Содержание к диссертации
Введение
Глава I Материнская тромбофилия, ангиогенные факторы и неудачи ЭКО (Обзор литературы) стр. 11
1.1 Взаимосвязь между неудачами ЭКО и материнской тромбофилией стр. 13
1.2 Ангиогенные факторы и неудачи ЭКО стр. 30
Глава II Общеклиническая характеристика больных. Материалы и методы исследования стр. 41
2.1. Клиническая характеристика обследованных пациенток стр. 41
2.2. Методы исследования
Глава III Факторы ангиогенеза и структура тромбофилии у женщин с неудачами ЭКО стр. 63
Глава IV Основные принципы профилатики повторных неудач ЭКО у женщин с тромбофилией стр. 76
Глава V Обсуждение полученных результатов стр. 94
Выводы стр. 116
Практические рекомендации стр. 117
Список литературы стр. 119
- Ангиогенные факторы и неудачи ЭКО
- Клиническая характеристика обследованных пациенток
- Методы исследования
- Обсуждение полученных результатов
Ангиогенные факторы и неудачи ЭКО
Под понятием «тромбофилия» понимают повышенную предрасположенность к тромботическим осложнениям, обусловленных генетическими или приобретенными дефектами системы гемостаза. Изучение тромбофилии как патологического состояния ведется с конца прошлого века. История изучения связана с открытием антифосфолипидного синдрома и ряда генетических мутаций факторов системы гемостаза и установлением этиологической роли дисфункции системы гемостаза в патогенезе большинства акушерских осложнений. Наиболее широко в этом аспекте обсуждается проблема репродуктивных потерь. Многочисленными исследованиями доказана роль материнской тромбофилии в привычном невынашивании беременности.
Показана также связь с такими распространенными формами акушерской патологии как преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты, преэклампсия, синдром задержки внутриутробного роста плода, антенатальная гибель плода. [1,6,17,22,43].
При наличии генетических и приобретённых форм тромбофилии могут иметь место субклинические аборты, которые маскируется в виде бесплодия неясного генеза.
Характерной особенностью тромбофилии является ее «скрытое» течение и клиническая манифестация в форме тромбозов при наличии дополнительного «разрешающего» фактора, которым может быть беременность. В большинстве наблюдений наследственные формы тромбофилий впервые проявляются именно во время беременности. И не только в форме тромбозов.
Беременность, роды, оперативное вмешательство могут провоцировать манифестацию наследственных дефектов гемостаза, предрасполагающих к тромбозу. Клиническими ориентирами, позволяющими заподозрить такие дефекты гемостаза, являются эпизод идиопатического венозного (артериального) тромбоза без видимых факторов риска (травма, хирургическое вмешательство, злокачественное новообразование, длительная иммобилизация и пр.) в сочетании с семейным тромбоэмболическим анамнезом (1-2 случая во II поколении; чаще наследование по аутосомно-доминантному типу), случаи венозного тромбоза у лиц моложе 50 лет; атипичная локализация венозных тромбозов (мезентериальные сосуды); ранние инфаркты и инсульты, проявления массивного венозного тромбоэмболизма, а также, что очень важно, рецидивирующие тромбозы [7, 30, 100, 116].
