Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Молекулярные маркеры цервиковагинальной жидкости в диагностике и прогнозировании заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека (обзор литературы) 9
1.1 ВПЧ-ассоциированные заболевания шейки матки 11
1.2 Цервиковагинальная жидкость и ее значение при различных состояниях женского репродуктивного тракта 12
1.3 Роль цервиковагинальной жидкости в диагностике и прогнозировании ВПЧ ассоциированных поражений шейки матки 15
Глава 2. Материал и методы исследования 19
2.1 Материал исследования 19
2.2 Методы исследования 20
2.3 Методы статистической обработки 32
Глава 3. Результаты собственных исследований 37
3.1 Клиническая характеристика обследуемых женщин 37
3.2 Результаты цитологического исследования 43
3.3 Результаты ВПЧ-типирования 46
3.4 Результаты расширенной кольпоскопии 49
3.5 Результаты морфологических методов исследования 51
3.6 Результаты анализа протеомного состава цервиковагинальной жидкости 52
3.7 Определение уровня экспрессии мРНК функциональных генов человека 68
3.8 Результаты лечения пациенток с CIN 73
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 75
Выводы 86
Практические рекомендации 87
Список сокращений 88
Список литературы 89
- Роль цервиковагинальной жидкости в диагностике и прогнозировании ВПЧ ассоциированных поражений шейки матки
- Клиническая характеристика обследуемых женщин
- Результаты анализа протеомного состава цервиковагинальной жидкости
- Определение уровня экспрессии мРНК функциональных генов человека
Введение к работе
Актуальность темы исследования
В течение последних десятилетий отмечается значительный рост ВПЧ-ассоциированных заболеваний шейки матки у женщин репродуктивного возраста, исходом которого нередко является малигнизации процесса. Известно, что РШМ занимает одну из лидирующих позиций в структуре онкологических заболеваний и смертности у женщин, что является важной медицинской и социальной проблемой. По данным ВОЗ, ежегодно в мире выявляются 493,2 тысячи новых случаев рака шейки матки (РШМ). РШМ предшествуют цервикальные интраэпителиальные неоплазии, различной степени тяжести (LSIL, HSIL), частота прогрессии которых в рак шейки матки составляет 40-45% (Torre L.A. et al., 2015).
Вирус папилломы человека (ВПЧ) высокого онкогенного риска является главным этиологическим фактором развития неоплазий и рака шейки матки. При персистенции ВПЧ высокого канцерогенного риска в течение 3 лет у 27% женщин развиваются цервикальные интраэпителиальные неоплазии тяжелой степени(HSIL) (Ашрафян Л. А. и др., 2016).
Степень разработанности темы исследования
В настоящее время современные исследования в области поиска эффективных методов диагностики ВПЧ-ассоциированных заболеваний шейки матки фокусируют свое внимание на молекулярно-биологических методах исследования и анализе белкового состава различных биологических жидкостей. В последнее десятилетие для поиска различных биомаркеров все чаще используют постгеномные методы анализа, в том числе протеомные, при помощи которых подробно изучают белковый состав различных жидкостей таких, как кровь, цервиковагинальная жидкость (ЦВЖ), ликвор, моча методом масс-спектрометрии. et al., 2017; R.A.Siciliano, 2014). Масс-спектрометрия (МС) – метод анализа вещества путем
определения отношения массы к заряду и относительного количества ионов, получаемых при ионизации и фрагментации исследуемого вещества (Д.И.Писарев, 2012). В клинической практике с использованием МС и протеомных методов были предложены панели для диагностики рака яичников (H.Wang, 2011), молочной железы (M.Pietrowska, 2009), легких (L.De Petris, 2010). Изучение протеомного состава ЦВЖ может не только помочь диагностировать ВПЧ-ассоциированные заболевания шейки матки, но и объяснить причины их развития, а также в перспективе оказаться важным шагом в разработке новых методов и схем лечения (А.В.Сорокина, 2011).
ЦВЖ имеет огромное значение в поддержании гомеостаза и в
иммунной защите женского полового тракта. В виду простоты забора
материала для исследования и благодаря изобилию молекулярного состава,
ЦВЖ представляет большой интерес для изучения. Известно, что белковый
состав ЦВЖ подвергается изменению при различных заболеваниях
генитального тракта женщины, следовательно, ВПЧ-инфекция и
ассоциированные с нею заболевания (CIN и РШМ), также оказывают
влияние на ее состав. В этой связи белковый состав ЦВЖ можно
рассматривать как источник биомаркеров ряда гинекологических
заболеваний, в том числе и при неопластических процессах шейки матки.
Все вышеизложенное послужило основанием для проведения настоящего исследования, посвященного совершенствованию тактики ведения женщин с заболеваниями шейки матки, ассоциированными с вирусом папилломы человека, на основании изучения и анализа протеомного состава ЦВЖ методом масс-спектрометрии, молекулярно-генетических маркеров неопластической трансформации для оценки риска развития и прогрессии CIN.
