Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Современные аспекты роли ангиогенеза в развитии преэклампсии и плацентарной недостаточности 12
1.1 Современные патогенетические факторы преэклампсии и плацентарной недостаточности 12
1.2 Регуляторная роль ангиогенных факторов в формировании плацентарных сосудов 21
Глава 2 Материал и методы исследования 33
2.1. Материал исследования 33
2.2. Методы исследования 36
2.2.1 Характеристика клинических методов исследования 36
2.2.2 Молекулярно-генетические методы исследования 39
2.3. Методы статистической обработки результатов исследования 43
Глава 3 Общая клиническая характеристика обследованных беременных 45
3.1. Особенности течения настоящей беременности, родов и послеродового периода у пациенток в сравниваемых группах 45
3.2. Результаты клинико-лабораторных исследований 55
Глава 4 Генетические и клинико-анамнестические предикторы преэклампсии 59
4.1. Особенности анамнеза и фенотипа беременных, страдающих преэклампсией 59
4.2. Маркеры наследственной предрасположенности к преэклампсии 67
4.2.1. Распределение полиморфного варианта rs3025039 C936T гена VEGF в основной и контрольной группах 67
4.2.2. Распределение полиморфного варианта rs699947 A-2578C гена VEGF в основной и контрольной группах 71
4.3. Анамнестические и генотипические маркеры предрасположенности к развитию преэклампсии 74
Обсуждение результатов исследования 78
Выводы 88
Практические рекомендации 89
Список использованной литературы 90
Приложение 107
- Современные патогенетические факторы преэклампсии и плацентарной недостаточности
- Результаты клинико-лабораторных исследований
- Распределение полиморфного варианта rs3025039 C936T гена VEGF в основной и контрольной группах
- Анамнестические и генотипические маркеры предрасположенности к развитию преэклампсии
Современные патогенетические факторы преэклампсии и плацентарной недостаточности
ПЭ – это тяжелое осложнение беременности, носящее полиорганный характер. По данным научных исследований и мнению академика В. Н. Серова (2011) ПЭ – это «болезнь адаптации». Во многих странах мира ведущей причиной материнской смертности и болезни в перинатальном периоде остается ПЭ и его осложнения [7, 11, 46]. В структуре материнской смертности в России данное осложнение занимает 3 место [3, 6, 19, 49, 51].
ПЭ является ведущим фактором массивных акушерских кровотечений и гнойно-септических осложнений [9, 17, 31, 49]. Современные медицинские технологии позволили снизить материнскую смертность от сепсиса и кровотечений, а при ПЭ материнская летальность остается стабильной.
Ведущей причиной материнской смертности в некоторых развитых странах остается ПЭ, а в развивающихся странах вызывает 40-80% материнской смертности [41, 75].
Осложненное течение беременности приводит к увеличению частоты абдоминального родоразрешения, массивных кровотечений вследствие преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты. Из-за нарастания тяжести ПЭ частота преждевременных родов увеличивается, эндо-телиальная дисфункция плацентарно-плодового комплекса приводит к задержке роста плода и инфицированию. У женщин, перенесших тяжелую ПЭ, в дальнейшем формируются экстрагенитальные заболевания: артериальная гипертензия, эндокринные изменения, заболевания почек. У большинства пациенток есть риск летального исхода от сосудистых осложнений. У детей от матерей с ПЭ могут наблюдаться некоторые нарушения как физического, так и психоэмоционального развития. В раннем неонатальном периоде отмечается дезадаптация, а в младенческом и раннем детском возрасте заболеваемость возрастает [47, 68, 90, 136].
По современной концепции ПЭ обусловлена срывом компенсаторно-приспособительных систем матери, неспособные адекватно обеспечить потребности растущего плода.