В последние годы активно изучается роль нарушений в системе гемостаза в процессах имплантации при ЭКО. Установлено, что процессы адекватной имплантации оплодотворенной яйцеклетки, трансформации спиральных артерий и плацентации нарушаются при тромбофилии. В настоящее время к наиболее изученным и распространенным тромбофилиям относятся антифосфолипидный синдром (АФС) и генетические тромбофилии — мутация Лейдена, мутация протромбина G20210A, мутация метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), дефицит протеина С, дефицит протеина S, дефицит антитромбина III (АТ III), дефицит гепарин-кофактора II, дефицит протромбина, плазминогена, полиморфизм гена PAI-1, дисфибриногенемия, синдром липких тромбоцитов и др.[4, 9, 39, 43, 94, 121, 129, 174]. [4]. Антифосфолипидный синдром – это симптомокомплекс, сочетающий определенные клинические признаки и лабораторные данные – наличие циркуляции антифосфолипидных антител в сочетании с артериальными и венозными тромбозами, синдромом потери плода, иммунной тромбоцитопенией и/или неврологическими расстройствами. Синдром может проявляться одним или одновременно несколькими клиническими признаками – вплоть до развития так называемой катастрофической формы АФС, характеризующейся острой мультиорганной недостаточностью, напоминающей таковую при ДВС-синдроме с развитием острого респираторного дистресс-синдрома, поражением ЦНС (инсульт, ступор, дезориентация), инфарктами миокарда, гастроинтестинальных органов, надпочечниковой недостаточностью и пр. Особо следует отметить, что термин «антифосфолипидный синдром» правомочен только при сочетании лабораторных признаков циркуляции антифосфолипидных антител (АФА) и одного или более клинических проявлений. По данным Michael D. (1999), АФА обнаруживается в общей популяции с частотой 5-17%; значительно чаще встречаются при привычном невынашивании [108], заболеваниях органов малого таза, таких как эндометриоз, хронический сальпингоофорит и спаечный процесс [57, 89], бесплодии неясного генеза [114], повторных неудачных попытках ЭКО [113].
В настоящее время с циркуляцией у женщин антифосфолипидных антител (АФА) связывают значительную часть репродуктивных нарушений (привычное невынашивание беременности, бесплодие, неудачные попытки ЭКО). Согласно данным литературы [14, 26, 43], частота гибели эмбриона/плода без лечения у женщин с АФА составляет 80-95%.
АФС является причиной бесплодия и привычного невынашивания беременности в 27-42% случаев, механизмами прерывания беременности являются неадекватное образование фибрина, геморрагии в области прикрепления эмбриона и нарушение процесса имплантации при дефектах свертывания крови, либо децидуальная и плацентарная несостоятельность из-за тромботической тенденции [11].
Антифосфолипидные антитела многосторонне, напрямую или
опосредованно, влияют на процесс имплантанции и ранние эмбрионические стадии [15, 108, 44, 48, 49, 92]. АФА препятствуют развитию цитотрофобласта в синцитиотрофобласт на ранних сроках беременности [13, 92]. Достаточно часто антитела к фосфолипидам выявляются в группе женщин с искусственным оплодотворением (15-48%). Первые исследования в этой области были начаты в начале 70-х годов прошлого века [14, 48, 94].
Клиническая характеристика обследованных пациенток
Клинико-лабораторное обследование включало инструментальные и лабораторные методы. Проводилось ультразвуковое исследование органов малого таза (УЗИ), обследование на половые инфекции, определение гормонального статуса, иммунологическое исследование, генетическое (определение кариотипа супругов), определение состояния системы гемостаза, молекулярно-генетические исследования генетических форм тромбофилии, маркеры локального гемостаза (сосудистый эндотелиальный фактор роста, эндотелин, гомоцистеин, ингибитор активатора плазминогена 1 типа (PAI-1), тканевой активатор плазминогена (t-PA)), а также клинический и биохимический анализы крови, общий анализ мочи, допплерография, кардиотокография и др.
Забор крови производился сухой стерильной иглой из локтевой вены в пластиковую пробирку в соотношении с антикоагулянтом 9:1. В качестве антикоагулянта использовали 3,8% раствор трехзамещенного цитрата натрия. Необходимая обработка и выполнение срочных тестов проводились в течение 2 часов после взятия крови. Последовательное центрифугирование крови и плазмы позволяло получить богатую тромбоцитами плазму. Для получения богатой тромбоцитами плазмы кровь центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут. Для приготовления бестромбоцитарной плазмы кровь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут. 1.Определение концентрации комплексов тромбин-антитромбин (ТАТ) с помощью фирменного набора EnzygnostAT ( Behringwerke, Germany). Принцип исследования заключается в определении концентрации комплексов ТАТ иммуноферментным методом в плазме крови с помощью «сандвич» - техники.
