Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о «бедном» овариальном ответе на стимуляцию суперовуляции в программах вспомогательных репродуктивных технологий (обзор литературы) 12
1.1 Преждевременная недостаточность яичников как медицинская и социальная проблема 12
1.2 Определение и основные причины «бедного» овариального ответа в программах ВРТ 13
1.3 Роль аутоиммунных антител в развитии «бедного» овариального ответа в программах ВРТ 17
1.4 Взаимосвязь генетических факторов и «бедного» овариального ответа в программах ВРТ 24
1.5. Тактика ведения пациенток с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции в клинике ЭКО 31
1.6. Эффективность применения глюкокортикоидов у пациенток с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции и наличием аутоантител к ткани яичника 34
Глава 2 Материалы и методы исследования 37
2.1. Дизайн исследования для задач 1 и 2 37
2.2. Дизайн исследования для задачи 2 39
2.3. Дизайн исследования для задач 3 и 4 41
2.4. Расчет объема выборки 43
2.5. Методы исследования
2.5.1. Общеклинические методы исследования 47
2.5.2. Гормональное исследование
2.5.3. Ультразвуковое исследование органов малого таза 48
2.5.4.Иммунологические исследования 49
2.5.5. Генетические исследования 52
2.6.Стимуляция функции яичников и трансвагинальная пункция яичников 55
2.7. Оплодотворение и культивирование эмбрионов in vitro 56
2.8. Перенос эмбрионов в полость матки и посттрансферный период 56
2.9. Статистический анализ полученных данных 57
Глава 3. Клинико-анамнестические и ятрогенные факторы риска, и исходы программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с «бедным» овариальным ответом 59
3.1. Клинико-анамнестические факторы риска развития «бедного» овариального ответа у пациенток программ ВРТ 59
3.2. Клинико-лабораторное обследование пациенток с «бедным» овариальным ответом в программах ВРТ 65
3.3. Влияние различных протоколов стимуляции суперовуляции на параметры фолликуллогенеза и оогенеза у пациенток с «бедным» овариальным ответом в программах ВРТ 67
3.4. Характеристика раннего эмбриогенеза и исходов ВРТ у пациенток с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции 70
Глава 4. Роль аутоиммунных антител и генетических факторов в развитии «бедного» овариального ответа в программах вспомогательных репродуктивных технологий 75
4.1. Результаты иммунологического исследования у пациенток с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции 75
4.1.1. Исследование аутоантител в сыворотке крови и фолликулярной жидкости 75
4.1.2. Взаимосвязь между уровнем аутоантител и параметрами оогенеза, раннего эмбриогенеза и исходами программ ВРТ 80
4.2. Результаты молекулярно-генетического исследования у пациенток с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции 83
4.2.1. Число CGG-повторов в гене FMR1 и овариальный ответ в программах ВРТ 83
4.2.2. Полиморфизмы гена BMP 15 и овариальный ответ в программах ВРТ 85
4.2.3. Полиморфизм С AG-повтора гена андрогенного рецептора и овариальный ответ в программах ВРТ 89
4.3. Взаимосвязь аутоиммунных и генетических факторов у пациенток с «бедным» овариальным ответом 89
4.4. Модель прогноза «бедного» овариального ответа в программах ВРТ на основании оценки клинико-анамнестических, иммунологических и генетических факторов 95
Глава 5. Обсуждение полученных результатов 100
Выводы 120
Практические рекомендации 122
Список сокращений и условных обозначений 124
Список литературы
- Взаимосвязь генетических факторов и «бедного» овариального ответа в программах ВРТ
- Общеклинические методы исследования
- Клинико-лабораторное обследование пациенток с «бедным» овариальным ответом в программах ВРТ
- Исследование аутоантител в сыворотке крови и фолликулярной жидкости
Введение к работе
Актуальность проблемы
«Бедный» овариальный ответ (БОО) - это созревание менее 3-х фолликулов при стимуляции суперовуляции большими дозами гонадотропинов (более 300 МЕ/сутки) (ESHRE, 2011). В программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) распространенность БОО составляет 9-24% (Badawy А., 2011). У пациенток с «бедным» ответом получают мало ооцитов, мало эмбрионов, что снижает шансы наступления беременности и эффективность программ ВРТ (Назаренко Т. А., Краснопольская К.В., 2012).
Этиология развития БОО на стимуляцию суперовуляции неизвестна. Доказанными факторами риска являются состояния, приводящие к снижению фолликулярного пула: возраст женщины более 40 лет, операции на яичниках в анамнезе, ожирение, химио- и рентгенотерапия и т.д. (Kamble L., 2011). Однако «бедный» овариальный ответ часто наблюдается у пациенток без наличия этих факторов риска с нормальным овариальным резервом. Предполагаемыми патогенетическими факторами развития БОО у этих женщин могут быть некоторые численные и структурные аномалии X-хромосомы, или аутоиммунное поражение тканей яичников (Kokcu А., 2012; Gleicher N.,2012).