Цель исследования: Повышение эффективности и прогностической значимости ранней диагностики ВПЧ-ассоциированных заболеваний шейки матки у женщин репродуктивного возраста на основе изучения клинических, молекулярно-генетических методов и особенностей протеомного состава цервиковагинальной жидкости.
Задачи исследования:
-
Провести сравнительный анализ встречаемости различных типов ВПЧ и вирусной нагрузки при различных формах поражения эпителия шейки матки.
-
Изучить особенности изменения состава и уровня экспрессии белков ЦВЖ при различных формах поражений шейки матки в сравнительном аспекте.
3. Провести мониторинг пациенток с «малыми» поражениями эпителия
шейки матки (ASCUS, LSIL) с комплексной оценкой динамики процесса
(прогресс/регресс) при помощи клинических, молекулярно-генетических,
протеомных методов исследования.
4.Выявить белки-маркеры ЦВЖ для дифференциальной диагностики степени тяжести поражений шейки матки (HSIL и РШМ). Создать диагностическую панель белков.
5. Разработать панель белков для пациенток с ВПЧ-ассоциированными поражениями эпителия шейки матки с учетом сравнительного анализа протеомного состава ЦВЖ.
Научная новизна
Проведено изучение протеомного состава цервиковагинальной
жидкости методом масс-спектрометрии при ВПЧ-ассоциированных
заболеваниях шейки матки у женщин репродуктивного возраста. Выявлено отличие в профилях экспрессии белков ЦВЖ и определены маркеры предраковых поражений шейки матки.
Определены специфические белки-маркеры ЦВЖ (ANXA1, ANXA2; ANXA2P2, SLPI, FBLN1, IL1RN, KLK6, PIGR, S100A9, CSTA, IGHA1, SERPINB13, SPRR1A, CAST, GM2A, SPINK5, SBSN, ACTG1, SERPINB1, CEACAM5, CRISP3, SPRR3), характерные для различных форм ВПЧ-ассоциированных поражений шейки матки (ASCUS, LSIL и HSIL). Определены специфические белки-маркеры ЦВЖ при «малых» поражениях эпителия шейки матки для прогнозирования течение процесса и выявления групп с высоким риском развития CIN и РШМ (ANXA2; ANXA2P2, S100A9, CSTA, SBSN, ACTG1, SERPINB1, CRISP3). Для ранней диагностики тяжелой степени предрака и рака шейки разработана панель белков ЦВЖ: CTSV, CLU, SPRR1A, SPRR1B, CRISP3, H1F0, IVL, LYPD3, SERPINB3, SPINK7, SPRR2D, SPRR3, SBSN, TXN.
Теоретическая и практическая значимость работы Определена практическая значимость оценки белкового состава ЦВЖ в ранней диагностике ВПЧ-ассоциированных заболеваний шейки матки у женщин репродуктивного возраста. Разработан неинвазивный подход определения биомаркеров цервиковагинальной жидкости для ранней диагностики CIN и рака шейки матки.
Разработана панель белков-маркеров ЦВЖ для прогнозирования развития CIN у пациенток с «малыми» поражениями шейки матки и доказана целесообразность их включения в комплексное обследование. Для выявления пациенток с высоким риском развития рака шейки матки создана панель белков-маркеров ЦВЖ, определяющих тяжелую степень неоплазий. Разработана профилактическая тактика ведения ВПЧ-позитивных женщин с учетом анализа белкового состава ЦВЖ.
Методология и методы исследования В работе использованы следующие методы диагностики ВПЧ-ассоциированных заболеваний шейки матки: клинический осмотр (жалобы,
анамнез, гинекологический статус), цитологическое исследование шейки
матки, расширенная кольпоскопия, гистологическое исследование
биопсийного материала (по показаниям), молекулярно-биологические
методы (ВПЧ-генотипирование (21 тип) с определением вирусной нагрузки с
помощью ПЦР в режиме реального времени), изучение уровня экспрессии
мРНК функциональных генов человека (p16, Ki67, PGR, BCL2).
Исследование проводилось на базе научно-поликлинического отделения
“НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова” Минздрава России (зав. отделением –
д.м.н., профессор Прилепская В.Н.). Протеомный анализ образцов ЦВЖ
осуществлялся с помощью метода высокоэффективной жидкостной
хроматографии с тандемной масс-спектрометрией в отделе системной
биологии в репродукции ФГБУ «НМИЦ АГП им.В.И. Кулакова» МЗ РФ (зав.
– к.ф.-м.н. В.Е. Франкевич), а также в лаборатории масс-спектрометрии
биомакромолекул ЦКП "Новые материалы и технологии" ИБХФ РАН (зав.