Во время первой инкубации находящиеся в исследуемом образце комплексы ТАТ связываются с антителами к антитромбину, фиксированными на поверхности пластиковой пробирки. В ходе дальнейшей реакции при добавлении антител к человеческому AT III, конъюгированных с пероксидазой, последние связываются со свободными (еще не связанными) детерминантами AT III комплексов ТАТ. Избыток антител, конъюгированных с пероксидазой, удаляется при промывании. Затем измеряется энзиматическая активность соединения. Энзиматические преобразования перекиси водорода и хромогена тормозятся путем добавления в пробирку разведенной серной кислоты. Затем фотометрически измеряется интенсивность окрашивания, которая пропорциональна концентрации комплексов ТАТ. Клиническое значение определения концентрации комплексов ТАТ связано с возможностью ранней диагностики тромбофилического состояния, так как комплексы ТАТ являются ранними маркерами тромбофилии и начала внутрисосудистого свертывания крови. 2. Метод оценки внутрисосудистого тромбообразования определение D-димера количественным методом «latex enchanced immunoassay» TechnoLEIA D-Dimer Latex, который основан на взаимодействии высокоспецифичных антител к D-димеру, фиксированных на латексных частицах. D-димер характеризует перекрестную полимеризацию фибрина в процессе внутрисосудистого свертывания крови; является одним из наиболее специфических тестов диагностики ДВС-синдрома, тромбофилии и тромбоза. 3. Исследование плазменного звена системы гемостаза. а) Определение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), характеризующего суммарную активность факторов внутреннего пути свертывания (кроме FVII и FVIII) в условиях стандартной активации факторов контакта (FXII и FXI) каолином и стандартного содержания фосфолипидов (частичный тромбопластин) с использованием коммерческих наборов Stago, Франция. б) оценка показателей гемостаза на приборе тромбоэластограф «Hellige» (Germany): “r+k” (хронометрический показатель), “ma” (максимальная амплитуда) «ИТП» (индекс тромбодинамического потенциала с целью оценки хронометрических и структурных параметров коагуляции. 4. Определение количества тромбоцитов. Контроль количества тромбоцитов в периферической крови проводился на автоматическом счетчике «Тrombocounter», Франция. 5. Исследование функциональной активности тромбоцитов. Исследование агрегации тромбоцитов проводили на агрегометре Рауtоn (США) по методу Вогn, с графической регистрацией интенсивности и динамики агрегации тромбоцитов при перемешивании их со стимуляторами агрегации в кювете агрегометра. Принцип метода основан на фотоэлектрической регистрации динамики изменения светопропускания (оптической плотности) образца плазмы богатой тромбоцитами при перемешивании с индукторами агрегации: раствор аденозиндифосфата (АДФ) конечной концентрации 1хЮ"3М, 1х10"5М, 1xlO"7М; суспензия коллагена, раствор адреналина - 1х10-3М; арахидоновой кислоты 1х10"5М.
Предварительная оценка агрегатометра проводилась в зависимости от типов кривых: "необратимая агрегация", "обратимая агрегация" (дезагрегация) и двухфазная агрегация (рис. 4). Количественная оценка параметров агрегации тромбоцитов проводилась после предварительной оценки по типам кривых, с помощью вычисления следующих параметров агрегации: Тта, Тва, ТДА, и ілп (рис. 5).
Характеристика параметров агрегации: Тма (%) - величина максмальной агрегации, определяется отношением величины изменения светопропускания образца исследуемой плазмы к величине интервала светопропускания от 0% до 100%, характеризует интенсивность агрегации. Тва (%) - величина вторичной агрегации, определяется отношением изменения светопропускания образца плазмы на этапе вторичной агрегации к величине интервала от 0% до светопропускания 100%, характеризует интенсивность вторичной агрегации (только для двухфазных кривых агретограммы). Тда (%) - величина дезагрегации, определяется отношением изменения светопропускания образца Z исследуемой плазмы на этапе образования дезагрегации (только для обратимой агрегации). tлп (сек) - латентный период коллаген-агрегации и агрегации под воздействием арахидоновои кислоты, от момента добавления стимулятора до начала реакции высвобождения эндогенных стимуляторов и синтеза ТхАз, характеризует время начала реакции высвобождения эндогенных стимуляторов агрегации и синтеза циклических эндопероксидов - простагландинов и тромбоксана А2 в тромбоцитах.