ПЭ развивается после 20 недели беременности, но признаки ее сохраняются в родах и в послеродовом периоде. ПЭ сохраняется, пока пролонгируется гестационный период, без терапии степень тяжести нарастает. Но при патогенетическом подходе к лечению возможна временная стабилизация состояния пациентки, способствующая продлению гестационного срока ближе к сроку родов [55, 67, 83, 109].
Закладка ПЭ начинается при имплантации плодного яйца, формировании и инвазии трофобласта. При неадекватной инвазии трофобласта в спиральные артерии матки развивается эндотелиальная дисфункция сосудов маточно-плацентарной системы, отмечается повышенная проницаемость сосудистого русла. Вследствие гиповолемии происходит спазм, приводящий к острому генерализованному эндотелиозу. Из сосудистого русла в интерсти-циальное пространство уходить жидкая часть плазмы, белки, натрий [7, 37, 62, 75].
При микроскопическом исследовании эритроциты и лейкоциты склеиваются, образуя «сладж-феномен» (sladge). Реологические свойства крови изменяются повышением вязкости крови, на эндотелиях сосудов образуются нити фибрина. В результате изменений свойств крови кровоток становится замедленным, развивается тканевая гипоксия. Клиническим проявлением повышенной проницаемости эндотелия сосудов является периферические отеки, уменьшение ОЦК, что приводит к ишемии и ухудшению функции жизненно важных органов, нарушается плодово-плацентарное кровообращение и развивается полиорганная недостаточность [37, 50, 74, 88]. В работах отечественных и зарубежных авторов была попытка изучить причины артериальной гипертензии и почечной дисфункции в этиологии ПЭ. Однако этиология ПЭ так и остается загадкой. В настоящее время данную патологию рассматривают как мультисистемную болезнь с активацией воспалительных процессов, дисбалансом ангиогенных и антиогенных факторов, эндотелиальной дисфункцией [10, 12, 26, 89].
В связи с высокой частотой перинатальной патологии, обусловленной ПЭ, широко изучаются плацентарные сосудистые медиаторы, факторы роста, мутации гена, кодирующих маркеров гипертензии, ПН, ЗРП [12, 16, 76].
Изучены более 30 гипотез, посвященных развитию ПЭ. Еще в IV в. до н.э. было известно, что судорожный синдром возникал как при беременности, так и при родах. Со времен Гиппократа считали, что эклампсия – это специфическая форма эпилепсии.
Изначально была выдвинута теория инфекционного фактора развития ПЭ, однако, данная гипотеза не нашла своего подтверждения, так как при этом не обнаружен микробный агент. В последующем была выдвинута интоксикационная теория, по версии которой беременные отравлялись веществами. Эта теория господствовала долго, несмотря на отсутствие токсических веществ, вызывающих ПЭ. На современном этапе подтверждено, что в роли токсических веществ для организма матери могут быть факторы воспаления, бактериальные токсины и вирусы, продукты обмена, перекисные продукты [91, 76].
Патологическое состояние в организме может быть вызвано нарушением равновесия между веществами-антагонистами [13, 82, 93]. При этом генерализованный эндотелиоз развивается на воздействие слабых факторов. Проблеме ПЭ посвящены многочисленные исследования, но, несмотря на это, ПЭ остается проблемой века. ПЭ – мультифакторное заболевание беременности.
При изучении этиологического фактора, ПЭ является осложнением, который развивается при беременности, имеющий многофакторный характер, поэтому до сих пор является важной проблемой в акушерской практике современного здравоохранения.
ПЭ проявляется триадой симптомов, называемой триадой Цангемейст-ра. Эти симптомы (отеки, артериальная гипертензия, белок в моче) появляются у беременных после 20 недели гестационного периода. Но задолго до появления клинических признаков в организме женщины происходят глубокие метаболические нарушения в различных системах и органах. Симптомо-комплекс не ограничивается триадой симптомов, но и другими нарушениями, связанные с изменениями кровообращения. Течение ПЭ тяжелой может быть многообразным, а многие авторы ее назвали «великим обманщиком» [13, 21, 28, 38, 159].
