Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Представления о проблеме внутриутробной инфекции на современном этапе развития акушерства (обзор литературы). 10
1.1 Современный взгляд на проблему внутриутробной инфекции. 10
1.2 Роль компонентов врождённого иммунитета в развитии системного воспалительного ответа на территории плода при ВУИ . 21
1.3 Перспективы ранней диагностики ВУИ у беременной и
новорождённого. 28
Глава 2. Материал и методы исследования 33
2.1 Материал исследования 33
2.2 Методы исследования
2.2.1. Общеклинические методы исследования 36
2.2.2. Специальные методы исследования 36
Микробиологическая идентификация бактерий 36
Молекулярно-биологические методы 37
Молекулярно-генетические методы исследования 38
Выделение ДНК 38
Генотипирование 39
Измерение уровней экспрессии мРНК генов 40
Оценка антиоксидантного статуса 42
Определение малонового диальдегида в плазме крови матерей и новорожденных 42
Определение ферментативной активности каталазы в плазме крови 43
Исследование содержания цитоплазматической (SOD1) и
митохондриальной (SOD2) изоформ супероксиддисмутазы в вартоновом студне новорожденных 43
Биохимические методы 44
Функциональные методы исследования 44
Ультразвуковое исследование 44
Допплерометрическое исследование кровотока 44
Антенатальная кардиотокография 45
Морфологические методы исследования 46
2.2.3. Статистические методы 46
2.2.4. Изучение здоровья новорожденных 47
Глава 3. Общая клиническая характеристика обследованных беременных . 49
3.1 Анализ соматического и акушерско-гинекологического анамнеза пациенток, вошедших в исследование 49
3.2 Акушерские исходы 56
3.3 Перинатальные исходы. 58
Глава 4. Собственные результаты 61
4.1 Предиктивная роль клинических, микробиологических и молекулярно генетических маркеров для выявления группы риска по развитию
внутриутробной инфекции 61
Клинические предикторы развития ВУИ. 61
Генетическая предрасположенность к развитию ВУИ 62
Особенности микробиоценоза влагалища беременных перед родами 64
Локальная воспалительная реакция во влагалище беременных перед родами
4.2 Особенности системы антиоксидантной защиты беременных и их новорожденных с реализацией внутриутробной инфекции 68
Глава 5. Обсуждение полученных результатов. 77
Выводы 88
Практические рекомендации 92
Список сокращений: 90
Список литературы 93
- Роль компонентов врождённого иммунитета в развитии системного воспалительного ответа на территории плода при ВУИ
- Общеклинические методы исследования
- Функциональные методы исследования
- Особенности микробиоценоза влагалища беременных перед родами
Введение к работе
Актуальность проблемы
Проблема внутриутробной инфекции (ВУИ) остаётся одной из ведущих в современном акушерстве, приводя к возрастанию таких грозных осложнений, как анте- и интранатальная гибель плода, младенческая заболеваемость и смертность, неблагоприятным отдалённым последствиям для ребёнка (Д.Н. Дегтярев, 2008; А.Н. Стрижаков; 2012 K. 2011).
По данным современных исследований, основная роль в реализации ВУИ отводится иммунологическому ответу матери и плода на воздействие патогена (Г.Т. Сухих, 2008; X.H. 2011; M. 2012).
Под действием длительной инфекционной экспансии наблюдается
нарушение механизмов активации фагоцитов и, как следствие, повышенный,
либо неадекватный возбудителю, ответ, а также снижение активности
антиоксидантных систем приводит к накоплению продуктов перекисного
окисления липидов, белков и нуклеиновых кислот (Л.В. Ванько, 2010; E.H.
Ruber, 2008). Нарушение баланса между системами генерации активных
форм кислорода (АФК) и азота, локализованными преимущественно во
внутренней мембране и матриксе митохондрий, и защитными
антиоксидантными системами, приводит к хроническому повышению уровня АФК и азота в клетках и тканях. Долговременное воздействие АФК и азота на клетки и ткани организма приводит к нарушению тканевого гомеостаза, дисфункции тканей и органов, системным нарушениям на уровне целого организма (A. Agarwal, 2005, E. Biberoglu, 2016).
Особенности иммунологического ответа, программируемого на
генетическом уровне в период гестации, ответственны за реализацию ВУИ и должны лежать в основе предикции и ранней диагностики данного осложнения беременности (А.С. Симбирцев, 2005; C.S. Parry, B.R. Brooks, 2008; G. Sacks, 2010). В последнее десятилетие всё больший интерес исследователей привлекает изучение генетической основы индивидуальных
различий иммунного ответа при инфекционно-воспалительных заболеваниях (M.M. Wurfel, 2005, Li H.H., 2016). Уровень продукции различных цитокинов характеризуется выраженной индивидуальной вариабельностью, что может быть обусловлено генетической предрасположенностью и, в частности, функциональным аллельным полиморфизмом генов цитокинов.
