Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Современное представление о проблеме невынашивания беременности 12
1.2. Методы прогнозирования осложнений гестационного периода .14
1.3. Роль VEGF в развитии беременности 17
1.4. Роль витамина D в репродуктивной системе 23
1.5. Роль мелатонина в репродуктивной системе 30
1.6. Роль мужского фактора в гестационном процессе 41
1.7. Современные методы терапии угрожающего выкидыша 45
1.8. Клеточный состав эндометрия .47
Глава 2. Организация, объем и методы исследования 50
Глава 3. Результаты собственных исследований .62
3.1. Клиническая характеристика пациенток обследованных групп 62
3.2.Результаты специальных методов обследования. Уровни витамина D в плазме и VEGF в сыворотке крови, уровень мелатонина мочи у женщин с физиологическим течением беременности и при осложненном течении 74
3.3. Особенности гистологической и иммуногистохимической картины децидуальной ткани у женщин с неразвивающейся беременностью и при физиологическом течении 80
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 96
Выводы 114
Практические рекомендации 116
Список сокращений .118
Список литературы 119
- Роль VEGF в развитии беременности
- Роль мужского фактора в гестационном процессе
- Клиническая характеристика пациенток обследованных групп
- Особенности гистологической и иммуногистохимической картины децидуальной ткани у женщин с неразвивающейся беременностью и при физиологическом течении
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В настоящее время угрожающий выкидыш - важнейшая медицинская и социально - экономическая проблема, заслуживающая внимание ведущих научных школ мира. Научное сообщество не прекращает поиски новых причинно–следственных механизмов развития осложнений беременности. Актуальность и значимость проблемы невынашивания обусловлена высоким уровнем перинатальной заболеваемости и смертности.
Эмбриональный период беременности является наиболее уязвимым, особенно в основные критические этапы развития: имплантацию, органогенез, плацентацию (А.М. Торчинов, 2014; А.С. Zenclussen, 2013). Именно в этот период эмбрион наиболее чувствителен к неблагоприятным факторам внешней среды. Формирующаяся плацента еще не реализует защитные функции в полной мере, а темпы пролиферации и дифференцировки на этом этапе высоки, поэтому нарушения гестационной перестройки различных систем у матери могут привести к развитию осложнений или прерыванию беременности (А.Н. Стрижаков, 2012).
Современные знания о молекулярных процессах, происходящих в
критические периоды развития беременности, демонстрируют, что
отдельные показатели, вовлеченные в патогенез осложнений и
неблагоприятных исходов беременности, могут служить потенциальными
маркерами гестационного неблагополучия (Г.Т. Сухих, 2012; М.А. Левкович,
2012). Невзирая на достигнутые в последнее время успехи в профилактике и
лечении угрожающего выкидыша, привычного невынашивания, частота
самопроизвольного аборта остается высокой. Каждая пятая из числа
диагностированных желанных беременностей завершается
самопроизвольным выкидышем или, примерно в равной пропорции, останавливается в развитии. До 80% случаев невынашивания и неразвивающихся беременностей приходится на I триместр гестации (В.Н. Серов, 2014; Ed. S. Gupta, 2015).
При исключении генетического фактора риска невынашивания, а также
эндокринологических, иммунных, анатомических, гемостазиологических
нарушений, не всегда удается установить причину осложнений
гестационного периода.
Улучшение репродуктивного здоровья женщин, выявление новых
звеньев патогенеза осложненного течения беременности, поиск новых
методов лабораторного мониторинга с целью выявления признаков
дестабилизации гомеостаза для оценки риска реализации осложнений гестационного периода, с учетом имеющихся достижений в различных направлениях акушерства и гинекологии, представляется весьма актуальным путем предупреждения возможного демографического кризиса.
Степень разработанности темы исследования. Изучением проблемы
невынашивания беременности занимаются ведущие ученые РФ и мира. На
первый триместр приходится до 85% выкидышей (В.Н. Серов, Г.Т. Сухих,
2014). Основная проблема, определяющая трудности в своевременной
диагностике, обусловлена полиэтиологичностью невынашивания
беременности. Причиной гестационной патологии могут быть генные
мутации и хромосомные нарушения, наследственная предрасположенность,
иммунные и эндокринные нарушения, инфекционные заболевания,
тромбофилические нарушения, анатомические причины (пороки развития
матки, генитальный инфантилизм, гипоплазия матки, истмико-цервикальная
недостаточность, миома матки, синехии) (А.П. Момот, 2013; J. Calleja-
Agius, 2012).
Стремление улучшить перинатальные исходы, в условиях развития
осложнений беременности в первом триместре, послужило поводом для
поиска дополнительных ранних информативных биомаркеров
патологического течения беременности, разработки принципов ранней профилактики и терапии.
Цель исследования: улучшение клинических исходов у женщин с угрожающим выкидышем в первом триместре беременности путем совершенствования (индивидуализации) дифференцированных подходов к тактике ведения угрозы прерывания беременности.
Задачи исследования:
-
Проанализировать современное состояние проблемы угрожающего выкидыша в эмбриональном периоде развития в Воронеже и области в условиях стационара 2 уровня. Выявить особенности психологических, социальных и соматических факторов у беременных в I триместре с угрозой прерывания беременности.
-
Определить роль сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF), витамина D и мелатонина в генезе угрозы прерывания в эмбриональном периоде первого триместра беременности, установив корреляционные взаимосвязи между исследуемыми показателями.