Согласно данным Серова В. Н. (2011) в патогенезе развития ПЭ лежат генерализованная вазоконстрикция, гиповолемия, нарушение микроциркуляции и гипоксия, нарушение реологических свойств крови. Все эти изменения приводят к развитию ПН, в которой главную роль играет матка и плацента [25, 38, 124].
ПЭ – это «болезнь» эндотелия сосудов, являющаяся одним из звеньев патогенеза ПЭ. В работе I. N Robertsetal (1980) высказано предположение об активации эндотелия у беременной при ПЭ. Эти данные согласуются с другими исследователями, по которым клиническая картина ПЭ определяется эндотелиальной дисфункцией [24, 32, 38, 139]. Следствием гипоксии является локальное повреждение эндотелия, способствующее сосудистой проницаемости, нарушению регуляции сосудистого тонуса [35, 50, 135].
Клиническим проявлением данных процессов является артериальная гипертензия. Повреждению эндотелия при ПЭ также способствует образование перекисей липидов [59, 101]. Формируeтся эндотелиоз, ведущий к дисбалансу между оксидантами и антиоксидантами, способствующий оксидатив-ному стрессу. Под влиянием оксидативного стресса происходит транскрипция различных факторов, отвечающих за иммунный ответ [88, 94, 106]. Результаты многочисленных исследований как зарубежных, так и отечественных авторов показали, что при ПЭ развивается системный воспалительный ответ, ведущий к эндотелиальной дисфункции. Если системы деблокированы и не способны поддерживать гомеостаз, то провоспалительные ци-токины и другие медиаторы доминируют, следствием чего может быть нарушение проницаемости и функции эндотелия, формирование полиорганной недостаточности.
Выделяют три основные группы изменений, характерных для SIRS:
1. Цитокиновая атака на эндотелиоциты вызывает «кислородный» взрыв клетки, который ассоциируется с нарастанием пула токсичных веществ, продуктов протеолиза, так называемых молекул средней массы на фоне дисфункции систем перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы;
2. Нарушение тромбоцитарного и плазменного звеньев гемостаза с нарастанием тромбогенного потенциала и повреждением микроциркуляторного русла;
3. Эндотоксикоз. Генерализация этих изменений приводит к ишемии органов и систем и развитию синдрома полиорганной недостаточности.
Среди 30 гипотез развития ПЭ особое место занимает иммунологическая теория. Гипотеза данной теории доказана многочисленными эпидемиологическими наблюдениями.
ПЭ характерна для юных первородящих, ЭКО, а также, возможно, некоторая защита при повторной беременности. Это указывает об антигенной роли плаценты [69, 97]. В основе ПЭ, с точки зрения иммунной теории, может быть совокупность двух разных по антигенной структуре организма -матери и плода.
Результаты клинико-лабораторных исследований
Для выявления прогностически значимых критериев определения тяжести ПЭ проведены клинические, лабораторные и биохимические исследования. Проведен анализ результатов печеночных ферментов у беременных обследованных групп, результаты которой представлены в табл. 3.14.
В табл. 3.14 показано, что достоверно низкое содержание общего белка при ПН у беременных с тяжелой ПЭ 54,6±3,1 г/л (у контрольной группы – 73,5±4,3 г/л) (р 0,05), что свидетельствует о снижении синтетической функции печени. У пациенток с умеренной ПЭ недостоверно снижается уровень общего белка (65,6±6,2 г/л).
При ПЭ формируется ПН, вследствие чего возрастает активность фермента щелочной фосфатазы. Высокие значения ЩФ свидетельствуют о гипоксии тканей, хронической гипоксии и задержке роста плода, что являются свидетельством нарушения метаболической функции клеток печени и повреждения ее ткани. По сравнению с показателями (219,8±4,7 Ед/л) женщин, у которых беременность протекает без особенностей, у пациенток с ПН и ПЭ тяжелой формы, выявлено достоверное увеличение концентрации показателей ЩФ до 373,9+12,4Ед/л, при умеренной ПЭ – 261,7±4,1 Ед/л, р 0,05.