Этим объясняется актуальность поиска новых критериев
прогнозирования внутриутробной инфекции, основанного на изучении клеточных и молекулярно-генетических основ врождённого иммунитета.
Цель исследования Оптимизация прогнозирования врожденной инфекции у новорожденных на основании изучения взаимосвязи показателей врожденного иммунитета и особенностей биоценоза у беременных.
Задачи исследования
-
Выявить особенности соматического и акушерско-гинекологического анамнеза и изучить особенности течения беременности при ВУИ с выделением наиболее значимых факторов риска.
-
Выявить взаимосвязь состояния биоценоза и профиля экспрессии генов цитокинов в эпителии влагалища перед родами у беременных с состоянием здоровья новорожденных и течением раннего неонатального периода у детей с реализацией ВУИ.
-
Оценить уровень активных форм кислорода в ткани вартонова студня, материнской периферической и пуповинной крови новорождённого при внутриутробной инфекции.
-
Установить наиболее значимые молекулярно-генетические предикторы реализации ВУИ.
-
Разработать алгоритм диагностики и прогнозирования ВУИ на основании проведения многофакторного анализа.
Научная новизна
На основании комплексного исследования и математического анализа особенностей анамнеза, течения беременности и показателей врожденного иммунитета беременных выявлены значимые факторы риска и предложена прогностическая модель развития внутриутробной инфекции у плода.
При изучении полиморфизма генов цитокинов и экспрессии цитокинов
в нижних отделах репродуктивного тракта у беременных получены данные,
позволяющие определить вклад факторов врожденного иммунитета в
патогенез внутриутробной инфекции. Установлена прогностическая
значимость полиморфизма генов цитокинов (IL1В: -31Т/Т) в выявлении беременных с предрасположенностью к пониженной активации иммунной системы при воздействии инфекционных агентов.
Исследование особенностей функциональной активности гранулоцитов
периферической крови и ткани вартонова студня, показало что реализация
ВУИ сопровождается снижением способности к продукции нейтрофилами
активных форм кислорода на фоне повышения потребления кислорода и
продукции макроэргических соединений (АТФ) митохондриальным
аппаратом ткани плаценты. Полученные данные свидетельствует об истощении компенсаторно-приспособительных возможностей.
В результате исследования получены новые данные о патогенезе внутриутробной инфекции, отображающие роль механизмов врождённого иммунитета на системном и локальном уровнях.
Практическая значимость Разработан алгоритм ведения беременных, включающий поэтапное клинико-лабораторное обследование. Применение современных методов прогнозирования и ранней диагностики внутриутробной инфекции позволит выявлять группу риска реализации данной патологии и проводить клинико-лабораторный контроль. Обоснована целесообразность превентивного
молекулярно-генетического обследования пациенток для оценки риска ВУИ.
Предложен индивидуальный подход к ведению беременных в зависимости от состоянием биоценоза и локального иммунитета. Внедрение алгоритма диагностики данной патологии в практику акушерских стационаров и перинатальных центров позволит снизить частоту осложнений беременности, перинатальной заболеваемости и смертности.
Положения, выносимые на защиту
-
Основными клиническими предикторами развития внутриутробной инфекции являются: угрожающий выкидыш, ранний токсикоз беременных в I триместре, кандидозный вульвовагинит, плацентарная недостаточность – во II триместре, маловодие, угрожающие преждевременные роды, плацентарная недостаточность в III триместре, а молекулярно-генетическими – наличие у матерей полиморфизма генов IL1B и IL8.
-
Одним из защитных механизмов предотвращения инфицирования плода является активация факторов врожденного иммунитета в ответ на дисбиотические нарушения. Нарушение регуляции локальной воспалительной реакции способствует реализации внутриутробной инфекции.
-
Нарушение баланса систем регуляции генерации активных форм кислорода и локального цитокинового каскада вследствие истощения или генетически обусловленной неполноценности адаптационных ресурсов матери приводит к развитию внутриутробной инфекции.
Личный вклад автора Автор принимала непосредственное участие в выборе направления исследования, постановке задач, клиническом обследовании и лечении пациенток, в сборе биологического материала. Диссертантом проведен анализ медицинской документации, статистическая обработка и научное обобщение полученных результатов.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации соответствуют формуле
специальности 14.01.01 – «акушерство и гинекология». Результаты
проведенного исследования соответствуют области исследования
специальности, конкретно пунктам 1, 2 и 4 паспорта акушерства и гинекологии.