-
Изучить характеристику популяции тучных клеток эндометрия при нормальном и патологическом течении беременности первого триместра (неразвивающаяся беременность). Определить их прогностическую значимость.
4. Разработать алгоритм ведения беременных в эмбриональном
периоде на основе определения 25(ОН)D с целью профилактики гестационных осложнений.
Научная новизна. Изучены преморбидный фон и особенности течения беременности у женщин с угрозой прерывания беременности в эмбриональном периоде первого триместра.
Проведен анализ психологических, социальных и соматических факторов, определяющих развитие такого осложнения, как угрожающий выкидыш.
Выявлена прогностическая ценность определения уровня витамина D у матери, уровня мелатонина, VEGF, как факторов риска осложненного течения беременности.
Установлена корреляционная связь между уровнем 25-
гидроксикальциферола плазмы крови и VEGF сыворотки крови, 25-гидроксикальциферола плазмы крови и уровнем мелатонина мочи.
Впервые дана оценка состоянию популяции тучных клеток в эндометрии при физиологической беременности и неразвивающейся беременности.
Теоретическая и практическая значимость. В результате
проведенного исследования научно обосновано определение уровня
витамина D в плазме крови, мелатонина мочи и VEGF в сыворотке крови у
беременных женщин с угрозой прерывания в первом триместре, что
позволяет своевременно выделить группу риска осложненного течения
беременности. Выявлено, что около 48% госпитализаций и медикаментозной
терапии на малых сроках являются необоснованными (Г.В. Дмитриенко,
2015). Выявление угрожающего выкидыша в первом триместре
беременности с учетом объективных данных позволит исключить
необоснованную госпитализацию и терапию. Углубленное изучение
клеточного состава эндометрия при патологических состояниях в первом
триместре беременности (неразвивающаяся беременность) позволит
расширить имеющиеся представления о патогенезе неразвивающейся беременности и раскрыть новые возможности предгравидарной подготовки. Учитывая фенотипические признаки тучных клеток, возможно дать оценку состоянию местного гомеостаза в эндометрии при имплантации и прогнозировать особенности ремоделирования сосудов и трофобластической инвазии в первом триместре беременности.
Методология и методы исследования. Исследование проводилось на клинической базе кафедры хирургии, акушерства и гинекологии ВГМУ им.
Н.Н. Бурденко, в гинекологическом отделении БУЗ ВО «Городская клиническая больница № 3» с 2013 по 2018 годы.
Методом случайной выборки в рамки исследования включены и
обследованы 160 беременных женщин, проживающих в Воронеже и
Воронежской области. Все обследованные женщины разделены на 3
клинические группы (Рисунок 1):
-
группа (основная группа) – беременные с угрожающим выкидышем в первом триместре, поступившие в гинекологическое отделение на стационарное лечение, беременность у которых была сохранена (n=80).
-
группа (группа сравнения) – беременные с угрожающим выкидышем, чья беременность, несмотря на проводимое лечение, остановилась в развитии (n=40).
3 группа (группа контроля) – беременные женщины (n=40),
поступившие для прерывания беременности (аборт).
Критерии включения в исследование: женщины со сроком до 8 недель беременности.
Критерии исключения из исследования: возраст до 18 лет, наличие многоплодной беременности, аномалии развития органов малого таза, заболевания внутренних органов в стадии декомпенсации, ВРТ, острые инфекционные заболевания любой локализации, заболевания эндокринной системы (сахарный диабет 1 и 2 типов, гестационный сахарный диабет на инсулинотерапии, гипотиреоз, тиреотоксикоз, гиперпаратиреоз, болезнь и синдром Иценко-Кушинга), онкологические заболевания, ревматические заболевания, беременные с признаками эндометрита, подтвержденного иммуногистохимическим исследованием CD 138, хромосомная патология абортуса.
Пациенткам проведено клинико-диагностическое обследование для уточнения генеза осложнений беременности, полученные результаты заносились в специально разработанную компьютеризованную базу данных.
Рисунок 1 – Дизайн исследования
Положения, выносимые на защиту:
-
Имеется тенденция к увеличению числа пациенток с угрозой прерывания беременности ранних сроков. Факторы риска развития угрозы прерывания беременности многочисленны: избыточная масса тела и ожирение, наличие хронических экстрагенитальных заболеваний, ВЗОМТ, последствия воспалительных и травматических повреждений матки, гиповитаминоз D.
-
Гиповитаминоз D повышает риск развития угрозы прерывания беременности. Изменение уровня витамина D коррелируют с величиной мелатонина и VEGF .
-
При повышении продукции VEGF выше критического порога значительно повышается риск замершей беременности.
4. Применение витамина D и белковой диеты, с включением в рацион
беременной продуктов, с большим содержанием триптофана, а также
принятием мер по улучшению качества и продолжительности сна, снижает
риск невынашивания беременности.
5. Характеристики тучных клеток являются дополнительным диагностическим предикторным маркером состояния эндометрия для оценки репродуктивных потерь при неразвивающейся беременности.