Методы исследования
Основным критерием отбора пациенток в группу явилось наличие тромбофилии. К критериям тромбофилии были отнесены: — Наличие АФС, мутации FV Leiden, протромбина, гипергомоцистеинемия, их комбинации или комбинации с полиморфизмов генов; — 3 или более гомозиготные формы полиморфизма генов; — 5 или более гетерозиготных полиморфизма генов. Структура тромбофилии пациенток II группы включала генетические и комбинированные формы. Антифосфолипидный синдром был диагностирован у 35 (41,2%) женщин, только в 3 случаях изолированно (3,5%). Гипергомоцистеинемия имела место у 20 (23,5%), во всех случаях выявлялась сочетано с генетической тромбофилией. Среди генетических тромбофилических мутаций и полиморфизмов в высоком проценте присутствовали полиморфизм гена PAI-1 67 (78,8%), полиморфизм «I/D» в гене тканевого активатора плазминогена (60 (70,6%)), полиморфизм гена фибриногена «455 G/A» (43 (50,6%)), полиморфизмы тромбоцитарных гликопротеинов (40 (47,1%) и 36 (42,4%)). Мутация гена MTHFR C677T место у 58 (68,2%) женщин. У 1 (1,2%) из пациенток была гетерозиготная форма мутации FV Leiden.
Генетические мутации и полиморфизмы выявлялись комбинированно с антифосфолипидным синдромом, гипергомоцистеинемией и другими генетическими мутациями и полиморфизмами. Структура тромбофилии в целом соответствовала таковой в I исследуемой группе. Наиболее распространенными были сочетанное выявление полиморфизма гена PAI-1 и полиморфизма «I/D» в гене тканевого активатора плазминогена (43 (50,6%)), полиморфизма гена PAI-1 и полиморфизма фибриногена (28 (32,9%)), сочетание указанных трех полиморфизмов (24 (28,2%)), в том числе с циркуляцией АФА (19 (22,4%)).
Эндотелиальный фактор роста сосудов, определяемый на 20-24 день менстуального цикла был выше 42 пг/мл у 54 (63,5%) пациенток с неудачами ЭКО в анамнезе. Средние значения показателя составили 98,6±9,3, что достоверно превышало таковой в контрольной группе и группе сравнения (p 0,05).
Обязательным компонентом обследования пациенток с неудачами ЭКО в анамнезе в рамках подготовки к процедуре ЭКО было проведение гемостазиологического исследования с целью оценки функционального состояния системы гемостаза.
Это было необходимо с целью: 1) определения исходного уровня тромбофилии, 2) выбора исходно адекватной дозы антикоагулянта и антиагреганта, 3) контроля эффективности и безопасности применения препаратов. Исследование системы гемостаза включало оценку глобальных общеоценочных тестов, активности естественных ингибиторов свертывания, таких как АТ III и протеин С и молекулярных маркеров тромбинемии и фибринообразования – комплексов ТАТ, Д-димера. Глобальные общеоценочные тесты (АЧТВ, ТЭГ, протромбиновое время) позволяли исключить геморрагическую наклонность, что было необходимо при планировании терапии актикоагулянтами у пациенток с генетическими формами тромбофилии, антифосфолипидным синдромом и гипергомоцистеинемией. Результаты исследования представлены в табл. 15 Таблица 15 Показатели гемостазиограммы у пациенток II группы до начала антикоагулянтной терапии Показатели Пациентки II группы, n=85 Контрольная группа, n=50 Группасравнения,n=50 Количество тромбоцитов 1x10% 315+35 (р 0,05) 325+24,0 324+25,2 АЧТВ (сек) 31,6+4,3 (р 0,05) 34,3+5,5 33,8+2,9 АВР (сек) 67,1+3,5 (р 0,05) 65,3+5,2 65,4+4,7 Концентрация фибриногена (г/л) 3,4+1,8 (р 0,05) 3,2+1,1 3,3+1,9 Тромбоэластограмма r+k (мин) ma (мин) ИТП у.