Апробация работы Основные положения работы представлены на конференциях: VI ежегодный всероссийский конгресс по инфекционным болезням (Москва, 2014), III конгресс Евро-азиатского общества по инфекционным болезням (Екатеринбург, 2014), XV Всероссийский научный форум «Мать и дитя» (Москва, 2014), XXI Всероссийский конгресс с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая помощь: от менархе до менопаузы» (Москва, 2014).
Обсуждение диссертации состоялось на конференции сотрудников акушерского обсервационного отделения (13 ноября 2015 года), заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России (7 декабря 2015 года, протокол №11).
Внедрение результатов работы
Результаты проведённого исследования внедрены в практическую деятельность акушерского обсервационного отделения ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России.
По результатам исследования опубликовано 7 научных работ, в том числе 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определённых ВАК.
Структура и объём диссертации
Диссертационная работа изложена на 107 страницах компьютерного
текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав, обсуждения
полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка
литературы, включающего 147 работ, в том числе – 31 отечественных и 116 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 14 рисунками и 9 таблицами.
Роль компонентов врождённого иммунитета в развитии системного воспалительного ответа на территории плода при ВУИ
Одной из основных медико-социальных проблем современного акушерства и перинатологии остаётся внутриутробная инфекция (ВУИ). Встречаясь от 30 до 68% случаев по данным отечественных и зарубежных авторов, ВУИ составляет более 49 % в структуре причин перинатальной смертности. В зависимости от причин возникновения, частота ВУИ может занимать широкий диапазон своей реализации: при воспалительных заболеваниях мочевыводящих органов показатель составляет порядка 34,4%, при нарушении работы органов эндокринной системы – 24%, анемии беременных – 22,7%, угрожающей потере беременности – 7,7%. При привычном невынашивании данное осложнение наблюдается в 47,6 – 77,3% случаев. Среди женщин, перенесших вирусную, бактериальную и/или другую инфекции в период гестации, частота развития ВУИ составляет 55,4-60,0% [4; 16; 46]. Наблюдения за развитием детей, производимые на протяжении последнего десятилетия, [14] позволяют утверждать, что данная патология, резко увеличивая перинатальную заболеваемость и смертность среди новорожденных, в течение первых лет жизни становится основной причиной нарушений физического и умственного развития, повышенной соматической и инфекционной заболеваемости.
Изменение иммунной системы в период гестации, может быть обусловлено повышенным риском инфицирования. Многие латентные инфекции могут активироваться во время беременности. [69] в своей работе наглядно показали, что инфекция является одним из ведущих триггерных факторов запуска системной воспалительной реакции (ССВР) с последующим включением механизмов нарушения тканевого и клеточного дыхания, свёртывания крови, повреждения эндотелия сосудов. В результате запуска данных процессов на системном уровне, развиваются нарушения микроциркуляции в плаценте с последующей манифестацией ПН. При наличии хронических форм инфекции внутриутробное инфицирование плода встречается редко, тогда как осложнения гестационного процесса (самопроизвольные выкидыши, преждевременные роды, ПН, ЗРП, внутриутробная гибель плода) реализуются у каждой третьей беременной [46]. К особенностям патогенеза при инфекционных заболеваниях относят выраженность токсинемии, расстройств метаболизма, циркуляторных нарушений в системе мать-плацента-плод. При этом важное значение имеют такие понятия, как вид возбудителя, его вирулентность, пути проникновения микроорганизмов от матери к плоду, тропизм возбудителя к плаценте, органам и тканям плода. Большое значение имеет сходство между антигенами микро - и макроорганизмов, снижающее биологическую чужеродность инфекта для организма хозяина и реакцию его иммунной системы на присутствие антигена возбудителя. В ряде публикаций, доказан тропизм возбудителей к определённым эмбриональным тканям, являющимся идеальной средой для размножения вирусов и микробов [15; 20].
Особенности течения инфекционного процесса в период гестации влияют на выраженность функциональных и/или структурных изменений в системе фето – плацентарного комплекса (острый процесс или период обострения, стадия ремиссии). Наиболее неблагоприятными являются острый инфекционный процесс и обострение хронического [14; 29]. Несмотря на вышесказанное, на сегодняшний день установлено, что между тяжестью инфекционного процесса у матери и его проявлений у плода отсутствует прямая корреляционная зависимость. Бессимптомная инфекция у матери может привести к антенатальной гибели плода, тогда как тяжелые формы инфекционно – воспалительных заболеваний у беременной могут пройти для плода бесследно.