Результаты исследования свидетельствуют, возможно, о печеночно-клеточной недостаточности. Показатели ГГТ указывают о достоверном повышении его при ПН у беременных с тяжелой ПЭ, которые составили 38,3±15,4 Ед/л, соответственно по сравнению с контрольной группой – 21,8±8,1 Ед/л (р 0,05). Недостоверные изменения отмечены при ПЭ умеренной – 19,4±7,6 Ед/л.
Наибольшее значение при ПЭ, приводящая к повреждению гепатоци-тов, имеет активность печеночного фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Анализ результатов исследования показал, что высокие показатели выявлены при ПН у беременных с тяжелой ПЭ, которые составили 651,8±18,9 Ед/л, при умеренной – 489,5±11,6 Ед/л (р 0,05). Показатели уровня прямого билирубина повышены при ПН у беременных с умеренной ПЭ до 3,7±1,4 мкмоль/л, при тяжелой до 4,1±0,8 мкмоль/л (р 0,05), причем у пациенток, в анамнезе которых была патология желчевы-водящих путей.
Показатели АлАТ при умеренной ПЭ составили 25,9±15,8 ЕД/л и существенно не отличались от значений у здоровых беременных (24,1±4,9 ЕД/л), а достоверные изменения отмечены при тяжелой ПЭ, где они увеличились до 47,2±11,3 ЕД/л (р 0,05).
Также нами оценены показатели аспартатаминотрансферазы (АсАТ). При умеренной ПЭ и нормальном течении беременности, показатели АсАТ достоверно не менялись (33,1±11,2 ЕД/л и 31,6±8,4 ЕД/л), а при тяжелой форме ПЭ этот показатель повысился до 42,8±4,5 Ед/л, что достоверно отличается от данных групп сравнения (р 0,05).
Интерес к свертывающей системе крови у беременных вызван высокой частотой тромботических, геморрагических осложнений и неизбежным ее вовлечением в любое критическое состояние в период гестационного срока, родов и послеродового периода. Одним из главных звеньев патогенеза ПЭ является генерализованный сосудистый спазм, гиповолемия, нарушение реологических и коагуляционных свойств крови.
В таблице 3.15 представлены показатели системы гемостаза, результаты которых подтверждают активацию свертывающей системы при ПЭ.
При изучении системы гемостаза в основной группе с тяжелой ПЭ выявлено достоверное повышение уровня фибриногена до 5,4±0,6 г/л, p0,05 (при норме от 2 до 4 г/л). Однако увеличение концентрации фибриногена до 6 г/л во II и III триместрах беременности срока является физиологической гиперкоагуляцией, характерной для данного периода гестации.
При тяжелой ПЭ в системе гемостаза отмечаются изменения, связанные с ростом ПТИ от 84,5±12,3% до 175,3±13,8% (p0,05), укорочение АЧТВ: число тромбоцитов снижается в 1,3 раза при признаках умеренной ПЭ и в 2 раза при тяжелой ПЭ (p0,05).
Сравнительный анализ результатов исследования в сравниваемых групп свидетельствует об ускорении процессов деструкции тромбоцитов и их гранул. Продукты деградации разрушенных компонентов крови, попадая в кровоток матери, повреждают эндотелий сосудов. Все эти изменения лежат в основе патогенеза ПЭ, вызывая нарастание тяжести ПЭ и ухудшение состояния плода.
Таким образом, течение физиологической беременности и развившая при этом ПЭ и ПН, способствует изменению системы гемостаза. При развитии ПН рекомендуют обследование тромбоцитарного, плазменного, антикоа-гулянтного и фибринолитического звеньев гемостаза, чтобы на доклиническом этапе прогнозировать развитие и тяжесть степени ПЭ.