Степень достоверности и апробация результатов. В основу математической обработки материала были положены как параметрические методы (t-критерий Стьюдента для нормально распределенных показателей), так и непараметрические методы прикладной математической статистики (U-критерии Манна-Уитни, Уилкинсона, Колмогорова-Смирнова, Фишера), которые позволяют оценить степень различия даже при малой численности групп, и не предполагают нормального распределения параметров. Различия распределений считали достоверными при p<0.05. Вычисления проводили с помощью программного обеспечения ZEN 2.3 (Carl Zeiss), а также с использованием пакета стандартных статистических программ Statistica 6.0 for Windows all, Microsoft Office Excel 2013, Расчетно-Аналитической Системы «Статистика» (РАС «Статистика»), Уведомление о государственной регистрации отчуждения исключительного права по договору, №РД0182154 от 28.09.2015 г. Договор об уступке программ для ЭВМ от 03.07.2015 г.
Материалы диссертационной работы доложены на региональной образовательной конференции РОАГ «Охрана репродуктивного здоровья женщины», г. Воронеж, 2017 г.; международной научной конференции «Постгеномные технологии в медицине: от теории к практике», г. Воронеж, 2017 г.; межрегиональной научно-практической конференции «Инновации в акушерстве и гинекологии с позиций доказательной медицины», г. Воронеж, 2017 г.
Апробация диссертации проведена на межкафедральном заседании кафедры акушерства и гинекологии №1, кафедры акушерства и гинекологии №2, кафедры хирургии, акушерства и гинекологии ИДПО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко 25.12.2017г.
Роль VEGF в развитии беременности
Нормальное развитие плацентарной ткани зависит о т процессов васкулогенеза (развитие кровеносных сосудов из мезодермальных клеток-предшественников) и ангиогенеза (образование новых сосудов из уже существующих сосудистых структур). В гестационный период эти процессы последовательно отражают формирование сосудистой системы зародыша и плаценты [87]. Оба эти процесса имеют главенствующее значение, т.к. эффективный транспорт кислорода, питательных веществ и выведение продуктов обмена веществ зависит именно от них [60].
Васкуло- и ангиогенез регулируются сигнальными молекулами: ростовыми факторами, цитокинами, клетками микроокружения, такими как макрофаги, фибробласты и тучные клетки, гладкомышечные клетки, а также компонентами экстрацеллюлярного матрикса. Инициация, развитие и окончание ангиогенеза в ткани плаценты находится в зависимости от баланса проангиогенных и антиангиогенных факторов. Для развития сосудов плаценты, их функционирования особое значение имеют факторы, стимулирующие пролиферацию клеток эндотелия. С другой стороны, апоптоз клеток эндотелия – физиологический п роцесс, обеспечивающий нормальное развитие сосудистой сети плаценты посредством ангиогенеза и ремоделирования сосудов [60].
В процессе васкулогенеза новые капилляры образуются из мезодермальных клеток-предшественников путем миграции и дифференцировки. Этот процесс находятся под контролем таких сосудистых факторов, как эндотелиальный фактор роста сосудов (VEGF), фактор роста фибробластов (bFGF) и их рецепторов VEGF-R и FGF-R. Известно, что эндотелиальные клетки экспрессируют рецепторы VEGF-R, клетки трофобласта экспрессируют VEGF, обеспечивая дифференцировку, миграцию и пролиферацию клеток эндотелия и формирование сосудистой сети [161].
При завершении ангиогенеза макрофаги, фибробласты и гладкомышечные клетки синтезируют антиангиогенные факторы, ингибирующие миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, не влияя на их жизнеспособность.
К ключевыми факторам, регулирующим ангиогенез гестационного периода, относится белок семейства VEGF, называемый VEGF-A. К этому семейству относят и плацентарный фактор роста (PGF) и белки VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, которые были обнаружены позднее, чем VEGF-A. Наряду с перечисленными, было установлено существование белка VEGF, кодируемого вирусами (VEGF-E), и белок VEGF, обнаруженный в яде некоторых змей (VEGF-F).
Взаимодействие клетки с VEGF осуществляется посредством тирозинкиназных рецепторов: Flt-1 (наблюдается в гемопоэтических, стволовых клетках, моноцитах, макрофагах и эндотелиальных клетках сосудов), Flk-1/KDR (наблюдается в эндотелиоцитах кровеносных и лимфатических сосудов), Flt-4 (экспрессируется только эндотелиальными клетками лимфатических сосудов).
Связывание VEGF с этими рецепторами стимулирует рост эндотелиальных клеток сосуда, их пролиферацию. Установлена экспрессия VEGF-А на ранних сроках беременности при образовании ангиогенных тяжей. К источникам этого ф актора относят стромальные макрофаги ворсин и трофобласт. Известно, макрофаги локально дифференцируются в строме ворсин еще до развития ангиогенных тяжей, что подтверждает факт участия ангиогенного фактора роста, VEGF-А, секретируемого макрофагами, в васкулогенезе. Путем иммуногистохимического исследования выявлено, что экспрессия VEGF-А и его рецепторов наиболее интенсивна на ранних сроках гестации [27].
В исследованиях in vitro продемонстрировано, что VEGF-A стимулирует митогенез клеток эндотелия сосудов и их миграцию. VEGF-A также усиливает проницаемость микрососудов.
Производство белков VEGFxxx может быть вызвано в клетках, вследствие гипоксии, выработки ИЛ-1, ЭФР и ТФР-b. При гипоксии клетка производит один из факторов транскрипции — фактор, индуцируемый гипоксией (HIF). Данный фактор (помимо модуляции эритропоэза) стимулирует выброс белков VEGFxxx. Циркулирующий белок VEGFxxx после связывания с VEGF-рецептором на эндотелиальных клетках путем активации тирозинкиназы запускает ангиогенез.