лаб. – д.ф.-м.н. Е.Н. Николаев). Идентификация белков и
полуколичественный анализ проводился по базе данных Uniprot human с помощью программы MaxQuant (version 1.5.3.30). Для идентификации пептидов использовались следующие параметры поиска: расщепление трипсином, вариабельные модификации - окисление метионина, точность масс для иона-предшественника - 20 м.д., точность масс для MS/MS фрагментов – 0,50 Да, минимальная длинна пептида 5 аминокислотных остатков, частота ложно положительных идентификаций (FDR) 0.01, минимальный скор (score) для немодифицированных пептидов 20, для модифицированных 40. Полуколичественные результаты для каждого идентифицированного в образце белка были получены методом c выравниванием хроматограмм по времени выхода пептидов и нормировкой на суммарную интенсивность. Статистическая обработка протеомных данных проводилась с помощью критерия Краскела-Уоллиса, а также критерия Манна-Уитни с поправкой Бонферрони.
Положения, выносимые на защиту
1. Протеомный состав цервиковагинальной жидкости у ВПЧ-
позитивных пациенток имеет отличный профиль экспрессии белков от
состава здоровых женщин. При ВПЧ-ассоциированных заболеваниях шейки
матки выявлены специфические белки-маркеры, позволяющие определять
легкую, тяжелую степень поражения эпителия и рак шейки матки, что
позволяет дифференцированно подходить к дальнейшей тактике ведения
больных.
-
Определены специфические белки-маркеры в цервиковагинальной жидкости у пациенток с «малыми» поражениями эпителия шейки матки, позволяющие прогнозировать течение процесса и выявлять пациенток с высоким риском развития цервикальной интраэпителиальной неоплазии и рака шейки матки (ANXA2; ANXA2P2, S100A9, CSTA, SBSN, ACTG1, SERPINB1, CRISP3). При выявлении риска рекомендуется сокращение сроков скрининга или проведение кольпоскопии и биопсии шейки матки.
-
Наличие в цервиковагинальной жидкости белков: CTSV, CLU, SPRR1A, SPRR1B, CRISP3, H1F0, IVL, LYPD3, SERPINB3, SPINK7, SPRR2D, SPRR3, SBSN, TXN и WFDC2 коррелирует с результатами цитологии, наличием ВПЧ высокого канцерогенного риска и выраженными изменениями при кольпоскопии только у пациенток с тяжелыми поражениями эпителия шейки матки (HSIL) и может быть использован в качестве диагностического маркера в выявлении группы риска по развитию рака шейки матки.
Апробация результатов
Диссертационная работа обсуждена на межклинической конференции 30.08.2017 и на заседании апробационной комиссии ФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова” Минздрава России (07 сентября 2017г., протокол №10)
Основные положения диссертации и результаты работы представлены
и доложены на международных и российских конференциях: X Юбилейном
Международном конгрессе по репродуктивной медицине. (Москва, 19–22
января 2016 года), XXIX Международном конгрессе с курсом эндоскопии
Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний
(Москва 7–10 июня 2016 года), The 30 th Anniversary Symposium of the protein
Society (USA, Boston, 16-19 july 2016), MSACL 2016 EU 3rd Annual Congress.
Salzburg, AUSTRIA (September 12-15, 2016), е «Мать и дитя» Форум Мать и дитя – Москва (27-30
сентября 2016) , XI Международный конгресс по репродуктивной медицине
(Москва, 17–20 января 2017), XXX Юбилейного международного конгресса
"новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний"
с курсом эндоскопии (Москва, 06–09 июня 2017 года), XXIII Всероссийском
конгрессе с международным участием «амбулаторно-поликлиническая
помощь в эпицентре женского здоровья» (Москва, 4-6 апреля 2017),
«Мать и дитя» (Москва, 27-
28 сентября 2017), Eurogin 2017 (Амстердам, 8-11 октября 2017), II
Национальный научно-образовательный конгресс «Онкологические
проблемы от менархе до постменопаузы» (Москва, 14-16 февраля 2018).
Личный вклад автора Автор принимал участие в выборе направления исследования, разработке цели, постановке задач, клинико-лабораторном обследовании пациенток, сборе биологического материала, лечении, в оформлении и
проведении анализа медицинской документации, в статистической обработке и научном обобщении полученных результатов.
Соответствие диссертации паспорту полученной специальности Научные положения диссертации соответствуют специальности 14.01.01 – «акушерство и гинекология», полученные результаты соответствуют области исследования по специальности, пунктам 3, 4, 5 паспорта акушерства и гинекологии.
Внедрение результатов исследования в практику
Алгоритм ведения пациенток с ВПЧ-ассоциированными заболеваниями
шейки матки, основанный на результатах исследования используется в
практической деятельности врачей акушеров-гинекологов научно-
поликлинического отделения ФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова” Минздрава России.
По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, из них 5 - в рецензируемых научных журналах.
Структура и объем диссертации
Роль цервиковагинальной жидкости в диагностике и прогнозировании ВПЧ ассоциированных поражений шейки матки
Группой Venkataraman N. [41] впервые был исследован белковый состав ЦВЖ и доказана роль ЦВЖ в защите организма от вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Авторы показали, что в ЦВЖ проявляется анти-ВИЧ активность, формирование которой обеспечивается синергичным действием множества белков и пептидов, в частности кальгранулина А/B, лизоцима, человеческого нейтрофильного пептида, елафина и некоторых гистонов.
