достоверно значимо по сравнению с отсутствием неразвивающихся беременностей в группе бесплодия на фоне комплексного лечения, (р0,05).
Подводя итоги, комплексная терапия, включающая низкочастотное ультразвуковое орошение полости матки, по сравнению со стандартным методом лечения у пациенток с «тонким» эндометрием привела к статистически значимому регрессу клинических симптомов и нормализации менструального цикла. Достоверно значимо увеличилась толщина М-эхо у пациенток при использовании комплексной терапии, прирост эндометрия в обеих основных группах составил более 3 мм.
В результате использования ультразвукового низкочастотного орошения полости матки в динамике у пациенток с бесплодием и невынашиванием беременности отмечается улучшение гистологической картины эндометрия, снижение числа пациенток с признаками хронического эндометрита, восстановление цитоархитектоники эндометрия, синхронизация процесса созревания желёз. Количество пиноподий при световой микроскопии в первой группе увеличилось до 84,78%, во второй группе до 84,09%. У пациенток с невынашиванием достоверно больше усилилась выраженность сосудистого компонента эндометрия до 65,91%.
При сравнении эффективности лечения по ультраструктурным характеристикам рецептивности эндометрия у пациенток с бесплодием статистически значимо отмечено уменьшение атрофии эндометрия, снижение зон «спокойного» эпителия, нормализация функции клеток микроокружения и увеличения в период «окна имплантации» зрелых пиноподий. Среди пациенток с невынашиванием статистически значимо в 2 раза снизилась картина нарушенных межклеточных контактов до 43,18% и увеличилась до 59,09% зона интенсивной секреции в эндометрии.
Имуногистохимическое исследование образцов эндометрия у пациенток после комплексного лечения зафиксировало в обеих группах нормализацию уровня экспрессии рецепторов к половым гормонам, увеличение экспрессии маркёров ангиогенеза и значительное снижение числа плазматических клеток.
Общая эффективность лечения, оцененная по данным катамнеза в течение года после лечения по числу наступивших беременностей, в два раза превышает эффективность стандартной программы терапии. Доля спонтанных беременностей, наступивших после комплексной программы терапии, достоверно превышает число беременностей, наступивших в результате ВРТ, а число беременностей, завершившихся срочными родами у пациенток, получавших комплексное лечение, в два раза выше, чем у пациенток, получавших стандартную программу лечения гипоплазии эндометрия.