Факторы транскрипции HIF-1 и HIF-1 организмом синтезируются постоянно, однако фактор HIF-1 в а эробных условиях резко падает. При гипоксии фактор HIF-1 сохраняется, и комплекс HIF-1 / HIF-1 способствует высвобождению белков VEGF.
VEGF экспрессируется клетками стромы эндометрия и железистых эпителиоцитов при действии эстрадиола [28]. Регуляция э кспрессии VEGF в матке и яичниках контролируется лютеинизирующим гормоном и отражает циклическую природу овариального ангиогенеза.
В течение лакунарной стадии имплантации VEGF экспрессируется в клетках цитотрофобласта эмбриональной полости. Затем из клеток цитотрофобласта формируются ворсинки, где имеются уже VEGF и РEGF. Экспрессия VEGF и РEGF имеется в амнионе, хорионе и стромальных клетках. В лакунарную стадию VEGF обнаруживается во всех эпителиоцитах эндометрия, Р EGF только в отдельных очагах эпителия поблизости от места имплантации. Экспрессия VEGF на клетках покровного и железистого эпителия по мере прогрессирования беременности увеличивается, а экспрессия РEGF не изменяется. В течение лакунарной стадии в децидуальных клетках уровень факторов роста незначителен. В стадию имплантации их экспрессия возрастает [112].
М. Plaisier (2009) в своем исследовании показал корреляционную связь между экспрессией ангиогенных факторов и васкуляризацией децидуальной оболочки, а также частотой самопроизвольного прерывания беременности. На начальных этапах плацентации в состоянии относительной гипоксии происходит индуцирование экспрессии сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF) трофобласта. Кроме VEGF, важным аутокринным медиатором функции трофобласта и паракринным регулятором ангиогенеза в дедидуальной ткани является фактор роста плаценты (РEGF) [38].
Имеются предположения, что нарушение ангиогенеза и развития эмбриона при невынашивании может быть связано с VEGF. Однако вопрос прямой связи между VEGF и невынашиванием остается дискуссионным. В то время как некоторые исследования связывают полиморфизм генов VEGF с повышенным риском невынашивания. Наблюдается снижение экспрессии гена VEGF в эндометрии среди беременных женщин с необъяснимыми потерями беременности.
В исследовании, проведенном китайскими учеными в 2016 году, выяснено: изменена ли экспрессия VEGF в первом триместре у женщин с невынашиванием по сравнению с пациентами с нормально протекающей беременностью.
Коннексин 43 (Cx43)- мембранный белок из семейства белков щелевых контактов коннексинов, образующих межклеточные каналы и обеспечивающих диффузию низкомолекулярных соединений между соседними клетками. Cx43 является основным коннексином щелевых контактов в сердце и играет критическую роль в синхронизации сердечных сокращений, в эмбриональном развитии участвует в имплантации зародыша и формировании плаценты. Ученые обнаружили снижение экспрессии VEGF и экспрессии Cx43 у женщин с невынашиванием, указывая, что Cx43 и VEGF могут взаимодействовать друг с другом для поддержания нормальной структуры и функции плаценты во время беременности. Ключевым моментом в процессе формирования плаценты является слияние цитотрофобласта с синцитиотрофобластом. Слой ворсинок на поверхности с инцитиотрофобласта непосредственно вторгается в эндометрий, происходит имплантация. Эксперименты in vitro показали, что усиление активности Cx43 способствовало разрыву соединительных межклеточных коммуникаций во время дифференциации цитотрофобласта в синцитиотрофобласт. Gerbaud и соавт. установлено, что Cx43 ускоряет процесс слияния трофобласта [116]. Rmanathal и соавт. установлено, что Cx43 играют важнейшую роль в контроле паракринной секреции стромальных клеток под децидуальной оболочкой, которые нарушают пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток. И это может оказать влияние на ангиогенез [110]. Было обнаружено снижение экспрессии Cx43 в первом триместре у женщин с невынашиванием. Предполагается, что снижение экспрессии Cx43 может привести к аномальной имплантации эмбриона и нарушению ангиогенеза, что может быть связано с репродуктивными потерями.
Лигидова А.Т. в 2011 году в своем исследовании, где выявляли роль регуляторных молекул, уровней иммунокомпетентных клеток, VEGF, заключила, что наблюдаемый высокий уровень VEGF при угрожающем выкидыше в первом триместре беременности является маркером гипоксии. В исследовании уровень VEGF у пациенток исследуемой группы при угрозе выкидыша был повышен в 5 раз (р 0.001). Автор утвердила, что увеличение продукции VEGF обеспечивает рост сосудов хориона [33].
Роль мужского фактора в гестационном процессе
Мужской фактор в 50% случаев причина бесплодия у супружеских пар. Причины и факторы риска, приводящие к инфертильности и у мужчин, и у женщин известны. Однако роли мужского фактора в невынашивании беременности или развития ее осложнений придают не всегда должное внимание. На протяжении многих лет изучалось негативное влияние факторов окружающей среды, вредных привычек отца, как факторов невынашивания беременности и рождения нездорового потомства, а понимание молекулярных механизмов репродуктивных потерь изучается до сих пор.