Распределение полиморфного варианта rs3025039 C936T гена VEGF в основной и контрольной группах
Нами проведено тестирование нуклеотидных изменений ДНК в образцах крови, полученных от 97 женщин основной группы (беременные, страдающие ПЭ) и от 100 женщин контрольной группы (пациентки с физиологически протекающей беременностью).
Определялись 2 позиции регуляторного региона гена VEGF в точках полиморфизма –2578 и +963: полиморфизм не транслируемого региона гена в позиции +936CT (локус rs3025039) и полиморфизм промоторного региона гена в позиции –2578 AC (локус rs699947).
Результаты сравнительного анализа распространенности генотипов полиморфного варианта rs3025039 C936T гена VEGF у беременных основной и контрольной группы представлены в таблице 4.14 и рисунке 4.2.
Как можно видеть в таблице 4.14 и на диаграмме (рис. 4.2), носительницами гомозиготного генотипа «СС» локуса rs3025039 гена VEGF являются 26,8% беременных женщин с ПЭ и 58,0% беременных женщин контрольной группы; носительницами гетерозиготного генотипа «СТ» – 59,8% беременных женщин с ПЭ и 42,0% беременных женщин контрольной группы; носительницами гомозиготного генотипа «ТТ» – 13,4%, беременных женщин с ПЭ, в контрольной группе носительниц генотипа «ТТ» не наблюдалось (все различия статистически значимы при p 0,05).
Таким образом, нами установлено, что 72,3% беременных женщин с ПЭ являются носительницами аллеля «T» локуса rs3025039 гена VEGF (59,8% гетерозиготных и 13,4% гомозиготных носительниц), который ассоциируется с низким уровнем экспрессии гена. В контрольной группе 100% женщин являются носительницами аллеля «С» локуса rs3025039 гена VEGF, который ассоциируется с высоким уровнем экспрессии гена VEGF (58,0% гомозиготных и 42,0% гетерозиготных носительниц).
Интерпретация полученных результатов
Согласно данным международного банка однонуклеотидных полиморфизмов dbSNP, частота встречаемости аллеля «T» в локусе rs3025039 составляет 13,36% (по данным проекта 1000 Genomes) и 12,25% (по данным проекта клинических генотипирований TOPMED). Минимальная популяционная частота аллеля «T» составляет 8,4% (африканская популяция), максимальная популяционная частота – 22,77% (смешанная американская популяция) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=3025039].
По данным нашего исследования в образцах крови, полученных от 197 беременных женщин, присутствует ДНК из 394 хромосом (по 2 хромосомы, содержащие ген VEGF), среди которых обнаружено 126 хромосом с аллелем «Т», что соответствует частоте 31,98%, значительно превышая средние частоты распространенности аллеля «Т» локуса rs3025039 в разных популяциях мира. Принимая во внимание, что в основной группе частота аллеля «Т» составляет 43,30%, превышая в 2 раза максимальную популяционную частоту, а в контрольной группе – 21,0%, полностью соответствуя популяционной частоте, возникает статистически обоснованное предположение о наличии этиологической связи аллеля «T» локуса rs3025039 гена VEGF с развитием ПЭ во время беременности.
Отсутствие гомозигот по аллелю «Т» локуса rs3025039 в контрольной группе нарушает правило равновесного наследования мутаций Харди-Вайнберга и позволяет предположить наличие отсекающего (отрицательного) отбора носителей гомозигот «ТТ». Наличие же 13,4% гомозигот по алле-лю «Т» локуса rs3025039 в основной группе и отсутствие таковых в контрольной группе позволяет предположить, что гомозиготное носительство аллеля «Т» локуса rs3025039 является генетическим маркером предрасположенности к ПЭ.
Это, в свою очередь, позволяет выдвинуть гипотезу о существовании рецессивного наследственного синдрома, обусловленного мутацией в локусе rs3025039 гена VEGF, проявляющегося развитием ПЭ у беременной.