Di Quinzio и соавторы исследовали фракции белков ЦВЖ 5 женщин в 3 триместре беременности с целью прогнозирования начала предстоящих родов. Авторы выделили 15 белков, присутствующих во всех образцах ЦВЖ [42]. Функции этих белков связаны с процессами кровообращения, структурной целостности, метаболизма жирных кислот, связыванием кальция, воспалительного ответа. В результате была создана панель белков-маркеров преждевременного разрыва плодных оболочек [43]. При анализе фракций белков ЦВЖ весом 25-45 кДа у беременных женщин за 14-17, 7-10 и 0-3 дня до родов и во время родов были обнаружены изменения в экспрессии пяти белков (серпин Б3, серпин Б1, аннексин А3, коллаген альфа-2 IV типа и альбумин), которые коррелируют с естественными изменениями, характерными для преждевременных родов [43].
Dasari S. с коллегами провел полный протеомный анализ ЦВЖ [44]. В результате идентифицировано 150 белков, большинство из которых выполняют иммунные, защитные или метаболические функции, из них 77 белков оказались уникальными по сравнению с белками крови и амниотической жидкости. Оказалось, что экспрессия 28 белков ЦВЖ отличается у женщин с угрожающими преждевременными родами. Из них 17, которые были подтверждены методом дифференциального двумерного электрофореза (2D-DIGE), могут рассматриваться в качестве потенциальных биомаркеров спонтанных преждевременных родов [45].
Полномасштабный протеомный скрининг ЦВЖ, выполненный группой Shaw JL высокочувствительными методами двумерной хромато-масс-спектрометрии, обнаружили более 680 белков в ЦВЖ, причем представленность белков калликреиновой группы была ассоциирована с риском преждевременного разрыва оболочек плодного пузыря. Данные белки принимают участие в отшелушивании вагинальных эпителиальных клеток и активации цервиковагинальных антимикробных белков. Экспрессия цервиковагинального калликреина связана с преждевременным разрывом оболочек плодного пузыря [46].
Группой Tang LJ была продемонстрирована возможность активации полиморфноядерных клеток (нейтрофилов и эозинофилов) белками ЦВЖ, секретируемыми в нижних отделах женского генитального тракта. В 47% случаев состав ЦВЖ представлен белками, которые могут влиять на проницаемость слизистой оболочки половых путей. Поскольку проницаемость часто повышается в случае воспалительных заболеваний шейки матки (эндометриты, цервициты, вагиниты, вульвиты и т.д.), эти плазменные белки, в конечном счете, могут быть использованы вместе с секретируемыми белками активированных нейтрофилов и эозинофилов (например, лактоферрин, миелопероксидазы, липокалин и эозинофильные белки) в качестве маркеров для ранней диагностики воспаления нижних отделов генитального тракта [47].
Белковый состав ЦВЖ отражает не только изменения, связанные с беременностью, но и ранние изменения, появляющиеся при поражении эпителия шейки матки во время заболеваний, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией. Следовательно, развитие цервикальных неоплазий и, впоследствии, РШМ находит свое отражение в белковом составе ЦВЖ. Протеомный анализ ЦВЖ выявил 16 возможных биомаркеров, из которых альфа-актинин-4 (р=0,001) и изозим пируваткиназы M1 / M2 (р = 0,014) оказались наиболее перспективными у пациенток с ВПЧ-ассоциированными заболеваниями шейки матки. Методом ELISA (n = 28) было показано, что содержание альфа-актинина-4 достоверно отличается в образцах ЦВЖ здоровых женщин и женщин с ВПЧ-инфекцией (р = 0,009). Дополнительно был измерен уровень альфа-актинин-4 в ЦВЖ 29 пациентов (n = 29) при неоднократном заборе образцов и было обнаружено, что альфа-актинина- 4 коррелирует с временем персистенции ВПЧ. Таким образом, альфа-актинин-4 является перспективным биомаркером для выявления предраковых заболеваний шейки матки [48]. ACTN4 это белок, который является главным компонентом цитоскелета и вовлекается в процесс межклеточных адгезий [48] . Было показано, что при повышении активности ACTN4 происходит ингибирование молекул адгезии клеточных стенок который происходит при злокачественных трансформациях, т.е. снижается прочность межклеточных связей [49]. По результатам Khurana et al., при изучении рака молочной железы , ACTN4 вовлекается в контроль механизма клеточного роста [50]. Более того, накопление ACTN4 в цитоплазме ассоциировалось с несколькими злокачественными процессами и были связаны с плохим прогнозом, аккумуляция генома ACTN4 был связан с формированием аденокарциномы яичников [51]. Кроме того, иРНК-обусловденное подавление регуляции ACTN4 показало связь между повышением экспрессии ACTN4 и агресивным фенотипом плоскоклеточной карциномы ротовой полости [52].