Огромное число экспериментов на моделях животных доказывают влияние неблагоприятных факторов среды, пищевого поведения, генотоксинов на целостность ДНК или на структурную организацию хроматина, что может приводить к нарушению передачи генетической информации без изменения числа копий и последовательности генов [40].
Различные исследования при применении ЭКО и ИЦИС показали, что существует корреляционная связь между целостностью ДНК спермы и результатами циклов ЭКО. Имеется повышенный риск потери беременности у женщин, партнеры которых имеют морфологические изменения сперматозоидов. Изучение ультраструктуры сперматозоидов часто демонстрирует дефекты конденсации хроматина и наличие неправильной формы ядер с вакуолями. Доказано, что содержание сперматозоидов с незрелым хроматином достигало 85% в эякуляте мужчин, у жен которых наблюдалось самопроизвольное прерывание беременности. При этом показатели спермограммы соответствовали норме. Правильная конденсация хроматина обеспечивает правильный порядок активации генов отца на ранних этапах развития эмбриона. Нарушение порядка приводит к потере беременности [39].
Также частой причиной инфертильности мужчины или причиной прерывания беременности является ф рагментация Д НК сперматозоидов. При нормальных показателях спермограммы в высоком проценте можно обнаружить с перматозоиды с фрагментацией ДНК у курильщиков, у лиц, подвергающихся воздействию токсических веществ. Показатель 30% прогностически неблагоприятный для наступления беременности. При таком показателе вероятность оплодотворения приближена к 1% и при естественном зачатии, и при применении ВРТ.
Фрагментация ДНК сперматозоидов приводит и к осложнениям беременности. Сперматозоиды с фрагментацией ДНК могут сохранять оплодотворяющую способность. В парах с привычным выкидышем в анамнезе у мужчин можно обнаружить высокую степень повреждения ДНК.
Причины фрагментации ДНК сперматозоидов различны. Возможно ремоделирование хроматина в процессе сперматогенеза, причиной может быть оксидативный с тресс, инфекции и факторы внешней среды. Избыток окислительных радикалов вызывает фрагментацию ДНК сперматозоидов, что приводит к отклонениям эмбрионального развития и потере беременности.
Также к п ричинам, повышающим риск самопроизвольного прерывания беременности, относятся: наследственные факторы риска, травмы мужских половых органов и ли послеоперационные осложнений, влияние вредных факторов окружающей среды, курение, прием алкоголя. Выявляются следующие нарушения сперматогенеза: олигоспермия, тератоспермия, полиспермия, лейкоцитоспермия, снижение белков фертильности. Клинически устанавливаются признаки хронического простатита, уретрита, часто диагностируются инфекции, передающиеся половым путем. Все это приводит к снижению оплодотворяющей способности спермы.
Отметим, что нарушение фертильности сперматозоидов, возможно и при нормальных показателях их количества и подвижности. Так, при патологии акросомы (структурной части головки сперматозоида), обеспечивающей проникновение сперматозоида в яйцеклетку путем выброса ферментов, оплодотворение не наступит.
Современные клиники предлагают различные программы генетического исследования и лечения инфертильности у мужчин и женщин. Одним из ключевых является анализ Azoospermia Factor или AZF фактор. При отсутствии сперматозоидов в эякуляте у бесплодных мужчин в 15% случаев обнаруживается утрата участка хромосомы в локусе AZF. По частоте встречаемости AZF фактор на втором месте среди генетических мутаций у мужчин с бесплодием.
Процесс развития сперматозоидов контролируется особыми генами, которые находятся на Y-хромосоме. Именно на ней находится AZF-область. Она состоит из трех частей, которые отвечают за отдельные гены: AZFa, AZFb, AZFc. Если в этих генах возникают мутации, это приводит к отклонениям сперматогенеза: от снижения количества подвижных сперматозоидов до их полного отсутствия. Именно AZF-локус контролирует процесс развития и созревания сперматозоидов. AZF – фактор, т.е. нарушение нормальной работы локуса AZF, вызывает тяжелые нарушения сперматогенеза, поэтому важно установить, на каком участке произошла мутация.
Исследование Y-хромосомы нужно проводить, если имеются следующие показания: снижено количество сперматозоидов при отсутствии причин нарушения сперматогенеза; незрелые сперматозоиды в эякуляте; отсутствуют сперматозоиды в эякуляте; количество сперматозоидов менее 5 млн/мл; имеется возможность получить сперматозоиды для ЭКО.
Исследователи отмечают, что механизм появления делеции (утрата участка хромосомы) не совсем изучен. Отметим, что утрата участка гена в AZF области может быть частичной. Чаще всего проблемы возникают с потерей участка AZFc. В этом случае прогноз благоприятный. Если затронуты AZFa или AZFb области Y-хромосомы, то получить здоровые половые клетки практически невозможно. Отсутствие локуса AZF встречается 1 на 1000-1500 мужчин. Анализ AZF фактор берётся путем соскоба клеток со слизистой щеки или проводится забор крови из в ены. Метод является в ысокоточным. Если анализ на генетические отклонения отрицателен, важно установить какие же эпигенетические факторы влияют на фертильность эякулята.
С течением времени представления о нормальной характеристике эякулята фертильного мужчины менялись. С увеличением количества исследований и с появлением новых возможностей для повышения их качества, уточняются и пересматриваются данные по сперматогенезу. Общая тенденция заключается в «ослаблении» норм фертильной спермограммы.