Была отмечена связь неслучайной инактивации Х-хромосомы, а также структурных изменений в области ее длинного плеча (Xq) с развитием преждевременной недостаточности яичников (ПНЯ) (Ыео А., 2008; Gleicher N., 2012). Ген FMR1, расположенный на длинном плече Х-хромосомы в локусе Xq27.8, может содержать различное число тринуклеотидных CGG-повторов. Было установлено, что число CGG-повторов, равное 26-34, характерно для половины женского населения (Persani L., 2009; Gustin S., 2014). Более высокое или более низкое число CGG-повторов часто связано с развитием ПНЯ, снижением овариального резерва и коррелирует с уровнем
фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и антимюллерова гормона (АМГ) (GleicherN., 2012).
Ген BMP 15, расположенный в локусе Хр11.2, ингибирует мРНК, участвующую в формировании рецепторов ФСГ в гранулезных клетках. Вследствие этого подавляется поздняя ФСГ-зависимая стадия развития фолликулов и ФСГ-зависимая продукция прогестерона, в результате чего предотвращается преждевременная лютеинизация фолликулов. Мутации в гене BMP 15, выявляемые у 4-10% больных с ПНЯ, могут приводить к повышению чувствительности гранулезных клеток к ФСГ и преждевременной лютеинизации фолликулов, а также влиять на число кумулюсных клеток и качество ооцитов (Moore R., 2005; Gilchrist R., 2008). Роль генов FMR1 и BMP 15 в генезе ПНЯ является доказанной, однако данные об их значении в развитии БОО и эффективности программ ЭКО практически отсутствуют в мировой научной литературе.
Иммунологические факторы играют существенную роль в развитии БОО наряду с генетическими причинами. До 30% случаев ПНЯ являются следствием аутоиммунных нарушений и, в основном, обусловлены повреждающим действием различных антител на ткани яичников. В группе анти-овариальных антител (АОА) различают антитела к блестящей оболочке ооцита, антитела к ФСГ, а также антитела к стероид-продуцирующей ткани яичника. Данные по влиянию этих антител на развитие БОО противоречивы (Zou S.H., 2008; Haller-Kikkatalo К., 2012).
Изучение патогенеза развития «бедного» овариального ответа на стимуляцию суперовуляции в программах ЭКО способствует поиску предикторов этого состояния. Возможность раннего прогноза ответа яичников при лечении бесплодия с помощью ВРТ представляет возможность своевременного планирования семьи и выбора оптимального метода стимуляции суперовуляции в группах риска развития БОО.
Цель исследования
Повышение эффективности программ вспомогательных
репродуктивных технологий у пациенток с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции на основании изучения диагностической значимости аутоиммунных и генетических факторов в развитии этого состояния.
Задачи исследования
-
Изучить клинико-анамнестические факторы риска развития «бедного» овариального ответа у пациенток программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).
-
Проанализировать влияние различных протоколов стимуляции суперовуляции на развитие «бедного» овариального ответа и исходы программ ВРТ (параметры фолликулогенеза, оогенеза, раннего эмбрионального развития, частоту наступления беременности и репродуктивных потерь в I триместре).
-
Определить связь между наличием различных видов аутоантител, в том числе к тканям яичника, и снижением овариального ответа в программах ВРТ.
-
Оценить влияние генетических факторов (числа тринуклеотидных CGG-повторов в гене FMR1 и полиморфизмов гена BMP 15) на овариальный ответ пациенток в программах ВРТ.
-
Разработать алгоритм ведения пациенток с «бедным» овариальным ответом в клинике ВРТ на основании оценки диагностической значимости клинико-анамнестических, аутоиммунных и генетических факторов в развитии этого состояния.
Научная новизна
На основании использования современных молекулярно-генетических и иммунологических методов были расширены представления о генезе истощения фолликулярного аппарата и развития «бедного» овариального ответа в программах ВРТ и получены следующие новые знания:
Выявлены клинико-анамнестические факторы риска и определено влияние различных протоколов стимуляции суперовуляции на развитие «бедного» овариального ответа в программах ВРТ.
Исследована зависимость развития «бедного» овариального ответа в программах ВРТ от уровня различных аутоантител к тканям яичника, корреляции содержания различных аутоантител в сыворотке крови и фолликулярной жидкости, и установлены пороговые уровни аутоантител к тканям яичника, связанные с развитием БОО в программах ВРТ.
Изучено влияние числа тринуклеотидных CGG-повторов в гене FMRln полиморфизмов гена BMP 15 на овариальный ответ при стимуляции суперовуляции в программах ВРТ. Определено число CGG повторов в гене FMR1, влияющее на нормальную функцию яичников, и число повторов в зависимости от наличия или отсутствия аутоиммунного поражения яичников в этой группе пациенток.
Практическая значимость Были выявлены аутоиммунные факторы, коррелирующие с развитием БОО, а также пороговые уровни различных аутоантител к тканям яичника, связанные с развитием БОО и, как следствие, эффективностью программ ВРТ. Также были выявлены молекулярно-генетические предикторы развития БОО, такие как число CGG повторов в гене FMR1 и полиморфизмы гена BMP'15, которые могут быть использованы в качестве диагностических и прогностических критериев на этапе подготовки к программам ВРТ у пациенток с риском развития БОО.