Одним из ключевых аспектов в реализации ВУИ является гестационный возраст плода на момент его инфицирования. Исходы беременности напрямую зависят от этого фактора, подтверждая теорию критических периодов развития плода. Особую роль играет и длительность воздействия инфекционного агента. ВУИ реализуется в 2-3 раза чаще при повторном и/или длительном инфицировании [21; 23].
Основными путями инфицирования плаценты и плода являются трансплацентарный, восходящий и контактный (интранатальный). В случае проникновения патогена в матку из брюшной полости (например, при остром аппендиците) отмечается редкая форма ретроградного инфицирования. Гематогенный путь инфицирования наблюдается при острых и рецидивирующих вирусных инфекциях, приводящий к развитию аномалий на ранних сроках гестации [70]. Восходящий путь инфицирования типичен для бактериальных инфекций и может наблюдаться как при преждевременном разрыве плодных оболочек, так и при интактности плодного пузыря [55]. При данном пути проникновения инфекции отмечаются явления децидуита, хорионита, хориовасцилита и амнионита. Контактный или интранатальный путь инфицирования может быть реализован как при вирусных (генитальный герпес), так и при бактериальных инфекциях [1; 7; 10].
На сегодняшний день выявлены следующие факторы риска ВУИ: - заболевания мочеполовой системы (пиелонефрит, сальпингоофорит, сальпингит, эндоцервицит); - хронические заболевания ЛОР органов, ХОБЛ, хронические заболевания челюстного аппарата; - отягощённый акушерский анамнез (самопроизвольные выкидыши, мертворождения, привычное невынашивание); - патологическое течение настоящей беременности (угрожающий выкидыш и преждевременные роды, патология околоплодной среды, хирургическая коррекция истмико-цервикальной недостаточности, преждевременный разрыв плодных оболочек, острые или обострение хронических инфекций во время беременности) [25; 82; 107]. К факторам риска ВУИ у новорождённого следует относить: асфиксию средней и тяжёлой степени, недоношенность, ЗРП, пороки развития, неонатальную желтуху [8].
Общеклинические методы исследования
Пробы отделяемого заднего свода влагалища помещались в пробирки с физиологическим раствором с последующим осаждением клеток путем центрифугирования в течение 10 минут при 13000G. В последующем подготовленные среды ресуспендировали в физиологическом растворе (100 мкл).
ДНК выделяли, используя наборы «Проба ГС» фирмы «ДНК-Технология». В основе метода лежит лизис клеток хаотропного агента с последующей сорбцией нуклеиновых кислот на твердом носителе и отмывкой сорбента. После выделения объем образцов составил 100 мкл.
Количественная оценка биоценоза влагалища методом «Фемофлор», разработанной фирмой ДНК-Технология (Россия) включала оценку общей бактериальной массы Lactobacillus spp. и 14 основных групп микроорганизмов. Регистрировалась условно-патогенная флора, включающая факультативные и облигатные анаэробы, грибы. Дополнительно проводилось обследование беременных на наличие абсолютных патогенов (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis и герпесвирусов) коммерческими тест-системами ПЦР фирмы «ДНК-Технология» (Россия).
Амплификацию проводили при помощи прибора «ДТ-964» в режиме “реального времени” (Россия). Уровень флуоресценции оценивали в каждом цикле амплификации по каналам FAM, HEX и ROX. Обработку результатов осуществляли путем использования прилагаемого к приборам программного обеспечения. Критерии формирования лабораторного заключения по результатам исследования методом «Фемофлор». Критерии оценки состояния биоценоза влагалища были разработаны Е.С. Ворошилиной и соавторами. Лабораторное заключение начинали с анализа показателя КВМ (контроля взятия материала). Показатель отражал количество клеток ДНК человека, выделенных из исходного биологического материала. Оценка результатов исследования строилась на вычислении величины КВМ превышающей 104 ГЭ/образец. Все полученные в ходе исследования образцы были валидными по этому показателю.
Величина ОБМ (общая бактериальная масса как показатель обсемененности биотопа) у женщин репродуктивного возраста должна быть более106ГЭ/образец. При ОБМ менее 106 ГЭ/образец соотношение микроорганизмов может определяться с большой погрешностью.