В настоящий момент в РФ не существует нормативных документов Минздравсоцразвития с установленными нормами фертильного эякулята. Большинство врачей для оценки анализа используют нормы, предложенные Всемирной Организацией Здравоохранения. Нормы, установленные ВОЗ общепризнаны, а издание, посвященное правилам оценки спермограмм, «Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью» является авторитетным изданием [51]. Референсные показатели эякулята изменены в 2010 году Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) путем модифицирования методики обработки анализа и исследования. В 5 издании «WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen» нормы количества (в 1999 году – норма 20 млн. сперматозоидов/мл и более, а в 2010 году – нормальным считается количество 15 млн./мл), подвижности сперматозоидов, количества нормальных форм сперматозоидов изменились (в 1999 году количество сперматозоидов с нормальной морфологией не указывалось в виду проведения исследований относительно этого вопроса).
Для исследования широко применяются спермоанализаторы, что м ы считаем желательным при выполнении исследования эякулята.
Отметим также, что ни один из нормативных показателей, при которых возможно зачатие, не указывает минимальных значений.
Тщательное обследование пары, своевременное выявление причин невынашивания беременности, а также ее осложнений, позволит преодолеть проблемы с наименьшими психоэмоциональными и экономическими затратами.
Клиническая характеристика пациенток обследованных групп
С целью уточнения генеза развития гестационных осложнений в первом триместре эмбрионального периода было проведено клинико-лабораторное обследование 80 женщин с угрозой прерывания беременности, 40 женщин, чья беременность остановилась в развитии, несмотря на проводимую сохраняющую терапию и 40 женщин группы контроля, прервавших беременность по желанию (аборт).
Средний возраст пациенток сопоставим во всех группах наблюдения, не имел достоверных различий и составлял в основной группе 29.7±0.50 года, в группе сравнения 30.6±0.56 года, в группе контроля 28.8±0.52 года. Как видно из представленных данных Таблицы 1, большую часть групп обследованных формировали женщины в возрасте старше 28 лет. Т ак, в 1 группе они составили 57.5 %, во 2 группе - 85%, в 3 группе - 70%. Достаточно высокие цифры позволяют убедиться в более поздней реализации репродуктивных функций современной женщиной.
Возраст отца будущего ребенка находился в пределах 20 – 54 лет и в основной группе составил 31.2 лет, в группе сравнения – 33.8 лет, тогда как в контрольной – 21.6 лет (р 0.05). Анализируя возраст мужчин (Таблица 2) обследованных женщин выявлено, что почти каждый третий мужчина (30%) в основной группе был старше 35 лет, что в 2 раза чаще по сравнению с группой контроля (30 и 15%, р 0.05). В группе сравнения 35% мужчин были старше 35 лет. В контрольной группе большая часть (85%) мужчин была в возрасте до 35 лет.
В основной группе большинство составляли повторнобеременные -67.5%, первобеременные – 32.5%, в группе сравнения 75% и 25%, соответственно, в группе контроля все женщины были повторнобеременными.
При анкетировании пациенток проводилась оценка социального, психологического и соматического статусов.
Нами была проведена социальная стратификация беременных. При анализе полученных данных установлено, что социальное положение обследуемых женщин значительно различалось (Таблица 3). Большая часть пациенток основной группы были специалистами – 41.25% или служащими -18.75%, в группе сравнения – 25% и 25%, соответственно, в группе контроля 75% женщин неработающие. Оставшуюся долю в основной группе составляли рабочие – 17.5% и неработающие – 11.25%, руководители – 7.5% и учащиеся -3%. Женщин, занимающих руководящую должность, в группе сравнения 20%, долю рабочих в группе сравнения составляли 10% беременных, неработающих женщин – 20%. В группе контроля рабочие составляли 15%, специалисты – 5%, руководители – 5%.
Были проанализированы условия труда работающих пациенток (Таблица 4). Установлен факт сверхурочной работы у 5% и наличие ночных смен у 8.75% женщин из основной группы. У 15% и 5%, соответственно, женщин группы сравнения. 32.5% женщин из основной группы и 45% из группы сравнения указали на психоэмоциональное напряжение в течение рабочего времени.
В связи с этим проведено анкетирование женщин по методике экспресс-диагностики невроза К. Хека и Х. Хесса, с целью определения уровня невротизации, эмоциональной неустойчивости. Низкий уровень невротизации выявлен у 38% женщин из основной группы, у 25% из группы сравнения и у 85% обследованных женщин в группе контроля. Низкий уровень невротизации демонстрирует положительный фон переживаний (оптимизм, спокойствие), социальную смелость, инициативность, независимость и легкость в общении. У 62% обследованных 1 группы, 75% женщин из 2 группы и 15% из 3 группы выявлена высокая вероятность невроза (невротизации), что свидетельствует о выраженных негативных переживаниях (раздражительность, тревожность, напряженность, беспокойство), о безынициативности, о трудностях в общении, о социальной робости и зависимости. В этом случае неизбежно формирование переживаний, связанных с неудовлетворенностью желаний, что приводит к ипохондрической фиксации на личностных недостатках и соматических ощущениях.