На основании выявленных клинико-анамнестических, иммунных и молекулярно-генетических факторов риска был разработан алгоритм обследования пациенток, планирующих беременность путем ЭКО, для своевременного выявления групп риска развития БОО. В результате определения влияния различных протоколов стимуляции суперовуляции на исходы программ ВРТ у пациенток с «бедным» овариальным ответом был разработан алгоритм ведения пациенток групп риска развития БОО с выбором оптимальных схем стимуляции суперовуляции.
Положения, выносимые на защиту
-
«Бедный» овариальный ответ в программах ВРТ не зависит от клинико-анамнестических факторов риска за исключением возраста пациенток и возраста наступления менопаузы у их матерей. При этом сниженный овариальный резерв не является абсолютным прогностическим фактором ответа яичников на стимуляцию суперовуляции и выявляется лишь у 81,5% женщин с «бедным» ответом.
-
Протокол стимуляции суперовуляции не оказывает значимого влияния на исходы программ ВРТ у пациенток с «бедным» овариальным ответом, однако применение агонистов гонадотропин-рилизинг гормона может оказывать позитивное влияние на число полученных фолликулов и ооцитов в данной группе пациенток.
3. «Бедный» овариальный ответ на стимуляцию суперовуляции
следует рассматривать как доклинический вариант преждевременной
недостаточности яичников, в генезе которого задействованы иммунные и
генетические механизмы. У пациенток программ ВРТ при наличии числа
CGG-повторов в гене FMR1 более 34 «бедный» ответ на стимуляцию
суперовуляции наблюдается в 6 раз чаще, а при наличии полиморфизмов
гена BMP 15 - в 2,5 раз чаще. У пациенток с «бедным» ответом определяются
более высокие уровни аутоиммунных антител, в том числе антител к тканям
яичника, среди которых особое значение в реализации овариальной функции имеют антитела к блестящей оболочке ооцита.
4. При числе CGG-повторов в гене FMR1 от 26 до 34 у пациенток с
«бедным» ответом можно предположить наличие аутоиммунного поражения тканей яичников, тогда как при нормальном уровне антиовариальных антител «бедный» овариальный ответ может быть ассоциирован с генетическими нарушениями (повышением числа CGG-повторов более 34, наличием полиморфизмов гена BMP 15). При наличии аутоиммунного фактора БОО характеризуется лучшей сохранностью фолликулярного пула по сравнению с генетически обусловленным «бедным» ответом.
Личный вклад автора Автор непосредственно участвовал в выборе научного направления исследования, разработке цели и задач исследования, обобщении, анализе, статистической обработке полученных данных. Автор лично принимал участие в ведении пациенток на всех этапах лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ПЭ), в анализе и научной интерпретации результатов иммунологического и молекулярно-генетического исследования пациенток.
Соответствие диссертации паспорту полученной специальности
Научные положения диссертации соответствуют формуле
специальности 14.01.01 - «акушерство и гинекология». Результаты
проведенного исследования соответствуют области исследования
специальности, конкретно пунктам 3 и 4 паспорта акушерства и гинекологии.
Апробация материалов диссертации Основные положения диссертации и результаты работы представлены и доложены на XIV Всероссийском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2013), 9-м Международном конгрессе по аутоиммунологии (Ницца, 2014), 7-м
Региональном научном форуме «Мать и дитя» (Геленджик, 2014), XV Всероссийском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2014). Работа обсуждена на межклинической конференции отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия (23.04.2015) и заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (18.05.2015, протокол № 5).
Внедрение результатов исследования в практику Разработанный на основании полученных результатов алгоритм проведения программ ВРТ у пациенток с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции с учетом иммунологических и молекулярно-генетических маркеров внедрен в практическую деятельность отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России.
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из которых 5 входят в перечень рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации Работа изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из оглавления, списка принятых сокращений, введения, обзора литературы, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 29 таблицами и 16 рисунками. Библиографический указатель включает 197 литературных источника, из них 9 работ отечественных авторов, 188 -зарубежных авторов.
Взаимосвязь генетических факторов и «бедного» овариального ответа в программах ВРТ
Вспомогательные репродуктивные технологии для лечения бесплодия широко применяются во всех странах мира. По данным литературы приблизительно 2,5 % новорожденных детей в Европе рождается вследствие проведения программ ВРТ [136]. Несмотря на постоянное развитие новых технологий, частота наступления беременности в цикле ЭКО по-прежнему не превышает 30-40% [152]. Целью стимуляции функции яичников, являющейся одним из этапов программы ЭКО, является получение большого количества фолликулов, достаточного и адекватного числа высококачественных ооцитов для возможности компенсации ошибок эмбриологического этапа, выбора лучших эмбрионов и их переноса [70].
