Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние проблемы бесплодия и риска невынашивания беременности (обзор литературы) 12
1.1. Бесплодие как социальная медицинская проблема. Современные представления об этиопатогенезе бесплодия в браке 12
1.2. Экстракорпоральное оплодотворение как метод преодоления бесплодия 17
1.3. Иммунологическая регуляция ранних этапов репродуктивного цикла 27
Глава 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Дизайн исследования 37
2.2. Методы исследования 39
Глава 3. Особенности клинико-иммунологического гомеостаза при различных исходах беременности 48
3.1. Клиническая характеристика групп 48
3.2. Результаты лабораторного обследования пациенток при подготовке к программе экстракорпорального оплодотворения 56
3.3. Иммунологические особенности ранних сроков беременности, наступившей в результате ЭКО 61
3.4. Гормональная регуляция ранних сроков беременности в исследуемых группах 73
Глава 4. Прогнозирование риска прерывания беременности после экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов 78
4.1. Способ прогнозирования риска прерывания беременности в раннем сроке после экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов 78
4.2. Алгоритм обследования беременных женщин в раннем сроке после экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов 87
Заключение 87
Выводы 94
Список литературы
- Экстракорпоральное оплодотворение как метод преодоления бесплодия
- Методы исследования
- Результаты лабораторного обследования пациенток при подготовке к программе экстракорпорального оплодотворения
- Алгоритм обследования беременных женщин в раннем сроке после экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов
Экстракорпоральное оплодотворение как метод преодоления бесплодия
«Достижения Эдвардса сделали возможным лечение бесплодия, заболевания, которым страдает множество людей — 10 процентов супружеских пар во всем мире», — говорится в заявлении Нобелевского комитета.
Рождение в 1978 году Луизы Браун, которая сейчас сама уже является матерью, буквально перевернуло мир в области лечения бесплодия. Благодаря ЭКО в мире родились несколько миллионов детей. Дискуссия о состоянии здоровья детей, рожденных в результате ЭКО, была очень долгой. Но в работах ученых-медиков, опубликованных в ведущих научных журналах, доказано, что дети, рожденные после ЭКО, ничем не отличаются от детей, рожденных в результате нормальной половой жизни.
Первые попытки ЭКО проводились в естественных циклах. Однако уже очень скоро стали ясны недостатки такого режима выполнения процедуры: получение только одного ооцита; высокий риск потери или получения незрелого ооцита из-за невозможности точно рассчитать время пункции фолликула; привязанность работы целой лаборатории к моменту спонтанной овуляции женщины, закономерно происходящей в большинстве случаев с 2 и до 5 часов ночи; низкая частота наступления беременности. В настоящий момент ЭКО проводят, главным образом, в режиме контролируемой гиперстимуляции яичников. Применение с этой целью препаратов – индукторов овуляции (кломифена, а затем и человеческого менопаузального гонадотропина – чМГ) показало несомненное преимущество такого режима и в том, что касается удобства проведения процедуры, и в конечных результатах: частота наступления беременности выросла в 2–3 раза. Это связывали с увеличением числа переносимых эмбрионов, и их количество поначалу никак не ограничивали – переносили столько, сколько было. Однако накопленный опыт показал, что перенос более 4 эмбрионов практически не приводит к повышению частоты наступления беременности и в то же время грозит наступлением многоплодных беременностей и рождением нежизнеспособных недоношенных детей. В большинстве стран мира был принят запрет на перенос более 4, а затем более 3 и, наконец, более 2 эмбрионов. Был также поставлен вопрос о редукции «лишних» плодов. Однако безопасность редукции для беременности в целом и оставшихся плодов, в частности, как и морально-этические аспекты этой процедуры, до сих пор не имеют однозначного решения.