При анализе анамнестических данных экстрагенитальные заболевания были выявлены у 80% – в основной группе, у 90% – в группе сравнения и у 35% беременных контрольной группы. Наиболее часто встречались заболевания ССС (расстройство вегетативной нервной системы (ВСД по гипотоническому, гипертоническому и смешанному типам), гипертоническая болезнь, варикозная болезнь вен нижних конечностей): в 41.25% случаев у беременных из 1 группы, в 30% случаев у женщин из 2 группы и в 20% случаев из группы контроля. Ожирение или избыточная масса тела выявлена у 23.75% женщин в основной группе и у 20% в группе сравнения, не наблюдалось в группе контроля. Заболевания желудочно-кишечного тракта (хронический гастрит, хронический панкреатит, хронический холецистит, дискинезия желчевыводящих путей) выявлены у 22.5% женщин 1 группы, у 10% – 2 группы, у 5% – 3 группы. Анемия установлена у 18.75% (практически у каждой пятой) обследуемых основной группы, у 5% в группе контроля, не диагностирована в группе сравнения. Заболевания мочевыделительной системы (хронический пиелонефрит, мочекаменная болезнь, хронический цистит) – у 15% женщин 1 группы, у 30% женщин из 2 группы, у 5% женщин из 3 группы. Заболевания органов дыхания (хронический бронхит, хронический тонзиллит, хронический гайморит, аллергический ринит, бронхиальная астма) наблюдались у 10% обследуемых из 1 группы и у 25% из 2 группы, не были выявлены в 3 группе. Отмечена высокая инфекционная заболеваемость в детстве – 46.25% в основной группе, 80% женщин группы сравнения отметили этот факт и 75% женщин из группы контроля. Часть женщин имела сочетание тех или иных заболеваний (Таблица 5).
Таким образом, обследованные пациентки имели отягощенный соматический анамнез, следовательно, низкий индекс здоровья, на фоне которого женщины реализуют свою репродуктивную функцию. В основной группе здоровые женщины составляли 20%, в группе сравнения – 10%, в группе контроля – 65%. Это подчеркивает важность данного фактора в развитии гестационных осложнений.
Отметим наследственную отягощенность по материнской линии: у 26.25% женщин из 1 группы и у 35% из 2 группы анамнез отягощен по сердечно-сосудистым заболеваниям (ИБС, гипертоническая болезнь, варикозная болезнь), отягощенность по эндокринопатиям (заболевания щитовидной железы, сахарный диабет) - у 15% и 10% женщин 1 и 2 групп, соответственно. У 11.25 % по заболеваниям дыхательной системы (бронхиальная астма, саркоидоз, хроническая обструктивная болезнь легких) в 1 группе и 15% в группе с равнения, по онкозаболеваниям – у 5% обследованных 1 группы. В группе контроля наследственность не отягощена.
Интерес представляет факт изучения мужского фактора в генезе гестационных осложнений. Мужской фактор в 50% случаев причина бесплодия у супружеских пар. Причины и факторы риска, приводящие к инфертильности и у мужчин, и у женщин, известны. Однако роли мужского фактора в невынашивании беременности или развития ее осложнений придают не всегда должное внимание. Огромное число экспериментов на моделях животных доказывают влияние неблагоприятных факторов среды, пищевого поведения, генотоксинов на целостность ДНК или на структурную организацию хроматина, что может приводить к нарушению передачи генетической информации без изменения числа копий и последовательности генов. Фрагментация ДНК сперматозоидов приводит и к осложнениям беременности. В связи с этим мы провели анализ роли мужского фактора в развитии гестационных осложнений. Нами изучены спермограммы половых партнеров. В основной группе обследованных установлено, что 46% результатов спермограмм партнеров соответствовали норме, в группе сравнения – 20%. В результатах спермограмм основной группы имелись те или иные отклонения в 31.25%, в группе сравнения в 15%, чаще всего связанные с малой концентрацией сперматозоидов в эякуляте или со сниженной их двигательной активностью. 22.5%мужчин из основной группы и 65%из группы сравнения обследование не прошли в виду отсутствия желания или в виду неразглашения женщиной данных о половом партнере.
Средний возраст менархе по группам составлял 13.10 лет, 13.80 лет и 13.72 лет, соответственно. Часть пациенток 1 группы отмечала нерегулярность менструального цикла – 11.25% , 2 группы – 10%, основная часть – женщины с устойчивым циклом, который составлял 27.80 дней. Дебют половой жизни состоялся в возрасте 17.80 лет, т.е. до вступления в брак. Анализируя данные, установлено, что регулярный менструальный цикл имели 88.75%, 90%, 100%, соответственно группам (Таблица 6). Характеристика менструальной функции соответствовала физиологическим нормам.
Особенности гистологической и иммуногистохимической картины децидуальной ткани у женщин с неразвивающейся беременностью и при физиологическом течении
Любые знания о патогенезе должны быть расширены за счет исследования местных клеточно-молекулярных взаимодействий. Данные литературы свидетельствуют, что изучение биологической роли тучных клеток, весьма актуальное направление. В настоящее время доказано их участие в аллергических реакциях, адаптивном иммунитете, ангиогенезе, ремоделировании тканей, противоопухолевой защите, заживлении р ан [93]. Актуальным представляется вопрос изучения участия тучных клеток в иммунологических и воспалительных процессах в структуре эндометрия при физиологической беременности и при неразвивающейся беременности.