В последующем проводилась интерпретация результатов исследования вагинального биоценоза, полученных методом ПЦР-РВ. Заключение «нормоценоз» выставлялся при доле лактобактерий более 90% от общей бактериальной массы (ОБМ), условно-патогенных аэробных и анаэробных микрооганизмов менее 10% от ОБМ, а абсолютного количества грибов рода кандида и микоплазм, не превышавших 104 ГЭ/образец. За «относительный нормоценоз» принимали случаи содержания лактобактерий составляющих более 90% от ОБМ, микоплазмы и/или грибы рода Candida в количестве, превышающем 104 ГЭ/образец. За случаи «умеренного аэробного дисбиоза» или «умеренного анаэробного дисбиоза» принимали снижение доли лактобактерий от 20 до 90% от ОБМ и увеличение доли аэробов или анаэробов. При выявлении доли лактобактерий ниже 20% от ОБМ и резком увеличении доли анаэробов образцы оценивали, как «выраженный анаэробный дисбиоз», при увеличении доли аэробов – «выраженный аэробный дисбиоз».
Молекулярно-генетические методы исследования Выделение ДНК ДНК выделяли путем модифицированного метода Higuchi (R.Higuchi, H.Erlich, 1989). В образцы крови объемом 0,5 мл в качестве антикоагулянта добавляли EDTA и смешивали в пробирках типа Эппендорф с 0,5 мл лизирующего раствора (0,32М сахарозы, 10 мМ Трис-HCl рН 7,5, 5 мМ MgCl, 1% Тритона Х-100). Далее пробирки центрифугировали на протяжении 1 мин. при 10000 об/мин и удаляли супернатант. Клеточные ядра, выделенные после проведенной подготовки, отмывали буфером два раза. Далее в 50 мкл буферного раствора (50мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl рН 8,3, 2,5мМ MgCl, 0,45% NP40, 045% Твина 20 и 250 мкг/мл протеиназы К) при 37С в течение 20 мин проводился протеолиз. Протеиназу К инактивировали в течение 20 мин. при температуре 98С. Хранение образцов ДНК до типирования осуществлялось при температуре -20С. Конечная концентрация ДНК в среднем составила 50-100 мкг/мл.
Амплификацию и первичную обработку результатов осуществляли по описанной выше технологии. Генотипирование
Модифицированный метод «примыкающих проб» (adjacent probes, kissing probes) использовали для определения замен одиночных нуклеотидов.
Для идентификации замен одиночных нуклеотидов на первом этапе использовали метод ПЦР с общими для обоих вариантов нуклеотидной последовательности праймерами. После понижения температуры реакционной смеси для определения варианта последовательности использовали два типа олигонуклеотидов, гибридизующихся на матрицу рядом. Затем флуорофором метили первый тип олигонуклеотидов, гасителем флуоресценции – второй.
С целью повышения чувствительности тест-систем применялась блокированную специфическими антителами Taq-полимераза. В процессе генотипирования применяли олигонуклеотид с гасителем флуоресценции и сиквенс-специфичные олигонуклеотиды. Метка различными флуорофорами позволяла определять оба варианта олигонуклеотидных проб, соответствующих тому или иному варианту последовательности, в одной пробирке. Далее в режиме реального времени проводили измерение уровня флуоресценции в ходе температурной денатурации дуплексов олигонуклеотидов и полученных матриц. Путем анализа кривых плавления определялся генотип. ПЦР и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили на детектирующем амплификаторе ДТ-964 фирмы «НПО ДНК-Технология» (Россия).
Определение полиморфных локусов генов цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-1b, ФНО, TLR2, TLR4, TLR9) проводилось из образцов биологических сред матерей и их новорожденных детей.
У пациенток изучено распределение аллелей и генотипов следующих полиморфных локусов: IL6R: 1510 (1073) A C (Asp358Ala), IL6: -174 C G, IL10 -592 A C, TLR9: -1486 T C, IL8: -251 A T, IL1A: -889 C T, IL1B: -31 T C, TNF: -308 G A, TNFA: -238 G A, IL4: -590 C T, IL10: -592 A C, IL4R: 1902 A G (Gln576Arg). Измерение уровней экспрессии мРНК генов
Измерение уровней экспрессии мРНК генов ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-1b, TLR2, TLR4, TLR9 и 4 референсных генов B2M, TBP, GUSB, HPRT1 проводилось коммерческими реактивами (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) методом количественной полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени с предварительной стадией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) согласно инструкции производителя в лаборатории молекулярно-генетических методов (рук. д.б.н. Д.Ю.Трофимов). С целью исключения отжига на матрице геномной ДНК исследуемых и референсных генов праймеры и зонды для ПЦР были подобраны с учетом структуры генов. Это дало возможность исключить дополнительный этап обработки ДНК-азой нуклеиновых кислот.
Реакции амплификации целевых и референсных генов ставили в двух повторах. С целью повышения чувствительности и специфичности метода ПЦР был применен парафин.