Аналогично, группой Zegels G, при исследовании протеомного состава ЦВЖ при ВПЧ-ассоциированных заболеваниях шейки матки, был выявлен белок S100A9 в качестве маркера патологического процесса. Белок S100A9, образует с S100A8 гетеродимер кальпротектин и обладает мощным антибактериальным действием [53]. В исследовании Andersch-Bjrkamn с соавторами было выявлено 178 белков цервикальной слизи. Результаты протеомного исследования показали, что состав цервикальной слизи был похож до и после овуляции, однако отличался во время овуляции, что проявлялось в изменении степени гликозилирования компонентов слизи [54, 55].
Доказано, что при персистенции высокоонкогенных типов ВПЧ возникает экспрессия онкобелков (Е6/Е7), в том числе в ЦВЖ. Онкобелки Е6 и Е7 взаимодействуют с генами, отвечающими за локальный иммунитет [56]. Во время этого периода, длительность которого может составлять до нескольких лет, иммунные клетки вызывают лизис атипических клеток многослойного плоского эпителия при одновременном противодействии со стороны ВПЧ. Ряд авторов полагают, что в 80% случаев поражение эпителия шейки матки легкой степени указывает на активность иммунной системы. Поэтому можно предположить, что иммунный ответ при интраэпителиальных поражениях шейки матки достаточен для эффективного лизиса атипичных клеток и содержание белков-биомаркеров в ЦВЖ, определенное методами иммуноферментного анализа или масс-спектрометрии, может быть потенциальным прогностическим фактором развития РШМ [57].
Изучение протеомного профиля цервиковагинальной жидкости представляется перспективным для прогнозирования течения неопластического процесса шейки матки и выявления корреляции между степенью тяжести ЦИН, ВПЧ-нагрузкой и уровнем данных маркеров в динамике наблюдения. Исследование специфических генетических, эпигенетических, протеомных изменений, позволит в дальнейшем использовать их в многокомпонентной тестовой системе диагностики и прогноза ЦИН и начальных стадий рака. Также возможно развитие нового подхода в таргетной терапии РШМ.
Клиническая характеристика обследуемых женщин
Нами было обследовано 279 пациенток, обратившихся в научно-поликлиническое отделение Центра, из них в исследование было включено 140 пациенток с учетом критериев включения и исключения (рисунок 6). Все пациентки были проанкетированы и проведен анализ клинико-анамнестических данных.
При сборе анамнеза внимание уделялось следующим факторам: возраст пациентки; масса тела и рост; семейный анамнез; возраст полового дебюта; количество половых партнеров за жизнь; наличие ВПЧ-ассоциированных заболеваний шейки матки в анамнезе и методы их лечения; перенесенные гинекологические операции в анамнезе; перенесенные инфекционные и воспалительные заболеваний органов малого таза; акушерский анамнез (число беременностей, родов и абортов); прием комбинированных оральных контрацептивов (КОК); наличие аутоиммунных заболеваний (аутоиммунный тиреоидит, ревматизм, системная красная волчанка, ревматоидный артрит); перенесенные детские инфекции (ветряная оспа, эпидемический паротит, краснуха, корь); курение.
После обследования с учетом результатов различных методов исследования шейки матки (цитология, ВПЧ-типирование, кольпоскопия, биопсия(по показаниям) с последующим гистологическим исследованием биоптата шейки матки были выделены 5 групп пациентов (рисунок 6):
1 группа (Здоровые) – группа контроля – 30 человек (21,4%); 2 группа ASCUS – 30 человек (21,4%) ( в динамическом наблюдении через каждые 6 месяцев, в 3х точках); 3 группа LSIL–30 человек (21,4%) ( в динамическом наблюдении через каждые 6 месяцев, в 3х точках); 4 группа HSIL – 30 человек (21,4%); 5 группа РШМ– 20 человек (14,3%);
Средний возраст пациенток среди 5 групп значимо не отличался и составил 28±7,7 лет. Сравнительный анализ антропометрических данных так же не выявил значимых различий между всеми группами (табл. 4).
Оценивалась менструальная функция пациенток в пяти группах (менархе, длительность менструального цикла, продолжительность менструаций). Различий в группах, имеющих статистическую значимость, не было выявлено. Характеристика менструального цикла исследуемых пациенток представлена в таблице 5.
Возраст менархе в среднем составил ±13,25 лет Начало менструаций от 15 лет и старше отметили 11% женщин. У 100% пациенток менструальный цикл был регулярным. Как видно из таблицы 5, средний возраст менархе составил 13,2 ± 1,5 в 1 группе, 13,4 ±1,3 во 2 группе, 13,2 ±1,9 в 3 группе, 13,1 ±1,0 в 4 группе, 13,3 ±1,5 в 5 группе. Средняя продолжительность менструаций составила 5,4 ±1,9 в 1 группе, 5,3 ±1,0 во 2 группе, 5,5 ±1,2 в Згруппе , 4,9 ±1,9 в 4группе и 5,0 ±1,7 в 5 группе.
