Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современное состояние проблемы заболеваний шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией (обзор литературы) 10
1.1. Современные клинические аспекты профилактики рака, скрининга, тактики ведения и лечения при заболеваниях шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией 10
1.2. Патогенетические механизмы заболеваний шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией: реалии и перспективы изучения проблемы 21
ГЛАВА 2. Общая характеристика обследованных больных и методы исследования 33
2.1. Дизайн исследования 33
2.2. Общая клиническая характеристика больных 35
2.3. Методы и объем исследования 49
2.4. Методы статистического анализа 68
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 72
3.1. Клинико-анамнестические особенности при заболеваниях шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией, в обследованных группах больных 72
3.2. Молекулярно-биологические особенности процессов ацетилирования, метилирования и пролиферации при заболеваниях шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией 116
3.3. Особенности тактики ведения и формирование групп риска по прогрессированию патологического процесса и злокачественной трансформации при заболеваниях шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией. 133
ГЛАВА 4. Заключение. Обсуждение полученных результатов исследования 158
Выводы 175
Практические рекомендации 177
Список литературы 178
- Современные клинические аспекты профилактики рака, скрининга, тактики ведения и лечения при заболеваниях шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией
- Патогенетические механизмы заболеваний шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией: реалии и перспективы изучения проблемы
- Общая клиническая характеристика больных
- Молекулярно-биологические особенности процессов ацетилирования, метилирования и пролиферации при заболеваниях шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией
Современные клинические аспекты профилактики рака, скрининга, тактики ведения и лечения при заболеваниях шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией
Вместе с тем цитологический метод имеет ряд недостатков: остается высокой частота ложно-положительных результатов; наиболее ненормальные (ASCUS или более) результаты цитологии не рассматриваются как CIN 3 или инвазивный рак [81, 156]. Цитологическая интерпретация ASCUS относится к категории морфологической неуверенности и определяется выражением «некоторые, но не все», при этом в исследуемом цитологическом образце могут быть представлены атипичные клетки, количественная и качественная оценка которых не позволяет отнести их к LSIL. Также ввиду своей морфологической двусмысленности ASCUS не позволяет делать достоверные прогнозы [213]. Результаты опубликованных исследований показывают, что риск предраковых заболеваний в целом низок у женщин с ВПЧ (-) и ASCUS, а выше у пациенток с ВПЧ (+) и цитологическими данными ASCUS+, и они должны быть дообследованы в объеме кольпоскопии [237].
По эпидемиологическим данным, практически 100% случаев заболевания РШМ являются ВПЧ-ассоциированными [235]. Подтверждение этиологической роли ВПЧ в патогенезе РШМ привело к созданию следующей модели канцерогенеза: инфицирование ВПЧ, его персистенция в отсутствии элиминации, прогрессирование до предрака, собственно инвазия [100, 235]. Заражение генитальным ВПЧ происходит, как правило, при половом контакте. У большей части населения пик инфицирования ВПЧ приходится на следующие несколько лет после сексуального дебюта [185]. 90% случаев ВПЧ-инфицирования являются транзиторными и не обнаруживаются уже через 1– 2 года [192]. Те женщины, у которых ПВИ становится персистирующей, подвергаются риску развития предраковых заболеваний ШМ.
Установление этиологической связи между ВПЧ и РШМ привело к разработке молекулярных тестов ВПЧ, которые обладают большей чувствительностью, но меньшей специфичностью. ВПЧ-тесты позволяют лучше определить прогностический риск развития у женщины CIN 3 в течение последующих 5–15 лет, чем цитологические исследования [118, 202, 207]. Включение ВПЧ-тестирования в стратегию профилактики РШМ способствует увеличению выявления заболеваний и расширению временных промежутков между повторными осмотрами у специалистов. ВПЧ-тестирование не рекомендуется проводить у женщин моложе 30 лет [119, 135, 183] из-за высокой распространенности ВПЧ-инфекции у данного контингента, что обусловливает повышение количества необоснованных лечебно-диагностических процедур.