Одной из протеаз секретома тучных клеток является триптаза. Биологические эффекты триптазы имеют важное значение в развитии аллергии, воспаления, в формировании защитных реакций. Триптаза -основополагающий объект исследования роли тучных клеток в формировании физиологических и патологических состояний и информативный биомаркер ряда заболеваний. В ряде случаев триптаза - инициатор воспалительных реакций, сопровождающихся повышением интенсивности рекрутинга гранулоцитов и повышением проницаемости капилляров [133]. Триптаза участвует в ангиогенезе, в ысвобождении факторов роста, деградации аморфного и волокнистого компонентов внеклеточного матрикса соединительной ткани.
Факт присутствия тучных клеток в тканях может быть необходимым для регуляции иммунитета, защиты организма, поддержания беременности. Изучение биологических эффектов триптазы и химазы в эндометрии путем иммуногистохимического исследования расширит современные представления о функциональном потенциале тучных клеток.
Проведено иммуноморфологическое исследование образцов децидуальной ткани у пациенток 2 группы с неразвивающейся беременностью и у пациенток 3 контрольной группы, прервавших беременность по своему желанию (Таблица 9-12).
Фиксация - 10% нейтральный формалин. Методика: иммуногистохимическое окрашивание мышиными моноклональными антителами к триптазе тучных клеток (abcam, ab2378, разведение 1:2000). Срезы докрашены гематоксилином Майера.
Установлено, что в группе женщин с замершей беременностью количество тучных клеток в децидуальной ткани с признаками мастоцитоза в 2.1 раз выше, по сравнению с контролем (р 0.05). Содержание триптаза – позитивных тучных клеток в группе с замершей беременностью в 4.2 раза превышает контроль (р 0.05) (Рисунок 9).
Фиксация – 10% нейтральный формалин. Методика: иммуногистохимическое окрашивание мышиными моноклональными антителами к триптазе тучных клеток (abcam, ab2378, разведение 1:2000). Срезы докрашены гематоксилином Майера. Активная секреция триптазы в межклеточный матрикс эндометрия и микроокружение децидуальных клеток. Высокое содержание триптазы в области базальной мембраны эпителия маточных желез.
Фиксация – нейтральный 10% формалин. Окрашивание толуидиновым синим. Определяется недегранулированная тучная клетка, локализованная периваскулярно.
Лучшая выявляемость тучных клеток при метахроматическом окрашивании, очевидно, была обусловлена не только большим количеством секреторного продукта в цитоплазме, содержание которого заметно возрастало, но и возрастанием уровня сульфатированности гликозаминогликанов, входящих в с остав секреторных гранул, в том числе, возможно, гепарина. Вместе с этим, в децидуализированном эндометрии возрастало число эозинофилов, некоторые из которых находились поблизости от сосудов микроциркуляторного русла эндометрия (Рисунок 12). Несмотря на неравномерность распределения в эндометрии, можно говорить об активизации эозинофилов и их участии в патогенезе замершей беременности.
Фиксация – нейтральный 10% формалин. Окрашивание по Гимзе. Определяется прилежание эозинофильного гранулоцита к стенке капилляра.
Фиксация – нейтральный 10% формалин. Иммуногистохимическое окрашивание триптазы тучных клеток. А- в строме эндометрия определяется незначительное количество триптаза-позитивных тучных клеток. Б – триптаза-позитивная тучная клетка прилежит к элементам микроциркуляторного русла.
Особенно заметным возрастание объёма популяции тучных клеток в эндометрии отмечалось после иммуногистохимического окрашивания триптазы и химазы (Таблица 10, Рисунок 15).
Фиксация – нейтральный 10% формалин. Иммуногистохимическое окрашивание триптазы тучных клеток.
Часто обнаруживалось контактирование тучных клеток друг с другом, локализованных в различных структурах стромы эндометрия (Рисунок 16-А). Вместе с этим, наблюдалось усиление секреции протеаза-содержащих гранул во внеклеточный матрикс соединительной ткани, которые иногда выявлялись на значительных территориях децидуализированного эндометрия (фото 16-Б). При этом часть тучных клеток, по сравнению с аналогичными в группе контроля, обладали большим содержанием секреторных гранул в цитоплазме. Таким образом, очевидно сочетание интенсивной секреции гранул с их адекватным биогенезом.
Фиксация – нейтральный 10% формалин. Иммуногистохимическое окрашивание триптазы тучных клеток. А – контактирование триптаза-позитивных клеток, сочетающееся с процессами дегрануляции секреторного материала механизмом экзоцитоза. Б – активная дегрануляция тучных клеток, высокое содержание триптаза-позитивных гранул во внеклеточном матриксе соединительной ткани эндометрия.
Существенные изменения состояния популяции тучных клеток децидуализированного эндометрия были обнаружены также при исследовании экспрессии протеаз – триптазы и химазы. В тучных клетках эндометрия группы женщин с замершей беременностью усиливалась экспрессия химазы. При этом, несмотря на общее увеличение количества триптаза-содержащих тучных клеток, результаты множественного иммуномаркирования свидетельствовали о снижении доли тучных клеток с экспрессией триптазы. Происходило достоверное возрастание тучных клеток с одновременной экспрессией триптазы и химазы, а также увеличивалась доля тучных клеток, экспрессирующих исключительно химазу (Таблица 11, Рисунок 18). При этом химаза-позитивные гранулы часто локализовались в строме эндометрия, представляя собой автономный запас фермента вне цитоплазмы тучных клеток.