Двухклеточная теория стероидогенеза в яичниках остается наиболее важной теоретической базой, на которой строятся современная регуляция менструального цикла и индукция суперовуляции. Согласно современной интерпретации этой теории, в растущих фолликулах начала менструального цикла синтез андрогенов (тестостерона и других) из холестерола происходит в клетках теки фолликулов под воздействием стимулирующего действия лютеинизирующего гормона (ЛГ). В то же время в клетках гранулезы фолликулов из тестостерона происходит синтез эстрадиола с помощью фермента ароматазы. Главным стимулятором ароматазы является фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), который действует через свой аденилатциклазный рецептор. Уровень синтеза эстрадиола в фолликулах до 10 мм в диаметре остается невысоким. При достижении доминантным фолликулом более 10 мм в диаметре на клетках гранулезы яичников появляются рецепторы не только к ФСГ, но и к ЛГ. Под воздействием стимуляции ФСГ и ЛГ синтез эстрадиола значительно увеличивается. Высокая концентрация эстрадиола в крови, в свою очередь, вызывает по принципу отрицательной обратной связи снижение выделения ФСГ гипофизом, следствием чего является атрезия фолликулов, не достигших 10 мм в диаметре. В то же время уровень синтеза эстрадиола в доминирующем фолликуле растет экспоненциально и строго коррелирует с диаметром фолликула. При достижении фолликулом овуляторного диаметра (16–23 мм) высокий уровень эстрадиола вызывает по принципу положительной обратной связи пик ЛГ и овуляцию фолликула. Данный механизм лежит в основе селекции доминантного фолликула не только человека, но, вероятно, и других моноовулярных млекопитающих [148, 149].
В конце 70х годов прошлого века исследователями было отмечено, что при овариальной стимуляции препаратами кломифенцитрата и чМГ растущие фолликулы продуцируют высокий уровень эстрадиола, который в естественном цикле мог бы вызвать по принципу положительной обратной связи выброс ЛГ и преждевременную лютеинизацию фолликулов. Однако этот выброс часто не происходит до достижения фолликулами преовуляторных размеров 15–20 мм. Существует предположение, что фолликулы продуцируют некую субстанцию, ингибирующую выброс ЛГ. Установлено, что данное биологически активное вещество по своим свойствам и структуре отличается от ингибинов и выделяется клетками гранулезы в ответ на стимуляцию ФСГ. Лишь в середине 90 годов XX века эта субстанция была охарактеризована и получила название «фактор отмены пика гонадотропинов» [150]. Найдено, что активность этого вещества в фолликулярной жидкости зависит от размеров фолликула и максимальна в фолликулах от 5 до 15 мм в диаметре, после чего резко снижается [151]. Также доказано, что уровень фактора отражает качество фолликулов, и у женщин со сниженным овариальным резервом фолликулы продуцируют малые количества данного фактора, что может объяснять частую раннюю лютеинизацию фолликулов у таких женщин [152].
Появление в начале 60 х годов минувшего столетия первых препаратов, содержащих ФСГ (чМГ и человеческий гипофизарный гонадотропин – чГГ), позволило проводить лечение женщин с хронической ановуляцией. Основываясь на этих работах, J.Brown (1978 г.) и D.Baird (1987 г.) предложили теорию роста и селекции доминантного фолликула, получившую название теории «окна» [153, 154]. Согласно этой теории, для роста антральных фолликулов 3–5 мм в начале фолликулярной фазы цикла уровень ФСГ должен преодолеть определенное значение, так называемый порог. Уровень данного порога строго индивидуален и, скорее всего, зависит от овариального резерва (уровня базального ФСГ).
В нормальном менструальном цикле механизм, описанный выше, снижает уровень ФСГ в середине фолликулярной фазы цикла и в овуляцию уходит только один фолликул. Тем не менее при индукции суперовуляции длительное воздействие экзогенного ФСГ позволяет фолликулам до 10 мм в диаметре избежать атрезии и достигнуть овуляторного размера. Долгое время дискутировался вопрос о том, что важнее для множественного роста фолликулов: однократное воздействие высокой дозы ФСГ (превышение порога) или хроническое воздействие более низкой дозы ФСГ (расширение «окна»)? В работе I.Schipper и соавт. сравнили действие однократной высокой дозы ФСГ (375 мЕД), назначенной в самом начале менструального цикла, и низких доз ФСГ (75 мЕД), назначаемых ежедневно со 2–3го дня менструального цикла [155]. Выяснилось, что однократное воздействие высокой дозы ФСГ не влияет на формирование одиночного доминантного фолликула и лишь вызывает более бурный рост предоминантных фолликулов. В то же время хроническое назначение низких доз ФСГ позволяет фолликулам преодолеть механизм формирования одного доминантного фолликула и вызывает образование нескольких преовуляторных фолликулов.