При анализе особенностей половой жизни пациенток выявлено, что 34% женщин начали половую жизнь до 18 лет. Средний возраст полового дебюта ±18,3 лет (19,0 ±4,8 в 1 группе, и 18,3 ±3,1 во 2группе, 18,3 ±2,6 в 3, 18,4 ±1,1 в 4 и 17,9 ±1,4 в 5 группе, соответственно. Среднее количество половых партнеров составило в 1 группе – 2,8 ±2,0, во 2 группе – 3,3 ±2,6, в 3 группе 5,2 ±9,3, в 4 группе 1,9 ±1,1, в 5 группе 2,7 ±1,4). Половую жизнь вне брака начали 95 (63%) пациенток. Более 3х половых партнеров в 1 группе отметили 12 (40%), во 2 группе 18 (60%), в 3 группе 20(66%), в 4 группе 11(37%), в 5 группе 13(65%).
Общее число беременностей составило 41 (19%) в 1 группе, 51(23%) во 2 группе, 27(12%) в 3 группе, 53 (24%) в 4группе, и 49(22%) в 5группе (таблица 6). Число самопроизвольных родов 16(15%) в 1 группе , 23 (22%) во 2 группе, 12(11%) в 3 группе, 27 (25%) в 4группе, и 26(25%) в 5группе; Общее число кесарево сечения во всех группах составило 7, 1 (14%) в 1 группе, 2 (28%) во 2 группе, 1(14%) в 3 группе и 3 (42%) в 4группе, в 5 группе родоразрешений путем операции кесарево сечение никому не производилось; число искусственных абортов 21 (23%) в 1 группе , 17 (19%) во 2 группе, 7 (0,08%) в 3 группе, 21 (24%) в 4группе, и 22 (24%) в 5группе; 22 (24%) беременности из общего числа завершились выкидышем и внематочной беременностью.
Данные о перенесенных детских инфекционных заболеваний и соматических патологиях, включающие в себя краснуху, эпидемический паротит, ветряную оспу, заболевания органов дыхания, органов сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта, мочевыделительных органов, ЛОР-органов и органов зрения, аутоиммунные заболевания и эндокринологические заболевания, статистически значимо не отличались среди исследуемых 5 групп.
Заболевания органов дыхания включали перенесенный хронический бронхит, пневмонию и бронхиальную астму. Среди заболеваний сердечно-сосудистой системы были артериальная гипертензия, нарушения ритма ЧСС и пролапс митрального клапана. В заболеваниях мочевыделительной системы рассматривались хронический пиелонефрит и цистит. Среди заболеваний желудочно-кишечного тракта отмечались хронический гастрит и язвенная болезнь желудка в стадии ремиссии. Из заболеваний эндокринной системы у пациенток наблюдались такие, как аутоиммунный тиреоидит с нарушением функции щитовидной железы и как узловой зоб. Заболевания органов зрения включали в себя миопию и астигматизм.
При анализе семейного анамнеза было выявлено, что 5 (0,03%) пациенток 1 группы, 19 (13%) пациенток 2 группы, 12 (0,08%) пациенток 3 группы, 10 (0,07%) пациенток 4 группы и 7 (0,05%) пациенток 5 группы отмечали наличие наследственных заболеваний в семье таких, как заболевания сердечно-сосудистой системы, сахарный диабет 1-2 типов, онкологические заболевания органов малого таза, онкологические заболевания прямой кишки, онкологические заболевания желудочно-кишечного тракта. Онкологические заболевания органов малого таза у ближайших родственников отмечались в группе ASCUS (23%) и РШМ (20%) достоверно чаще (р=0,03).
Гинекологические заболевания включали в себя воспалительные и инфекционные заболевания органов малого таза, перенесенные в анамнезе (таблица 7). Структуру гинекологических заболеваний составили такие заболевания как: хронический сальпингоофорит 12%, эндометриоз 11%, хронический эндометрит 10%, уреаплазмоз 30%, хламидиоз 8%, кандидоз 37%.
Результаты анализа протеомного состава цервиковагинальной жидкости
На следующем этапе нашей работы мы изучили и провели анализ протеомного состава ЦВЖ, всем пациенткам, включенным в исследование с целью определения белковых панелей для всех групп и специфичных для различных форм ВПЧ-ассоциированных поражений шейки матки методом ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией.
Исходно в образцах ЦВЖ было выявлено более 600 различных белков. Для выявления меж- и внутригрупповых изменений протеомного состава проводился сравнительный анализ усредненных значений интенсивности белков по группам, в результате этого анализа была описана встречаемость белков в различных группах. В дальнейшем был введен критерий, в соответствии с которым потенциальный маркерный белок должен был встречаться как минимум в трех повторах в одной группе. Была выделена группа 356 общих белков, которые встречались у всех пациенток (Рис. 13).