В 1978 г. гинеколог Steptoe Р.С. и физиолог Edwards R.G. сообщили о рождении здорового младенца (девочки) после выполненной программы ЭКО и переноса эмбриона (ПЭ) в естественном цикле [176]. Вскоре после этого новаторского события в практику была введена стимуляция суперовуляции, позволяющая получать большое количество ооцитов, и, как следствие, высокие шансы наступления беременности [147]. Тем не менее, даже после 40-летнего накопленного опыта применения программ ВРТ, по-прежнему есть женщины, плохо отвечающие на проводимую стимуляцию суперовуляции. У пациенток с «бедным» овариальным ответом (БОО) получают мало ооцитов и эмбрионов, что снижает шансы наступления беременности и эффективность программ ВРТ [49]. Распространенность «бедного» овариального ответа на стимуляцию суперовуляции весьма высока, и колеблется по данным литературы от 9 до 24% [21, 63, 149,185]. В исследованиях ASRM/SART были получены данные об отмене 14,1% циклов ЭКО, в 50% - по причине «бедного» овариального ответа [174]. Большой размах в определении распространенности этого явления связан с различиями в дефиниции этого явления.
Долгое время в литературе не было единого международного термина ответа яичников на стимуляцию. Наиболее часто использовались следующие определения: «бедный» («poor»), «низкий» («low»), «несоответствующий» («inadequate»), «субоптимальный» («suboptimal»). Часто термин «бедный» овариальный ответ ассоциировался с низким овариальным резервом. Во множестве научных публикаций на тему БОО до 2010 года заключения авторов сводились к одному и тому же: из-за отсутствия единых критериев определения «бедного» овариального ответа нет достаточного числа доказательств для внедрения практических рекомендаций по улучшению исходов лечения этих пациенток [149].
Первая попытка точно охарактеризовать женщин с «бедным» овариальным ответом была предпринята Европейским Обществом Репродукции и Эмбриологии Человека (ESHRE) в 2010 г. на семинаре в Болонье (Италия) [138]. По критериям ESHRE «бедный» овариальный ответ - это созревание менее 3-х фолликулов при стимуляции суперовуляции большими дозами гонадотропинов (более 300 МЕ/сутки). Для диагностики «бедного» овариального ответа необходимо наличие как минимум двух из трех перечисленных критериев: возраст женщины более 40 лет или наличие других факторов риска «бедного» овариального ответа; указание на «бедный» овариальный ответ в анамнезе; данные, указывающие на снижение овариального резерва: количество антральных фолликулов менее 5-7, показатель АМГ в крови менее 0,5-1,1 нг/мл.
В возрасте менее 40 лет при отсутствии сниженного овариального резерва для диагностики БОО достаточно наличия 2х эпизодов «бедного» ответа в анамнезе [138].
Однако, несмотря на принятые критерии диагностики БОО, среди ученых до сих пор существуют разногласия в определении этого состояния. По мнению ряда авторов, критерием БОО помимо числа доминантных фолликулов может быть уровень эстрадиола (Е2) менее 100 пг/мл на 5-й день гормональной стимуляции или уровень эстрадиола (Е2) менее 300-500 пг/мл в день введения триггера овуляции [118]. Также нет единого мнения по поводу дозы ежедневно используемых для стимуляции гонадотропинов (Гн). Shaker A. et al. (1993) считают, что для диагностики БОО необходимо использование в программе 44 ампул Гн (по 75 или 100 ME) [18]. По мнению Toth Т. et al. (1996) суточная доза должна быть больше 300 ME [179]. Существуют и другие критерии, такие как определение отношения ФСГ к лютеинизирующему гормону (ЛГ), или измерение базального уровня Е2 [149]. По данным Назаренко Т.А. и соавт. (2012) «бедный» овариальный ответ может быть диагностирован при недостаточной реакции яичников на введение даже больших доз гонадотропинов (более 300 МЕ/сутки), когда при трансвагинальной пункции яичников не удается получить больше 3 ооцитов [4]. Однако нельзя диагностировать БОО по наличию единственного эпизода, так как он может быть случайным и не произойти в следующем цикле, если увеличить стартовую дозу Гн или изменить протокол стимуляции [138].
Помимо отсутствия единого мнения по поводу определения БОО существуют различные его классификации. Некоторые авторы разделяют пациенток с «бедным» овариальным ответом на тех, у кого он был отмечен ретроспективно в предыдущих циклах ЭКО, и тех, у кого можно ожидать данное состояние из-за снижения овариального резерва и наличия других факторов риска, таких как возраст или хирургические вмешательства на яичниках [62]. Другие исследователи разделяют пациенток с БОО на следующие две группы. Первая группа включает пациенток молодого возраста ( 37лет) с нормальным индексом массы тела (ИМТ) (вес 70 кг), у которых после 9 дней стимуляции яичников гонадотропинами в дозе до 225 МЕ/сутки созревает менее 5 ооцитов. Вторая группа включает пациенток старше 37 лет с массой тела больше 70 кг, у которых в результате 9-дневной стимуляции функции яичников гонадотропинами в дозе более 300 МЕ/сутки получают менее 5 ооцитов [83].
Общеклинические методы исследования
В отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России в рамках данного исследования было произведено 150 циклов ЭКО или ЭКО/ИКСИ. С целью получения достаточного количества зрелых ооцитов проводилась индукция суперовуляции в рамках протокола с Гн и ант-ГнРГ или т.н. «длинного» протокола с препаратами Гн и а-ГнРГ.