Взятие биоматериала осуществлялось аспирационной кюреткой Пайпель де Корнье. Во избежание деградации сразу после взятия материал помещали в пластиковую пробирку объёмом 1,5 мл, в которую предварительно внесено 500 мкл транспортной среды для стабилизации РНК (ПРОБА–НК).
Функциональные методы исследования
В последние годы рядом авторов в патогенезе развития внутриутробной инфекции плода (ВУИ) важная роль отводится синдрому системного воспалительного ответа (ССВО), вызывающему комплекс метаболических расстройств в организме матери. Метаболические нарушения приводят к изменению как белкового и липидного спектров крови, так и стационарной концентрации активных форм кислорода и азота вследствие нарушения равновесия между про- и антиоксидантными процессами в периферической крови и тканях [72], [147], [93]. Однако, на сегодняшний день недостаточно данных, позволяющих определить вклад процессов, контролирующих окислительный стресс в системе «мать – плацента – плод», в индукцию развития ВУИ.
Известно, что даже физиологическая беременность характеризуется развитием состояния окислительного стресса, являющегося одним из центральных механизмов общей адаптации организма женщины к новым условиям, при которых наблюдается поддержание равновесия между прооксидантной и антиоксидантной системами на фоне параллельного повышении активности обоих процессов [[124], [5]]. Однако, на разных этапах гестации, подобное равновесие может нарушаться. К примеру, при физиологически протекающей беременности в период формирования артериальной циркуляции и увеличения напряжения кислорода в плаценте возникает состояние окислительного стресса, выполняющего роль триггера механизмов дифференцировки клеток, морфо- и органогенеза [5], [68]. В кратковременный период относительного дисбаланса между генерацией и элиминированием активных форм кислорода (АФК) происходит адаптация механизмов системы антиоксидантной защиты к сдвигу физиологического равновесия. Последующее нарушение этой адаптации приводит к неспособности системы антиоксидантной защиты противостоять нарастающим процессам свободнорадикального окисления, что приводит к значительному ослаблению не только детоксифицирующей, но и метаболической функции плаценты [[56], [89], [36]].
Несмотря на высокую актуальность, на сегодняшний день до конца не изучена роль генерации активных форм кислорода и антиоксидантной системы в формировании метаболических и детоксифицирующих функций плаценты при ВУИ.
Вышеизложенное делает очевидной необходимость дальнейшего изучения этиологии и патогенеза развития ВУИ плода, в частности, характера системных метаболических расстройств в системе «мать – плацента – плод».
До настоящего времени принято выделять группу беременных высокого инфекционного риска. В связи с чем была сформирована группа исследуемых пациенток, критериями включения в которую послужили общепринятые в последние годы факторы риска.
В исследование было включено 47 беременных и новорожденных детей. В результате проведённого клинико – лабораторного обследования беременных, изучения данных соматического и гинекологического анамнезов, паритета, данных амбулаторной и обменной карт о протекании данной беременности, данных детской истории о состоянии новорожденного и клинико – лабораторных показателей ребёнка, были определены критерии включения в группы для беременных и новорожденных. Все пациентки были ознакомлены c целью исследования и подписали добровольное информированное согласие в своем участии.
При изучении состояния здоровья беременных с анализом особенностей соматического и гинекологического анамнеза в основной группе было выявлено достоверное увеличение частоты хронического пиелонефрита (n=4, (18,2%) p 0,05) и хронического цистита (n=3, (13,6%) p 0,05), тогда как в группе сравнения частота хронического пиелонефрита составила 9,1% (n=2). В структуре гинекологических заболеваний в I группе отмечалось достоверное увеличение хронического цервицита (n=11, (50,0 %) p 0,05), бесплодия (n=3, (13,6 %) p 0,05) и наличия в анамнезе двух и более медицинских абортов до 12 недель (n=7, (31,8 %) p 0,05).
При анализе спектра возможных возбудителей исходной инфекционно-воспалительной заболеваемости в основной группе достоверно чаще выявлялись хроническая рецидивирующая герпетическая инфекция (n=5, (22,7%) p 0,05) и кандидозный вульвовагинит (n=6, (27,3%) p 0,05).