е. 14,2+3,5 (р 0,05) 61,2+2,2 (р 0,05) 29,3+5,7 (р 0,05) 17,8+3,2 58,6+3,8 26,4+4,2 17,4+3,7 57,7+2,9 25,9+3,7 AT III (%) 96,1+6,2 (р 0,05) 98,4+8,4 98,2+7,8 АТ III (г/л) 0,275+0,048 (р 0,05) 0,280+0,051 0,279+0,045 Протеин С (%) 105,6+3,2 (р 0,05) 105,4+2,8 105,6+2,5 «Парус»-тест, (НО) 0,65+0,24 (р 0,05) 0,80+0,15 0,81+0,26 ТАТ 1х10-6 г/л 8,50+2,32 (р 0,05) 4,20+1,37 4,30+1,46 Д-димер (мкг/мл) 2,0+1,9 0,5+0,3 0,5+0,2 РАІ-1 (мкМ) 5,75+0,25 4,24+0,22 4,19+0,19 Агрегатограмма (Tma)АДФ 1хЮ-3М (%)АДФ 1хЮ-5М (%)АДФ 1хЮ-7М (%)адреналин 1хЮ-4Мристоцетинарахидоновая кислота 1х10-4Мколлаген (%) 52,3+12,8 (р 0,05) 40,4+3,8 (р 0,05) 32,5+4,4 (р 0,05) 52,2+2,6 (р 0,05) 75,5+8,5 (р 0,05) 42,8+2,4 (р 0,05) 52,1+3,2 (р 0,05) 40,3+2,6 35,5+3,1 30,1+2,8 41,4+3,6 50,1+5,5 43,3+3,6 37,7+2,8 42,1+1,9 36,1+3,2 30,3+2,4 41,7+2,9 52,0+3,4 43,1+3,7 37,5+2,6 р 0,001 В рамках гемостазиологического исследования наряду с оценкой активности естественных ингибиторов свертывания (АТ III и протеин С), нами производилась оценка состояния фибринолитической системы (PAI-1).
Ни в одном случае по данным гемостазиологического исследования не было выявлено повышенной геморрагической наклонности. Количество тромбоцитов было в границах нормы, результаты общеоценочных тестов в группе обследуемых не отличались от таковых в контрольной группе и группе сравнения.
Отмечена высокая агрегационная активность тромбоцитов в среднем по группе, что могло быть обусловлено наличием АФС, а также высокой распространенностью полиморфизма тромбоцитарных гликопротеиновых рецепторов (табл. ).
Более высоким в сравнении с контрольной группой и группой сравнения у пациенток с неудачами ЭКО и тромбофилией был уровень PAI-1. Его средние значения составили 5,75+0,25 (р 0,001). В контрольной группе и группе сравнения 4,24+0,22 и 4,19+0,19 соответственно. Повышение уровня PAI-1, вероятно, было связано с высоким процентом полиморфизма гена PAI-1, в частности с аллелем 4G.
Отмечена дисфункция протеина С в исследуемой группе по данным теста глобальной оценки системы протеина С («Парус»-тест, Технология-Стандарт), о которой свидетельствовал уменьшенный коэффициент НО (нормализованное отношение) - 0,65+0,24 (в сравнении с 0,79+0,14 и 0,80+0,15 в контрольной и группе сравнения соответственно (р 0,001).
Выявлено значительное повышение уровней молекулярных маркеров тромбофилии (ТАТ и Д-Димер), средние значения которых в 2 и более раза превышали таковые в контрольной и группе сравнения. Д-Димер составил в среднем 2,0+1,9 мкг/мл (норма 0,5 мкг/мл), ТАТ - 8,50+2,32 г/л. В контрольной группе и группе сравнения указанные показатели составили: 0,5+0,3 мкг/мл и 0,5+0,2 мкг/мл, 4,23+1,28 г/л и 4,20+1,36 г/л соответственно.
Обсуждение полученных результатов
Индукторы ангиогенеза огромное число самых разнообразных факторов, инициирующих рост сосудов и поддерживающих структуру вновь образованной сосудистой сети. В качестве стимуляторов могут выступать не только ростовые факторы, но и самые разнообразные воздействия: гипоксия, воспалительные изменения тканей и т.д. [11].
Среди этих факторов – сосудистый эндотелиальный фактор роста (СЭФР), продуцируемый в основном клетками эндотелия, является медиатором неоангиогенеза, необходимым компонентом репродуктивных процессов, эмбрионального развития, формирования плаценты.