Протокол с ант-ГнРГ начинался со 2-3 дня менструального цикла с введения гонадотропинов. Начало «длинного» протокола соответствовало 19-21 дню цикла, при этом в начале проводилась блокада гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы путем ежедневного подкожного введения а-ГнРГ. А со 2-3 дня менструального цикла начиналась стимуляция суперовуляции при продолжающемся введении а-ГнРГ. Согласно анамнезу и клинико-лабораторным показателям овариального резерва женщины определялась стартовая доза для ежедневного подкожного введения препаратов рекомбинантного человеческого фолликулостимулирующего гормона (фоллитропин а, фоллитропин Р). В зависимости от динамики роста фолликулов при проведении УЗ-мониторинга при необходимости производилась коррекция дозы препарата рФСГ. Введение ант-ГнРГ начиналось при достижении максимальным фолликулом диаметра 14 мм. Препарат антГнРГ в дозе 0,25 мг/сутки вводился подкожно в одно и то же время суток до финального дня созревания фолликулов с целью предупреждения преждевременной лютеинизации фолликулов. Для возможности получения зрелых ооцитов за 35 часов до трансвагинальной пункции (ТВП) фолликулов при достижении одним или несколькими фолликулами диаметра 18 мм вводился препарат ХГ в дозе 5000-10000 ЕД внутримышечно. ТВП проводили амбулаторно в условиях малой операционной под кратковременным внутривенным обезболиванием. Под контролем УЗИ с помощью пункционной иглы под отрицательным давлением в диапазоне 90-100 мм водного столба производилась аспирация фолликулярной жидкости, которая помещалась в стерильные пробирки с 0,5 мл гепарина (2500 ЕД/мл).
Полученная фолликулярная жидкость передавалась эмбриологу, который оценивал количество и зрелость полученных ооцитов. Преинкубация и оплодотворение ооцитов проводились с использованием стандартов ЭКО или ИКСИ. В средах для культивирования фирмы «Cook Group, Inc.» (США) осуществлялось культивирование эмбрионов. Через 48 часов после ТВП оценивалось качество эмбрионов с учетом показателей скорости дробления эмбрионов, симметричности бластомеров, количества ядер и степени цитоплазматической фрагментации. На основании морфологических характеристик эмбрионы классифицировались на 4 группы: А - отсутствие фрагментации, В - 25% фрагментации, С - 25-50% фрагментации и D - более 50% фрагментации.
В зависимости от клинической ситуации производился перенос 1 или 2 эмбрионов в полость матки на 3 или 5 сутки культивирования при помощи катетера Wallace (Великобритания). Оставшиеся эмбрионы хорошего качества были криоконсервированы.
По общепринятой схеме вели посттрансферный период. На следующий день после ТВП и до момента диагностики беременности всем пациенткам назначали препарат натурального миронизированного прогестерона в дозе 600 мг/сут во влагалище.
Через 14 дней после переноса эмбрионов проводилась диагностика беременности на основании определения сывороточной концентрации В-субъединиц ХГ. Тест на беременность считали положительным при уровне В-ХГ более 20 МЕ/л («биохимическая беременность»). Клиническая беременность диагностировалась на основе повышения уровня р - ХГЧ и визуализации плодного яйца при ультразвуковом исследовании через 21 день после переноса эмбрионов.
Статистическая обработка данных выполнялась на индивидуальном компьютере с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel» и пакета статистических программ «Statistica V10», StatSoft Inc. (США), «SAS V8" (США) и «SPSS Statistics VI7» (США).
Для качественных данных определяли риски (%). Для сравнения качественных данных в 2-х и более группах, и установления значимых различий между ними использовали тест %2, для вычисления которого прибегали к построению таблиц сопряженности, а также точный критерий Фишера для небольших выборок. Для сравнения бинарных данных мерой сравнения явилось отношение шансов (ОШ) с использованием метода логистической регрессии с построением ROC-кривой для контроля множественных конфаундеров.
Перед проведением сравнительного анализа количественных данных в исследуемых группах определяли вид распределения данных (тест Колмогорова-Смирнова, графический анализ данных). При нормальном виде распределения данных определяли среднее значение со стандартным отклонением (СО), для оценки различий в группах применяли методы параметрической статистики (t-тест для сравнения данных в 2-х группах или ANOVA для сравнения данных в нескольких группах). При ненормальном распределении данных определяли медиану с интерквартильным размахом, для оценки различий в группах применяли методы непараметрической статистики (тест Манна-Уитни для сравнения данных в 2-х группах или тест Крускала-Уоллиса для сравнения данных в нескольких группах). Зависимые данные оценивались с помощью коэффициента корреляции. Корреляционный анализ проводился с использованием непараметрического корреляционного критерия Спирмена.
Математические модели прогноза развития заболевания создавались с помощью метода логистической регрессии. Анализ принятия решений был выполнен с помощью программы SPSS VI7 с применением инструмента Quest. Все модели были разработаны с применением разделения и калибровки и использованием теста Хошмера - Лемешева. Достоверность моделей была проверена путем построения кривых ROC.
Различия между статистическими величинами считали статистически значимыми при уровне достоверности р 0,05.
Для уменьшения ошибки выборки использовались строгие критерии отбора пациентов. Для уменьшения информационной ошибки исследования использовались одни и те же методы диагностики (на базе одних и тех же лабораторий) для всех пациентов. Оценка воздействующего фактора и исхода также была едина для всех пациентов.