На основании сравнительного анализа уровня экспрессии белков было показано какие именно группы сходны между собой по белковому профилю. Результаты сопоставления нами приведены в виде филогенетического дерева, где кластеризуются и визуализируются сходные между собой группы (рисунок 13). Следует отметить, что кластеризация и схожесть на основе протеомных данных сопоставима с клинической картиной (цитология, кольпоскопия). Так, группы с «малыми» поражениями эпителия шейки матки наиболее близки друг другу по протеомному профилю и четко дифференцируется от группы контроля. Тяжелые поражения (HSIL) и рак шейки матки имеют выраженные отличия в протеомных профилях, как по сравнению друг с другом, так по сравнению с малыми поражениями и с группой контроля.
Отдельно оценивались белки, характерные только для определенной группы, и оценка белковой композиции, характерной для всех четырех групп, для выявления достоверно изменяющихся белков (рисунок 14)
С учетом вариабельности протеомного состава было решено сузить спектр анализируемых белков для выявления изменений среди белков, присутствующих во всех трех группах минимум в трех повторах. В результате было найдено197 белков, которые встречались во всех группах (Приложение 1). Проанализировав данную выборку с использованием базы данных Gene Ontology, было показано, что 66 белков участвуют в метаболических процессах, причем большая их часть - в протеолизе, 29 белков ассоциированы с биологической регуляцией, 30 – с иммунными процессами и 26 стресс-белков, генез которых в рамках данного исследования не изучался (Рисунок 15). Следует подчеркнуть, что по классам большую часть белков представляли ингибиторы протеаз, которые, возможно, оказывают влияние на развитие патологического процесса, ингибируя апоптотические ферменты. Белки ЦВЖ, значимо изменяющиеся в группах ASCUS, LSIL, HSIL.
Для поиска потенциальной панели белков-биомаркеров были проанализированы белки, характерные для каждой из групп и белки, встречающиеся только в одной группе. Был введен дополнительный критерий, в соответствии с которым белок должен был присутствовать как минимум у двух пациенток. Из 356 белков уникальными для группы ASCUS являются 12 белков, в том числе белок LRG1, отвечающий за регуляцию пролиферации эндотелиальных клеток; белок C4BPA, который на фоне персистенции ВПЧ дополнительно угнетает работу системы комплемента;. белки-шапероны P4HB и HSPA8, которые характеризуют ранние изменения, ассоциированные с ВПЧ-инфекцией, в том числе проникновении вируса в клетку и его транскрипцию [71]; белки PRDX5 и YWHAE, связанные с нарушением регуляции апоптоза и усилением пролиферации атипических клеток. Также среди уникальной панели белков для группы ASCUS был выявлен белок ACTN4, считающийся в настоящее время одним из потенциальных маркеров неоплазий шейки матки [72]. Было показано, что повышение активности ACTN4 происходит при злокачественных трансформациях, и связано со снижением прочности межклеточных связей [73] однако, несмотря на то, что в подобных исследованиях ACTN4 выявлялся при различных типах неоплазий, в нашем исследовании белок присутствовал только в группе ASCUS. Для групп HSIL специфичными оказались 2 белка, среди которых представляет интерес белок CPM, принимающий участие, как в деградации внеклеточных белков, так и в контроле активности белковых гормонов и факторов роста. Для группы контроля специфичным оказался белок MUC16, который обеспечивает синтез муцина, дополнительно защищающего клетки от вирусной инвазии (Таблица 9).
Определение уровня экспрессии мРНК функциональных генов человека
С целью прогнозирования развития и течения неопластической трансформации эпителия шейки матки нами также была изучена экспрессия мРНК функциональных генов человека, влияющих на пролиферацию, клеточный цикл, апоптоз и рецепторный аппарат клеток у 30 пациенток (сформировано 4 группы: 7 пациенток (23%) – NILM (I группа - контрольная), 23 (77%) - ВПЧ-позитивные, разделены на 3 группы: II группа –11 (49%) с ASCUS, III группа – 7 (30%) с LSIL, IV группа - 5 (21%) с HSIL.)
При интегральной оценке профиля экспрессии 4 генов (KI67, PGR, P16 и BCL2) в группу риска развития и прогрессии цервикальной дисплазии определены 4 пациентки (13,3%) из группы ASCUS, 7 женщин (23,3%) из группы LSIL, 9 (30%) из группы HSIL и 8 (40%) пациенток из группы РШМ. Отмечено повышение Ме индекса риска в исследуемых группах по сравнению с группой контроля.
Профиль экспрессии мРНК исследованных генов (Me) представлен на рисунке 18. Наиболее выраженные изменения отмечены для генов CDKN2A (повышение в 5,6 раза (р=0,005) при HSIL, аналогичные тенденции отмечены и для других групп) и PGR (снижение более чем в 5 при ASCUS (р=0,043), LSIL и HSIL) по сравнению с контрольной группой.