СЭФР известен также как фактор сосудистой проницаемости или васкулотропин. Он представляет собой гликопротеин с массой 40–50 килодальтон, способствует росту эндотелиоцитов in vitro и индуцирует ангиогенез in vivo. Функционирующие рецепторы с высокой степенью сродства к СЭФР ограничены эндотелиоцитами, в отличие от других ангиогенных факторов [34]. Экспрессия СЭФР в тканях матки и яичников может регулироваться гормональным путем [14, 15]. Установлено, что гипоксия является выраженным стимулятором экспрессии СЭФР подобно тому, как это происходит при активации эритропоэтина [25]. Ряд цитокинов и других ФР, таких как интерлейкин-1, ЭФР, ТФР-b также могут стимулировать экспрессию СЭФР в определенных типах клеток. Выявлено наличие двух видов рецепторов к СЭФР – flt и KDR, которые являются тирозинкиназами и экспрессированны преимущественно на эндотелиальных клетках [72, 78]. СЭФР признан в настоящее время в качестве одного из важнейших факторов, регулирующих процессы инициации и развития ангиогенеза у развивающегося эмбриона [45]. Он относится к числу гепарин-связывающих и широко представлен в тканях репродуктивной системы женщины [20, 57]. Установлено, что СЭРФ может накапливаться в экстрацеллюлярном матриксе 109 и инициировать процессы его ремоделирования [28], являющегося одним из ключевых этапов ангиогенеза. Установлено, что экспрессия СЭФР при беременности осуществляется несколькими компонентами фетоплацентарного комплекса: железистым эпителием, фетальными и материнскими макрофагами, а также цитотрофобластом [62, 65]. Блокирование ангиогенеза при применении ингибиторов пролиферации эндотелия приводит к процессам усиления апоптоза [23]. Прогрессирование беременности невозможно без четкого функционирования сложной сосудистой системы, обеспечивающей адекватный обмен между организмами матери и плода. Дисбаланс продукции факторов роста, ответственных за состояние сосудистой стенки и за ангиогенез плаценты и, соответственно, за ее правильное формирование и развитие, может играть важную роль в патогенезе ряда осложнений беременности, таких как плацентарная недостаточность, синдром задержки роста плода, преэклампсия.
Несомненно, причинно-следственные взаимоотношения между изменением активности факторов роста и нарушении функции плаценты требуют дальнейшего изучения, однако уже сегодня обнаружены изменения экспрессии ангиогенных факторов роста при целом ряде осложнений гестационного процесса. Так, показано наличие достоверного снижения содержания СЭФР в плаценте при беременностях, сопровождающихся ЗВРП [40]. Концентрация рецептора СЭФР у здоровых беременных достоверно превышает его уровень при преэклампсии [79]. L.Selvaggi и соавт. (1995) показали, что децидуальная оболочка от пациенток с преэклампсией стимулировала ангиогенез в хорионаллонтоисной мембране цыплят в значительно большей степени, чем децидуальная оболочка здоровых беременных [58]. На основании данного факта авторы сделали вывод о стимуляции ангиогенеза при преэклампсии. Torry и соавт. (1998) показали снижение концентрации ФРП у беременных с преэклампсией [76].
Результаты ряда клинических исследований свидетельствуют о том, что изучение роли СЭФР при различных видах патологии в акушерстве и гинекологии следует считать актуальным и перспективным с клинической и научно-исследовательской точки зрения [4, 6].
Одной из задач нашего исследования явилось изучение содержания СЭФР в сыворотке крови у женщин с неудачными попытками ЭКО и определение его клинического значения.
Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что при неудачной имплантации плодного яйца уровень СЭФР в сыворотке крови повышен (102,4±36,9 пг/мл, р 0,05) по сравнению с физиологической величиной (42 пг/мл). Уровень сосудистого эндотелиального фактора роста был выше нормы у 58,3% женщин, имеющих неудачи ЭКО, что могло быть следствием хронической формы гипоксии, в том числе в результате тромбофилии. Тромбофилия, как результат гипофибринолиза, эндотелиопатии (следствие гипергомоцистеинемии), циркуляции антифосфолипидных антител может быть одной из причин повышенной продукции СЭФР, стимулирующего пролиферацию клеток, контролирующего развитие и регресс сосудов.
Изменение нормального течения этих процессов может иметь немаловажное значение в нарушении имплантации и плацентации наряду с гипофибринолизом, обусловленным генетическими полиморфизмами и циркуляцией антифосфолипидных антител.