Методы исследования
Работа выполнена на базе ФГБУ «Уральский научно исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Министерства здравоохранения России в период с 2011-2014 г.г.
Пациентки получали первичную консультативную помощь в отделении вспомогательных репродуктивных технологий института, проходили необходимое обследование, лечение, подготовку к родоразрешению, а также родоразрешались в акушерских клиниках ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России в 2011-2014 г.г.
Иммунологические, микробиологические и молекулярно биологические исследования осуществлялись в отделении иммунологии и микробиологии института (руководитель – д.м.н., профессор Чистякова Г.Н.). Проведено проспективное когортное исследование течения беременности, наступившей в результате ВРТ. Для оценки роли показателей иммунного и гормонального статуса в эффективности сохранения беременности раннего срока после вспомогательных репродуктивных технологий, а именно экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в полость матки, из всех супружеских пар, проходящих лечение бесплодия в отделении вспомогательных репродуктивных технологий ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России, нами были отобраны 88 пациенток.
В первую группу были включены пациентки, программа ЭКО которых завершилась наступлением беременности, ее нормальным развитием и закончилась срочными родами (n=48).
Вторую группу составили женщины после успешной процедуры ЭКО, беременность которых прервалась в сроке до 12 недель (n=12).
В качестве группы сравнения (3-я группа) было отобрано 28 женщин со спонтанно наступившей беременностью, завершившейся рождением живого здорового ребенка. В группу включались женщины, которые не имели бесплодия и невынашивания беременности в анамнезе до родов.
Экзаменационную группу составили 30 женщин с бесплодием, участвующие в программе ЭКО. Группа сформирована для проверки эффективности способа прогнозирования риска прерывания беременности в раннем сроке после экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов.
Достаточность объема выборки в группах для получения статистически значимых результатов была проверена с помощью анализа мощности исследования (Statistica 6) при использовании смещенного F распределения. Параметр смещенности NCP рассчитывался из предполагаемых средних Mu1 и Mu2, размеров выборки каждой из сравниваемых групп (N1 и N2), и общего стандартного отклонения (StDev). Для проверки были использованы средние значения статистически значимых иммунологических показателей с уровнем значимости равным 0,05. Минимальная выборка, имеющая мощность равную 80% составила 12 человек. Всем пациенткам выполнено клинико-лабораторное обследование, по результатам которого исключены инфекции, передающиеся половым путём, гормональные нарушения и мужской фактор бесплодия. В качестве дизайна выбрано проспективное, сравнительное, когортное исследование. Критериями включения в группу являлись трубно-перитонеальный генез бесплодия, репродуктивный возраст (от 25 до 35 лет) и сохраненный овариальный резерв (уровень ФСГ не более 11,0мЕд/л).
Критериями исключения из группы являлись мужской фактор бесплодия, миома матки (деформирующая полость матки, или размеры узла в диаметре более 3см), тяжелые формы эндометриоза (аденомиоза), репродуктивный возраст старше 40 лет. Всем пациенткам основной группы была выполнена программа экстракорпорального оплодотворения, завершившаяся переносом эмбрионов в полость матки. После проведения процедуры ЭКО и ПЭ дополнительно были исключены из основной группы те пациентки, у которых по различным причинам (острый воспалительный процесс, преждевременная овуляция, патология оплодотворения и т.д.) программа была остановлена.
Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России. В соответствии с положениями Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации последнего пересмотра, у всех беременных женщин до момента включения в исследование было получено информированное согласие на использование биологического материала.
При выполнении работы определена двухэтапная программа исследований. Основной задачей первого этапа явилось изучение соматического, акушерского и гинекологического анамнеза пациенток, а также оценка гематологических, биохимических, гемостазиологических, молекулярно-генетических и иммунологических показателей на этапе подготовки к ЭКО. На втором этапе проведена оценка результатов гормональных и иммунологических исследований, выполненных проспективно у женщин в первом триместре беременности.