При интегральной оценке профиля экспрессии 4 генов (KI67, PGR, P16 и BCL2) в группу риска развития и прогрессии цервикальной дисплазии определены 1 пациентка (9%) из группы ASCUS, 3 женщины (43%) из группы LSIL, 3 (60%) из группы HSIL и ни одной пациентки из контрольной группы. Отмечено повышение Ме ИР в исследуемых группах по сравнению с контролем (Рисунок 19).
Комбинация протеомного и транскриптомного подходов для определения риска малигнизации неоплазии ШМ
На основе определенной по данным интегральной оценки профиля экспрессии 4 генов (KI67, PGR, P16 и BCL2) деления групп пациентов с LSIL и HSIL на группы низкого и высокого степени риска развития и прогрессии цервикальной дисплазии, был выполнен многофакторный анализ (PLS) данных белкового состава ЦВЖ этих пациентов. В результате, было достигнуто достоверное разделение группы с низким риском развития и прогрессии цервикальной дисплазии и группы высокого риска (Рис. 6).
Отмечается, что образец 59 оказался вне 95% эллипса Хоттелинга, что говорит о значительном отличии состава протеома ЦВЖ этой пациентки от других пациенток группы низкого риска (рисунок 20). Пациентка Х – 24 года, без отягощенного соматического и гинекологического анамнеза. Менструальная функция без особенностей, беременностей в анамнезе не имела, ранняя половая жизнь (с 17 лет), половых партнеров было более 3-х. ASCUS по цитологии (2014), ВПЧ 31 типа с вирусной нагрузкой 6,7 log, предложено динамическое наблюдение. По контрольной цитологии AGC (2015), ненормальная картина при кольпоскопии, ВПЧ 31 типа пациентке была произведена биопсия пораженных участков шейки матки - диагноз LSIL. Клинико-анамнестические данные пациентки не позволили нам выявить основную причину отличия состава ЦВЖ у данной пациентки.
Белки, дифференцирующие группы низкого и высокого степени риска риском развития и прогрессии цервикальной дисплазии, включают: Ig heavy chain V-III region BRO, Plasminogen activator inhibitor 1 RNA-binding protein, IgGFc-binding protein, Ly6/PLAUR domain-containing protein 3, Zinc finger protein 185, Protein S100-A12, Thioredoxin, Hemoglobin subunit delta, Kallikrein-11, Repetin, Heat shock protein beta-1 и Gamma-glutamylcyclotransferase. Нами был проведен сравнительный анализ выявленных белков их ассоциации с другими злокачественными заболеваниями. Белок Plasminogen activator inhibitor 1 RNA-binding protein, является активатором протеазного каскада, принимает участие в внутрисосудистом свертывании крови путем ингибирования эндотелиального активатора плазминогена и рассматривается как перспективный маркер прогнозирования исхода при раке молочной железы, раке яичников. По данным группы ученых во главе с N.B. Serce, данный белок является еще и маркером гинекологических заболеваний, в том числе и рака яичников[87]. IgGFc-binding protein является представителем семейства белков, связывающих инсулиноподобный фактор роста, играет роль в регуляции клеточной пролиферации и дифференцировке, апоптозе, вовлекается в неопластическую трансформацию клетки, ассоциированной с онкогенными типами вируса. IgGFc-binding protein является прогностическим маркером развития рака молочной железы, предстательной железы, легких и колоректального рака [88, 89]. Белок Zinc finger protein 185 является ингибитором метилирования ДНК и участвует в процесс развития рака предстательной железы, рака легких, печени, меланомы [90, 91]. Protein S100-A12 (calgranulin C) является белком, обладающим провоспалительным цитокиноподобным действием, воздействует на компоненты стенки клетки, модулируя нейтрофильную активность, вовлекается в развитие опухолевого процесса молочной железы, кишечника, легких, мочевыводящих путей и слизистой полости рта [92, 93, 94, 95]. Белок Thioredoxin в больших количествах экспрессируется во время активного роста опухоли - в период гиперваскуляризации ткани и оксидативного стресса при раке молочной железы, поджелудочной железы, пищевода и колоректальном раке [96, 97, 98]. Repetin экспрессируется в клетках эпидермиса, волос и сосочках языка [99], в перспективе рассматривается как прогностический маркер при ВПЧ-ассоциированных раках головы и шеи [100]. Белок Heat shock protein beta-1 играет решающую роль в поддержании клеточного гомеостаза, апоптоза, инвазии, принимает участие в ангиогенезе и оксидативном стрессе, повышение экспрессии которого наблюдается при гепатоцеллулярной карциноме, лейкемии, глиобластоме и раке поджелудочной железы [101, 102]. Gamma glutamylcyclotransferase участвует в пролиферации клеток и обнаруживается при раке молочной железы и раке легких [103, 104].
Таким образом, выявленные нами белки ЦВЖ были ассоциированы с онкогенными процессами, среди которых особое место занимают злокачественные эпителиальные трансформации эпителия легких, пищевода, прямой кишки, шейки матки и другие виды ВПЧ-ассоциированных раков.