Клинико-лабораторное обследование пациенток с «бедным» овариальным ответом в программах ВРТ
В соответствии с задачей №2 у включенных в исследование пациенток проводилась оценка параметров оогенеза. Индукция суперовуляции осуществлялась в рамках протокола с Гн и ант-ГнРг или «длинного» протокола с Гн и а-ГнРГ. С целью получения оптимального количества зрелых ооцитов индивидуально подбирались соответствующий протокол стимуляции и стартовая доза гонадотропинов. «Длинный» протокол начинался с 19-21 дня менструального цикла с блокады с гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы путем ежедневного подкожного введения а-ГнРГ. При этом стимуляция суперовуляции начиналась со 2-3 дня менструального цикла при продолжающемся введении а-ГнРГ. С введения стартовой дозы препаратов Гн на 2-3 день цикла начинался протокол с ант-ГнРГ. В дальнейшем, при проведении УЗ-мониторинга при необходимости производилась коррекция дозы препарата рФСГ. При достижении лидирующим пулом фолликулов размера 14 мм и вплоть до дня введения триггера овуляции производилось введение препарата ант-ГнРГ для профилактики преждевременной лютеинизации фолликулов. С целью финального дозревания ооцитов при достижении одним или несколькими фолликулами диаметра 18 мм вводился препарат ХГ в дозе 5000-10000 ЕД внутримышечно, после чего через 35-36 часов производилась трансвагинальная пункция фолликулов и аспирация ооцитов.
В результате 150 циклов ЭКО или ЭКО + ИКСИ было получено 638 ооцитов: 108 ооцитов у пациенток основной группы и 530 - в группе контроля. Из них было всего 86 зрелых ооцитов в группе с БОО и 434 ооцита в группе с нормальным ответом (р 0,0001). Пациентки 2-х групп отличались по среднему числу созревших фолликулов (1,9±0,3 и 7,9±3,1; р 0,0001) и полученных ооцитов (1,7±0,6 и 6,2±2,5; p 0,0001). Характеристика полученных ооцитов участниц исследования приведена в таблице 11.
Нами было оценено влияние протокола с ант-ГнРГ и «длинного» протокола с а-ГнРГ на число полученных фолликулов и ооцитов в программах ВРТ. «Длинный» протокол с а-ГнРГ был назначен 13,3% пациенток - 10 из 65 пациенток с «бедным» и 10 из 85 пациенток с нормальным овариальным ответом.
Число полученных фолликулов и ооцитов было несколько выше у пациенток с БОО при назначении а-ГнРГ по сравнению с ант-ГнРГ, составив 2,0±0,1 и 1,9±0,3 фолликулов и 1,9±0,3 и 1,6±0,6 ооцитов соответственно, что, однако, не было статистически значимо (р 0,05). У пациенток группы контроля, наоборот, при назначении а-ГнРГ по сравнению с ант-ГнРГ было получено несколько меньшее число фолликулов и ооцитов, составив (6,4±3,1) и (8,1±3,0) фолликулов, и (5,8±2,6) и (6,3±2,5) ооцитов соответственно (р 0,05) (рисунок 4). D Среднее значение Т_ Среднее значение±СО
Таким образом, протокол стимуляции суперовуляции не влиял значимо на число полученных фолликулов и ооцитов у пациенток обеих групп. Но, при этом, число полученных фолликулов и ооцитов было несколько выше у пациенток с БОО при назначении а-ГнРГ по сравнению с женщинами группы контроля, у которых протокол с ант-ГнРГ имел преимущество.
При оценке эффективности назначения а-ГнРГ у пациенток с БОО в зависимости от уровня АМГ было выявлено, что протоколы с а-ГнРГ способствуют получению относительно большего числа ооцитов у пациенток с более низким уровнем АМГ. Медиана АМГ в группе БОО составила 0,5 нг/мл. Из 30 пациенток с уровнем АМГ 0,5 нг/мл четырем был назначен протокол с а-ГнРГ. Из 35 пациенток с уровнем АМГ 0,5 нг/мл протокол с а-ГнРГ был назначен шести пациенткам. При назначении а-ГнРГ по сравнению с ант-ГнРГ число полученных ооцитов было относительно выше у пациенток с уровнем АМГ 0,5 нг/мл, составив соответственно 2,0±0,0 и 1,5±0,6 ооцитов (5=0,5), по сравнению с женщинами, имеющими уровень АМГ 0,5 нг/мл, у которых число полученных ооцитов составило 1,8±0,4 и 1,7±0,6 соответственно (5=0,1). При назначении а-ГнРГ число полученных ооцитов было относительно выше у пациенток с уровнем АМГ 0,5 нг/мл, составив 2,0±0,0, по сравнению с женщинами, имеющими уровень АМГ 0,5 нг/мл, у которых число полученных ооцитов составило 1,8±0,4, и было несколько выше, чем при назначении ант-ГнРГ (соответственно, 1,5±0,6 и 1,7±0,6).