Результаты лабораторного обследования пациенток при подготовке к программе экстракорпорального оплодотворения
Относительные показатели лимфоцитов во всех трех группах пациенток статистически значимо не отличались. Практически все зрелые Т-лимфоциты экспрессируют на своей поверхности CD3 маркерные молекулы, поэтому уровень CD3+ клеток является интегральным (обобщающим) показателем Т-клеточного звена иммунитета. Относительное содержание CD3+ -лимфоцитов не превышало верхнюю границу нормы, и было сопоставимо во всех трех группах. По абсолютным значениям число Т-клеток у женщин, беременность которых прервалась в раннем сроке, в 1,6 и 1,8 раза превышало таковые 1-й и 3-й групп (р1-2, 2-3=0,001).
У женщин после ЭКО с пролонгированной беременностью отмечалось повышение относительного и абсолютного содержания CD19+ -лимфоцитов (р1-3=0,003 и 0,014 соответственно), а у пациенток с неблагоприятным исходом беременности обнаружено увеличение только абсолютного числа В-клеток (р2-3=0,003) по сравнению с группой женщин, беременность которых наступило спонтанно.
Абсолютное и относительное содержание Т-хелперов (СD4) во всех трех группах оставалось в пределах нормативных значения. При этом абсолютное содержание CD4+ -клеток в группе женщин с прервавшейся беременностью статистически значимо превышало аналогичные показатели 1-й группы и группы сравнения. Увеличение числа CD4 может отмечаться при усилении Th2-типе иммунного ответа, что часто приводит к неблагоприятным исходам беременности.
По данным литературы плод является аллотрансплантатом, несущим набор антигенов матери и отца и для благоприятного исхода беременности необходимо повышение супрессорной активности лимфоцитов [116]. Прерывание беременности в ранних сроках, по мнению некоторых авторов, связано со снижение количества CD8+ -клеток [48].
Проведенные исследования показали, что у всех женщин, беременность которых наступила после процедуры ЭКО, статистически значимых различий абсолютном и относительном количестве цитотоксических Т-лимфоцитов не выявлено. Тем не менее, у женщин 2-й группы с прервавшейся беременностью отмечалось снижение на уровне тенденции процентного содержания CD8+ -клеток (р2-3=0,043), хотя их абсолютное значение несколько превышало таковые контрольной группы (р2-3=0,027).
Статистически значимых различий в соотношение Т-хелперов и Т-супрессоров (СD4/СD8) также не обнаружено. Лимфоциты с фенотипом CD16/56 во всех группах встречались в одинаковом относительном и абсолютном содержании, но достоверно отличался показатель относительной концентрации естественных киллеров в подгруппе В по сравнению с контрольной выборкой (0.48±0.03 против 0.35±0.016, р=0.012). Наиболее значимым показателем неблагоприятного исхода беременности является уровень натуральных киллеров (CD3-СD16+56+), обладающих потенциальной способностью повреждать клетки трофобласта в результате конверсии в лимфокин-активированные клетки. [79] Проведенные исследования показали, что у женщин с неблагоприятным исходом беременности, абсолютное количество натуральных киллеров статистически значимо превышало параметры группы сравнения (р2-3=0,012). Результаты исследования гуморального звена иммунитета представлены в таблице 13. Таблица 13 Показатели гуморального звена иммунитета и неспецифических факторов защиты в сравниваемых группах, МЕ (Р25-Р75)
Функциональная активность В-клеточного звена иммунитета в ответ на антигенную стимуляцию характеризуется продукцией иммуноглобулинов. В литературе имеются данные об изменении продукции IgA, IgM и IgG в сыворотке крови у женщин с привычным невынашиванием, неразвивающейся беременностью и синдромом задержки роста плода. Однако значимых различий в содержании сывороточных иммуноглобулинов у женщин сравниваемых групп не выявлено, за исключением пациенток 1-й группы, у которых содержание IgG на уровне тенденции превышало показатели группы сравнения (р1-3=0,028). НСТ-тест - это тест восстановления нитросинего тетразолия, который ставится в двух вариантах: спонтанный и индуцированный. При постановке спонтанного НСТ-теста фагоциты культивируют в присутствии НСТ без предварительной активации клеток, при проведении индуцированного НСТ теста в среду культивирования добавляют активатор фагоцитарной реакции.