Проведение анализа акушерских и перинатальных исходов выявило в первом триместре настоящей беременности у пациенток основной группы достоверное увеличение угрозы выкидыша (n=13, (59,1%) p 0,05). При анализе инфекционно-воспалительной заболеваемости I триместра среди пациенток основной группы достоверно чаще выявляли бактериальный вагиноз (n=4, (18,2%) p 0,05). Во II триместре у пациенток в I группе в 13,6% случаев (n=3, p 0,05) отмечалось формирование истмико – цервикальной недостаточности (ИЦН) и плацентарная недостаточность (ПН) (n=4, (18,2%) p 0,05) и анемия беременных (n=5, (22,7%) p 0,05). В группе сравнения во II триместре также отмечались ИЦН (n=1, 4,0%) и анемия беременных (n=1, 4,0%), не достигшие статистической значимости (p 0,05). Из особенностей течения III триместра беременности следует отметить достоверное увеличение в I группе анемии беременных – 27,3% (n=6, p 0,05), патологии околоплодных вод: маловодие (n=4, (18,2%) p 0,05) и ПРПО (n=9, (40,9 %) p 0,05), ЗРП (n=6, (22,7%) p 0,05). Во II группе в последнем триместре были выявлены такие осложнения, как маловодие (n=1, 4,0%), ПРПО (n=3, 12,0%) и анемия беременных (n=2, 8,0%), не достигшие статистической значимости (p 0,05).
Послеродовый период у пациенток основной группы в 13,6% (n=3) случаев протекал с осложнениями: диагностировали субинволюцию матки (p 0,05).
По данным изучения результатов исхода родов для плода у детей I группы чаще диагностировалась асфиксия (n=7, 31,8%), неонатальная желтуха (n=8, 36,4%), внутриутробная недостаточность питания (n=4, 18,2%) и задержка внутриутробного развития (ЗВУР) (n=2, 9,1%) (p 0,05). Учитывая данные клинического обследования пациенток основной группы, относящие их к группе высокого инфекционного риска, интерес представляло дальнейшее исследование в данной когорте факторов врожденного иммунитета, обуславливающих ответ на влияние инфекционного агента на систему «мать – плацента – плод». С этой целью у пациенток, включенных в исследование, и их новорожденных была проведена оценка возможностей антиоксидантной защиты первой линии.
При определении уровня маркера перекисного окисления липидов в плазме крови не было выявлено достоверных различий для измеренных средних значений между группами I и II как для матерей (15,02±1,42 / 15,12±1,02, p=0.95), так и для новорожденных (12.36±0.43/13.52±0.86, p=0.25). Кроме того, различия содержания МДА в крови матери и ребенка также были недостоверны для обеих групп.
Для исследования причины отсутствия различий в уровне маркера окислительного стресса для групп I и II была проведена оценка активности антиоксидантных ферментных систем в плазме крови матери и новорожденного, а также в ткани пуповины новорожденных.
В образцах плазмы крови беременных с реализацией ВУИ было обнаружено достоверное увеличение ферментативной активности каталазы (р 0,009) (рис. 4.2.1), принимающей участие в контроле уровня перекиси водорода – относительно стабильного интермедиата в цепи свободно-радикальных реакций образования продуктов неполного восстановления кислорода. В то же время, не обнаружено достоверных различий в уровне активности каталазы в плазме крови новорожденных обеих групп.
Особенности микробиоценоза влагалища беременных перед родами
К факторам риска развития ВУИ следует относить возраст матери и ее вредные привычки, очаги инфекции и эктрагенитальная патология беременной, отягощенные акушерского–гинекологический анамнез и течение беременности [12; 24; 30; 79]. Учитывая выше сказанное, был выполнен расширенный анализ общей клинической характеристики беременных, включенных в исследование.
Возраст беременных варьировал в диапазоне от 18 до 41 года и в среднем составил 31,4±0,5 и 28,4±0,5 лет соответственно по группам. В I группе количество пациенток старше 36 лет (17,5%) превалировало, тогда как пациенток в возрасте от 18 до 23 лет было выявлено всего 6,3% (р 0,05).
Был выполнен анализ показателей, характеризующих состояние здоровья исследуемых беременных, и выявлены особенности соматического и гинекологического анамнезов.
В группах были выявлены различия в частоте перенесенных инфекционных заболеваний в детстве: в I группе достоверно чаще отмечались скарлатина (24,0%) и ангина (46,0%) (р 0,05). Также у пациенток основной группы имело место достоверное увеличение частоты хронических заболеваний ЛОР-органов - 33,8% (р 0,05). Jedrychowski W. et al. на основании исследования когорты из 468 детей сделали вывод о значительном вкладе заболеваний верхних дыхательных путей их матерей в период гестации в последующее формирование хронических заболеваний ЛОР-органов у потомства. Бремя респираторных симптомов в раннем детстве и, возможно, в более позднем возрасте может быть запрограммировано уже во время беременности, когда происходит закладка и формирование дыхательной системы [81]. По данным ряда отечественных авторов хронические инфекционные заболевания ЛОР-органов у беременных ассоциированы с последующей реализацией ВУИ у их новорожденных [7; 14; 29]. При изучении состояния здоровья исследуемых беременных с анализом особенностей соматического и гинекологического анамнеза было выявлено, что среди заболеваний мочевыделительной системы в I группе отмечалось достоверное увеличение частоты хронического пиелонефрита (n=14, 17,5%) (OR= 1,9 (1,1-3,3), p 0,05) и хронического цистита (n=13, 16,3%) (OR=1,8 (1,0-3,3), p 0,05). В группе контроля частота хронических заболеваний мочевыделительной системы составила 10,0% (n=10) для хронического пиелонефрита и 9,0% (n=9) для хронического цистита.