Доза вводимых гонадотропинов имела обратную корреляционную зависимость с числом полученных фолликулов (г=-0,5636, р=0,0001), ооцитов (г=-0,5591, р=0,0001) и эмбрионов (г=-0,4681, р=0,0001), что объясняется необходимостью дополнительного введения высоких доз Гн при резистентности яичников к стимуляции суперовуляции. Средние дозы вводимых Гн группе с БОО составили 273±58 МЕ/день и были выше, чем в группе контроля - 162±35 МЕ/день (р 0,0001).
Характеристика раннего эмбриогенеза и исходов ВРТ у пациенток с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции
В соответствии с задачей №2 в ходе проспективного когортного исследования у включенных в исследование пациенток проводилась оценка параметров эмбриогенеза и исходов программ ВРТ.
Все полученные ооциты были оплодотворены путем инсеминации или с помощью ИКСИ. Из них было получено 450 эмбрионов: 81 эмбрион в группе БОО (в среднем 1,2±0,8 эмбриона на 1 пару) и 369 эмбрионов в группе с нормальным ответом яичников (в среднем 4,3±2,6 эмбриона на 1 пару) (р 0,0001). В основном все полученные эмбрионы были хорошего качества (А и В): 93,8% и 94,3% в группах сравнения соответственно. В каждом цикле проводился перенос двух эмбрионов сходного качества (таблица 12). Число полученных ооцитов коррелировало с числом полученных эмбрионов (г=0,87, р 0,0001), а также с их качеством (г=0,84, р 0,0001). На 14-15-й день после переноса эмбрионов в полость матки в 49 случаях была диагностирована биохимическая беременность: 15 в группе БОО (23,1%) и 34 в группе сравнения (40,0%) (р=0,0285). Клинически было диагностировано 43 беременности: 12 - в группе БОО (18,5%), 31 - в группе нормального ответа яичников (36,5%) (р=0,0156). ОШгр наступления беременности составило 2,53 (95% ДИ=1,17; 5,49). С учетом выявленных конфаундеров (возраст, характер менструального цикла, длительность бесплодия, уровни ФСГ и АМГ, число полученных ооцитов и эмбрионов) ОШкор наступления беременности составило 1,48 (95% ДИ=0,57; 3,85).
Исследование аутоантител в сыворотке крови и фолликулярной жидкости
По нашим данным, у 18,5% женщин с «бедным» ответом определялся нормальный овариальный резерв. Именно у этих пациенток наблюдались наиболее высокие уровни аутоантител, что может свидетельствовать о ранней фазе аутоиммунного поражения яичников. Наши данные подтверждаются данными других исследователей, которыми было продемонстрировано появление АОА в сыворотке крови за несколько лет до появления симптомов ПНЯ, что характеризует начальную фазу аутоиммунного повреждения яичников [74]. Мы согласны с данными Forges Т. et al. (2004) о том, что определение АОА может иметь значение для прогноза исхода лечения бесплодия методом ЭКО [31]. По данным литературы, АОА обнаруживаются в сыворотке крови пациенток с бесплодием неясного генеза в 1/3 случаев [120]. Количество этих антител коррелирует с уровнем ФСГ и АМГ, поэтому эти антитела могут рассматриваться в качестве маркеров аутоиммунного поражения яичников, предсказывая будущее угасание репродуктивной функции у женщин с необъяснимым бесплодием.
Превалирующая роль генетической изменчивости в снижении овариального резерва в развитии ПНЯ подтверждена многими исследователями. Наследуемость возраста менопаузы, поражение яичников при синдроме Тернера и других X-сцепленных заболеваниях указывают на значимость генов, расположенных на X-хромосоме в формировании клинической и доклинической стадии яичниковой недостаточности [92, 191]. Fu Y.H. et al. (1991) и Chen L.S. et al. (2003) в своих исследованиях выявили, что число CGG-повторов в гене FMR1, расположенного на длинном плече Х-хромосомы в локусе Xq27, равное 29-30, ассоциировано с нормальной работой яичников и может быть принято за условную норму в отношении овариальной функции [181, 196]. Эти данные подтвердил Gleicher N. et al. (2010), которые определили, что нормальная функция яичников наиболее часто выявляется у женщин, имеющих число CGG-повторов в диапазоне от 26 до 34 [79]. Таким образом, число CGG-повторов может быть предиктором овариального ответа, что важно для прогнозирования риска развития ПНЯ и определения стратегии ведения пациенток в программах ВРТ [9, 166].
В нашем исследовании число пациенток с числом CGG-повторов ниже 26 и/или выше 34 было сопоставимо в обеих сравниваемых группах. Однако число повторов более 34 по обоим аллелям гена значительно чаще выявлялось у пациенток с БОО по сравнению с группой контроля. Среднее число повторов по аллелю 2 также было выше у пациенток с БОО. Таким образом, при наличии числа CGG-повторов более 34 шансы развития БОО в нашей группе пациенток повышались в 6,1 раз. Подобной зависимости в развитии «бедного» ответа при наличии числа CGG-повторов менее 26 нами не было обнаружено. Полученные данные лишь частично согласуются с данными литературы, в которых отмечается, что сниженный овариальный резерв в равной степени связан как с более высоким, так и с более низким числом CGG-повторов [76]. По данным Gleicher N. et al. (2009), если число CGG-повторов составляет менее 28, снижение этого числа на каждые 5 повторов ассоциируется со снижением овариального резерва на 40%. Аналогично, если число CGG-повторов составляет более 35, увеличение этого числа на каждые 5 повторов снижает уровень АМГ и уровень овариального резерва на 50% [166]. Некоторые ученые (Chatterjee S. et al., 2009) показали в своих работах, что у женщин с числом CGG-повторов более 30 значимо повышается уровень ФСГ и раньше истощается яичниковый резерв [41]. Bretherick К. et al. (2005) и Bodega В. et al. (2006) выявили, что чем больше число CGG-повторов, тем больше вероятность развития ПНЯ и снижения овариального резерва. Даже при невыраженном повышении числа повторов возможно раннее снижение овариальной функции [38, 102].