Постановка НСТ-теста в двух вариантах позволяет рассчитать функциональный резерв клеток, который представляет собой разницу между числом (интенсивностью) индуцированных диформазанпозитивных клеток и количеством (интенсивностью) спонтанных диформазанпозитивных клеток [21].
При обследовании беременных женщин статистически значимых различий в спонтанной НСТ-активности нейтрофилов не выявлено. Тем не менее, у пациенток 2-й группы с неблагоприятным исходом беременности отмечалось снижение значений данного показателя на уровне тенденции по сравнению с таковыми контрольной группы (р2-3=0,028).
В стимулированном варианте НСТ-теста нейтрофилов у женщин с неблагоприятным исходом беременности количество фагоцитов, способных восстанавливать НСТ позитивных клеток было в 1,4 и 1,6 раз ниже, чем у женщин 1-й и 3-й групп (р1-2=0,037, р2-3=0,004), что свидетельствует об истощении функционального резерва этих клеток при стимуляции. Известно, что коэффициент стимуляции (КС) характеризует способность клетки оперативно и адекватно реагировать на внешнее воздействие усилением окислительного метаболизма. Значение показателя КС у пациенток сравниваемых групп статистически значимо не отличался. Существенную роль в развитии беременности выполняет система комплемента. При попадании в кровь беременной женщины антигенов плода и образовании иммунных комплексов происходит взаимодействие компонентов комплемента с образованием промежуточных продуктов, с повреждением мембран клеток-мишеней, повышением сосудистой проницаемости, формированию острого воспаления эндотелия сосудов и цитолизу ряда клеточных мембран, что в конечном итоге приводит к невынашиванию беременности.
Алгоритм обследования беременных женщин в раннем сроке после экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов
Все обследованные нами женщины были сопоставимы по возрастным категориям, тем не менее, средний возраст пациенток с бесплодием превышал таковой женщин группы сравнения, однако статистически значимых различий между группами женщин с благоприятным и неблагоприятным исходом не выявлено. Необходимо отметить, что более трети пациенток основной группы с пролонгированной беременностью имели возраст от 35 до 39 лет, против 8% случаев женщин, беременность которых прервалась, хотя по данным литературы поздний репродуктивный возраст (старше 35 лет) является фактором риска ранних выкидышей.
При анализе анамнестических данных мы пришли к выводу, что наличие экстрагенитальной патологии, у пациенток страдающих бесплодием, по своей структуре и частоте встречаемости сопоставимо с соматической патологией женщин, беременность которых наступила спонтанно. Это можно объяснить особенностью выборки пациенток, прошедших процедуру ЭКО. Женщины до беременности были обследованы на соматическую патологию, получили разрешение на проведение программы ВРТ.
По данным акушерско-гинекологического анамнеза у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием значительно чаще регистрировалась эктопическая беременность, а также наличие оперативных вмешательств.
Более чем у половины женщин с беременностью, наступившей после процедуры ЭКО, и впоследствии закончившейся выкидышем в ранние сроки гестации в анамнезе отмечался хронический эндометрит и в 50% наблюдений – проведение лапаротомии.
Сравнительный анализ перенесенных ИППП показал, что при угрозе прерывания беременности у женщин в 3 раза чаще, чем при спонтанной беременности и в 2 раза чаще, чем у пациенток с благоприятным исходом беременности после процедуры ЭКО в анамнезе регистрировались инфекции, передающиеся половым путем. Однако статистически значимых различий по данным бактериологического, ИФА и ПЦР анализа на этапе подготовке к ЭКО, не выявлено. Необходимо отметить, что у пациенток, беременность которых закончилась выкидышем до 12 недель гестации, наиболее часто выявлялись специфические IgG к Toxoplasma gondi (58,3% против 35,4% и 14,3% случаев в первой и третьей группах), что вероятно обусловлено местом проживания пациенток (все пациентки этой группы были из области).