В 2014г Vogel JP et al опубликовали данные своего исследования, указывающие на вклад гестационного пиелонефрита в развитие таких неблагоприятных перинатальных исходов, как асфиксия в родах, мертворождения, ранняя неонатальная смерть, ассоциированная с реализацией инфекции, и низкий вес при рождении [137]. Эти данные согласуются с выводами Kladensk J., указывающими на связь мочевой инфекции во время беременности и рождения детей с низкой массой тела и высоким уровнем неонатальной смертности от ряда инфекционных осложнений [90].
При изучении структуры гинекологической заболеваемости в нашем исследовании было отмечено достоверное увеличение в I группе хронического цервицита (n=41, 51,3 %), (OR= 1,5 (1,0-2,4), p 0,05) и бесплодия (n=9, 11,3 %), (OR= 1,5 (1,0-2,4), p=0,049). Интересным является более частое выявление в I группе хронического эндометрита (8,8%).
Полученные результаты согласуются с исследованиями отечественных и зарубежных авторов, выделяющие хронические воспалительные заболевания органов малого таза, как один из ведущих триггерных факторов реализации ВУИ [26; 29; 59].
При проведении анализа акушерского анамнеза в основной группе было отмечено наличие в анамнезе двух и более медицинских абортов до 12 недель (n=27, 33,8 %), (OR= 1,5 (1,0-2,4), p=0,013) и неразвивающаяся беременность (n=11, 13,8 %), (OR=2,1 (1,1-4,4), p 0,05). Особый интерес среди пациенток с реализацией ВУИ представляло выявление осложнений настоящей беременности.
Среди пациенток I группы первый триместр беременности достоверно чаще осложнялся угрозой прерывания (n=48 60,0%),(OR=2,7 (1,8-2,1), p 0,05) и ретрохориальной гематомой (по данным УЗИ) (n=5 6,3%), (OR=4,4 (1,2-16,4), p 0,05).
Был проведен анализ инфекционно-воспалительной заболеваемости и спектра возбудителей. У пациенток I группы – преобладал бактериальный вагиноз (n=14, 17,5%) (OR= 1,9 (1,0-3,7), p=0,04).
Во II триместре у пациенток в I группе чаще отмечалось формирование истмико – цервикальной недостаточности (ИЦН) в 10,0% случаев (n=8, OR=2,3 (1,0-5,6), p 0,05), потребовавшей проведения хирургической коррекции, и ПН (n=15, 18,8%) (OR=11,0 (3,8-32,1), p 0,05), активация внутрисосудистого свёртывания крови (n=7, 8,8%), (OR=9,6 (2,2-43,0), p 0,05) и анемия беременных (n=17, 21,3%) (OR= 6,0 (2,8-13,0), p 0,05). В группе контроля во II триместре также отмечались ИЦН (n=5, 5,0%), активация свертывания крови (n=1, 1,0%), анемия беременных (n=5, 5,0%), не достигшие статистической значимости (p 0,05).
Из особенностей течения III триместра беременности следует отметить преобладание в I группе анемии беременных – 25,0% (n=20, OR=3,1 (1,8-5,7), p 0,05), перенесенной ангины (n=5, 6,3%), (OR=2,1 (1,1-4,4), p=0,023), патологии околоплодных вод в виде маловодия (n=15, 18,8%) (OR=8,8 (2,0-39,9), p=0,002) и ПРПО (n=34, 42,5 %), (OR=4,1 (1,1-14,4), p=0,023), ЗРП (n=26, 32,5%) (OR=45,8 (10,9-19,0), p 0,05), преэклампсии (n=8, 10,0%) (OR=2,7 (1,1-6,5), p 0,05). Во II группе в последнем триместре были выявлены такие осложнения, как маловодие (n=4, 4,0%), ПРПО (n=16, 16,0%), преэклампсия (n=4, 4,0%), анемия беременных (n=10, 10,0%), не достигшие статистической значимости (p 0,05).