Мы проанализировали связь между наличием антител к ткани яичника и числом CGG-повторов в группе женщин с БОО. У пациенток с числом CGG-повторов в диапазоне 26-34 уровень антител к тканям яичника был выше по сравнению с теми, у кого число повторов выходило за нормативный диапазон.
При этом у женщин с нормальным числом CGG-повторов уровень антител к ZP выше 75-ого перцентиля выявлялся в 3,3 раза чаще, чем у женщин с числом повторов, выходящих за референсные значения. Наши данные согласуются с данными Shamilova NN. et al. (2013), у которых аутоиммунная форма ПНЯ в 19 раз чаще выявлялась у пациенток с числом CGG-повторов в диапазоне 28-36 [6, 190].
Мы объясняем выявленные закономерности тем, что у пациенток, у которых отсутствует генетическая предрасположенность к развитию ПНЯ или БОО, повреждающим фактором, действующим на ткань яичников, могут быть различные аутоиммунные антитела. На основании этого можно условно разделить наших пациенток на пациенток с генетически обусловленной формой БОО и аутоиммунной формой БОО. При этом эти две группы женщин отличались по тяжести проявления БОО. У пациенток с аутоиммунной формой БОО степень поражения яичников была менее выраженной. У них был выше уровень АМГ, чем у женщин с генетической формой БОО. Это может свидетельствовать о большей сохранности примордиального пула фолликулов при аутоиммунных поражениях яичников по сравнению с генетически обусловленными формами БОО [6, 190].
В 2008 году ведущие специалисты в области акушерства и гинекологии определили показания для определения CGG-повторов FMR1 гена. Было рекомендовано проведение данного исследования женщинам с подозрением на ПНЯ, включая ее скрытые формы, с наличием семейной предрасположенности к данному заболеванию [133]. Таким образом, число CGG-повторов в гене FMR1 играет важную роль в развитии ПНЯ, одним из клинических проявлений которой является «бедный» ответ на стимуляцию овуляции в программе ЭКО. При нормальном числе CGG-повторов гена FMR1 (от 26 до 34) у пациенток с БОО можно предположить наличие аутоиммунного поражения тканей яичников, тогда как при отсутствии антиовариальных антител БОО может быть ассоциирован с генетическими нарушениями. Аутоиммунная форма БОО характеризуется менее выраженными клиническими проявлениями по сравнению с генетически обусловленным БОО и характеризуется лучшей сохранностью фолликулярного пула. Результаты молекулярно-генетических и иммунологических исследований могут быть полезными для предикции БОО при подготовке к программам ВРТ.
Вышеперечисленные факторы риска развития «бедного» овариального ответа, показавшие значимое влияние на развитие данного состояния в нашем исследовании, а именно, возраст женщины, возраст менопаузы у матери пациентки, уровень АМГ, число CGG-повторов по обоим аллелям гена FMR1, и уровень антител к Zp классов IgM и IgG, были учтены при создании модели прогноза БОО. Достоверность созданных моделей была проверена путем построения кривой ROC. Площадь под кривой (AUC) созданных моделей составила 84% и 89,6%.
Ген BMP 15 (Bone morphogenetic protein gene), расположенный в локусе Хр11.2 Х-хромосомы, ингибирует мРНК, принимающую участие в формировании рецепторов ФСГ в гранулезных клетках яичников. Вследствие того, что мутации гена BMP 15 определяют чувствительность гранулезных клеток к ФСГ, они могут влиять на количество полученных ооцитов и быть предиктором «бедного» овариального ответа (БОО) в программах ВРТ [2, 6, 128, 155]. Проведенное нами молекулярно-генетическое исследование гена BMP 15 у 150 пациенток, проходящих лечение бесплодия методом ЭКО, выявило наличие делеций и миссенс-вариаций, представленных в гетерозиготном состоянии. Многими учеными была показана роль гена BMP 15 в сохранении фертильности и яичникового резерва [91, 128], а также обратная корреляционная зависимость между наличием мутаций в гене BMP 15 и возрастом появления клинических симптомов ПНЯ [14]. Было установлено, что редкие делеций и миссенс-мутации в кодирующей области BMP 15 приводят к быстрому истощению яичникового резерва [135]. Рядом зарубежных авторов было выявлено, что генетические полиморфизмы изучаемого гена могут влиять на исход стимуляции функции яичников в программах ВРТ [17].