При лабораторном обследовании пациенток в процессе подготовки к ЭКО статистически значимых различий в показателях гемограммы не обнаружено. Вместе с тем, при проведении биохимического исследования крови у женщин с неблагоприятным исходом беременности обнаружено повышение уровня печеночных ферментов (общего билирубина – на уровне тенденции и его конъюгированной и неконъюгированной фракций – статистически значимо) по сравнению с женщинами первой и третьей групп с пролангированной беременностью.
На следующем этапе мы проанализировали особенности иммунологических показателей у женщин с беременностью после ВРТ по сравнению с женщинами, беременность которых наступила спонтанно. Проведенные исследования показали, что развитие угрозы прерывания беременности сопровождается напряженностью клеточного звена иммунитета, что подтверждается повышением количества лейкоцитов и лимфоцитов за счет увеличения абсолютного числа основных популяций: CD3+, CD4+, CD8+, CD3-CD16+CD56+ и снижением функционального резерва нейтрофилов в ответ на стимуляцию (по результатам НСТ-теста)
Одним из факторов, влияющих на провоспалительную направленность клеточных реакция, является наличие инфекционных заболеваний.
В нашем исследовании в группе женщин, беременность которых прервалась в раннем сроке гестации, были выявлены положительные корреляции между перенесенными ИППП и регуляторными CD4+ -клетками, а также сывороточным IFN-, который в свою очередь был ассоциирован с наличием IgG к TOXO. Другим фактором, способствующим активации клеточного звена иммунитета, может явиться поддерживающая терапия, что косвенно подтверждается наличием положительных связей между применением эстрогенов и уровнем CD3+- и CD4+-лимфоцитов, курсовой дозой ФСГ и количеством NK-клеток. А наличие отрицательной ассоциации между метаболической активностью нейтрофилов в стимулированном НСТ-тесте и курсовой дозой ФСГ, свидетельствует о супрессивном влиянии данного гормона на функциональную активность моноцитарно-макрофагального звена.
Установлено, что критерием угрозы прерывания беременности в раннем сроке является повышение уровня Т-лимфоцитов, продуцирующих IFN- и выраженный сдвиг индекса поляризации цитокин-продуцирующих клеток в сторону клеточно-опосредованного иммунного ответа.
Несмотря на то, что не удалось выявить статистически значимых различий в содержании IFN-, хотя значение медианы данного показателя более чем в 2 раза превышало таковые женщин при спонтанной беременности и снижение сывороточного IL-4 было характерным для всех женщин, беременность которых наступила после процедуры ЭКО, полученные результаты позволяют заключить, что при патологически протекающей беременности не наблюдается включения фетопротективных механизмов, активирующих иммунную систему в направлении синтеза цитокинов Th2-типа и оказывающих, вероятно, модулирующее влияние на Th1-зависимый иммунный ответ. Косвенным подтверждением этому является наличие отрицательных корреляций между повышенным количеством лимфоцитов, в том числе В- клеток и Т-цитотоксических лимфоцитов, обладающими эффекторной функцией со сниженным уровнем противовоспалительного IL-4.
Молекулярные механизмы действия провоспалительных цитокинов, связаны прежде всего с тем, что IFN- может непосредственно ингибировать пролиферацию трофобласта. Во-вторых, IFN- стимулирует NK-клетки и цитотоксические Т-лимфоциты, формируя лимфокинактивированные клетки-киллеры, обладающие потенциальной способностью повреждать трофобласт, на что указывают обнаруженные нами корреляции между содержанием CD8+ - лимфоцитов и уровнем IFN-.
Таким образом, количественный и качественный состав цитокинов решающим образом влияет на развитие беременности. Регуляция синтеза цитокинов во время беременности направлена на перестройку межклеточных взаимоотношений, которая должна обеспечить нормальное функционирование органов и систем материнского организма и вынашивание генетически чужеродного плода. При нарушении цитокинового баланса с преобладанием провоспалительных факторов возможно нарушение нормального развития трофобласта до спиральных артерий и формирования межворсинчатого пространства, обусловливающее риск прерывания беременности в раннем сроке.