Для подтверждения этой гипотезы необходимо увеличить объем исследуемых выборок до накопления, как минимум, 30 гомозигот по аллелю «Т» локуса rs3025039 в основной группе. Тогда появится возможность утверждать, что в исследовании набрано минимально достаточно носительниц этой гомозиготы, чтобы представлять всю популяцию. Если при этом количество гомозигот по аллелю «Т» локуса rs3025039 в контрольной группе останется нулевым, тогда можно будет утверждать об открытии нового наследственного рецессивного синдрома ПЭ. В настоящее же время (при данном объеме сравниваемых групп) правомерно считать, что носительство аллеля «T» локуса rs3025039 гена VEGF является маркером наследственной предрасположенности к ПЭ.
Анамнестические и генотипические маркеры предрасположенности к развитию преэклампсии
Для выявления предикторов развития ПЭ проведен многофакторный анализ генотипических и анамнестических признаков, представленных предыдущих разделах данной главы. Многофакторный анализ проводили поэтапно. Сначала из 26 первично тестируемых признаков определена совокупность из 16 наиболее информативных, перечисленных в таблице 4.16 в соответствии с величиной коэффициента информативности.
Как видно из представленных в таблице 4.16 данных, наиболее достоверно различающим признаком является дермографизм (р ,001x). Несколько ниже достоверность анамнестических признаков: ПЭ в предыдущую беременность (р ,001f), возраст (р ,001x ) и ПН в предыдущей беременности (р ,001x). По коэффициенту информативности также достоверны были наблюдавшие клинические проявления такие, как мигрень (р=,008x) и розацеа в анамнезе (р=,010f), псориаз в анамнезе (р ,100f), носовые кровотечения в анамнезе (р ,100x), последние два, из которых выявлено наименьшие значения признаков.
Таким образом, в нашем исследовании на основании достоверно различающим признаком в сравниваемых группах по коэффициенту информативности именно эти признаки правомерно считать предикторами ПЭ или маркерами предрасположенности к ПЭ.
Следующим этапом многофакторного анализа было построение прогностического теста (решающего правила) на основе статистически достоверных предикторов ПЭ. Решающее правило имеет вид таблицы 4.17, в которой перечислены информативные признаки с градациями и их весовыми коэффициентами (коэффициентами решающего правила).
Испытание решающего правила на экзаменационной выборке пациен ток. Для создания экзаменационной выборки были произвольно отобраны 39 пациенток из основной группы и 25 пациенток из контрольной группы и смешаны между собой. Для каждой пациентки экзаменационной выборки с помощью полученного теста определялась принадлежность к исследуемой или контрольной группе. Оценкой качества решающего правила служила частота правильного определения группы (с учетом 95% доверительного интервала).
Таким образом, оценка правильного распознавания пациенток основной и контрольной группы с помощью «решающего правила» позволила определить его качественные характеристики:
- чувствительность составила 79,5% (58,6-93,0%);
- специфичность составила 84,0% (57,6-97,1%);
- точность составила 81,3% (65,8-91,9%).
Эти характеристики «решающего правила» позволяют рекомендовать его использование в акушерско-гинекологической практике с целью индивидуального прогнозирования развития ПЭ еще до наступления беременности или в ранних ее сроках
Инструкция по использованию решающего правила.
Для определения риска развития ПЭ необходимо провести тестирование пациентки с помощью «решающего правила», затем соответствующие значения весовых коэффициентов суммировать. Пороговое значение, на основе которого проводится интерпретация полученного результата, составляет «0». Сумма весовых коэффициентов, представляющая собой значение со знаком «+» (положительное значение), указывает на наличие риска развития ПЭ, причем, чем выше значение, тем тяжелее степень ПЭ. При минимальном риске развития ПЭ сумма весовых коэффициентов представляет собой значение со знаком «–» (отрицательное значение) .