Отличительными качествами ВПЧ-тестирования являются большая чувствительность и меньшая специфичность относительно выявления CIN 3+ и CIN 2+ [110] и лучшая воспроизводимость, чем при цитологическом исследовании [97]. В большинстве опубликованных результатов исследований отражено, что добавление ВПЧ-тестирования к цитологическому анализу увеличивает процент выявления CIN 3, а при следующих скринингах, наоборот, отмечено снижение случаев выявления CIN 3+ и РШМ [95].
При совместном тестировании ВПЧ- и РАР-тестов отмечено значительное повышение чувствительности исследования при небольшом снижении специфичности в выявлении пациенток с CIN 3+ [78]. В мета-анализе [78] чувствительность ВПЧ-тестирования показала на 37% лучшие результаты по сравнению с цитологическим методом, где случаи от LSIL+ рассматривались как позитивные. Однако специфичность ВПЧ-теста была на 7% ниже. При сравнении прогнозов у женщин с результатами отрицательной цитологии с пациентками, у которых ВПЧ-тест был отрицательным, было выявлено, что риск развития CIN 3+ [118] и, что более важно, РШМ [193], был ниже.
Согласно рекомендациям американского общества кольпоскопии и патологии ШМ [80], скрининговые мероприятия, направленные на профилактику РШМ, должны начинаться в 21 год. Женщины моложе этого возраста не должны проходить скрининг, вне зависимости от момента начала половой жизни и других факторов риска. Объясняется это редкой встречаемостью РШМ у молодых женщин [99] и невозможностью профилактики его за счет цитологического скрининга [197]. Показатели заболеваемости РШМ в этой возрастной группе не изменились за последние четыре десятилетия на фоне увеличения интенсивности скрининговых мероприятий [99].
По данным литературы, в течение всей жизни у пациенток в зависимости от частоты проведения скрининговых мероприятий имеется разный риск возникновения РШМ: без скрининга — 31–33 случая на 1000 женщин; скрининг раз в 3 года — 5–8 случаев на 1000 женщин [216]; скрининг раз в 2 года — 4– 6 случаев на 1000 женщин [148]; скрининг раз в год — 3 случая на 1000 женщин [129]. Таким образом, пожизненный риск летального исхода от РШМ при скрининге раз в 3, 2 и 1 год составляет 0,05, 0,05 и 0,03 случая на 1000 женщин соответственно.
Многие исследователи полагают, что ежегодный скрининг способствует незначительному увеличению выявляемости случаев РШМ, но сопровождается назначением огромного количества необоснованных лечебно-диагностических процедур по поводу широко распространенных транзиторных ВПЧ ассоциированных поражений, склонных в большинстве случаев к самостоятельной регрессии в течение одного или двух лет, в отличие от небольшого количества тех, которые в течение многих лет приводят к развитию РШМ [148, 216]. Установлено, что ежегодный скрининг приводит к удвоению числа кольпоскопий по сравнению со скринингом, проводимым 1 раз в 3 года, при незначительном снижении риска развития РШМ [148].
Патогенетические механизмы заболеваний шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией: реалии и перспективы изучения проблемы
Оксид азота (NO) — второй ключевой фактор в ангиогенезе. TSA уменьшает уровень NO посредством подавления endothelial nitric oxide synthase (eNOS) [192]. HDAC7 формирует комплекс с HIF-1 и перемещается к ядру, усиливая транскрипционную активность HIF-1 в ответ на гипоксическое повреждение, в результате чего происходит повышение уровня целевых генов HIF-1, включающих VEGF [141]. Другое исследование описывает кардиоваскулярные патологии у HDAC7 мутантных мышей, при этом HDAC7 угнетает экспрессию ММР10 за счет взаимодействия и угнетения активности MEF21 [102]. Генетическое подавление HDAC7 уменьшает миграцию эндотелиальных клеток и изменяет формирование капилляроподобных структур за счет индуцирования platelet-derived growth factor-B (PDGF-B) и его -рецептора [174]. Депсипептид также ингибирует опухолевую неоваскуляризацию, вероятно, за счет ингибиции проангиогенных факторов, таких как EGFR, или индукции антиангиогенных факторов, таких как von Hippel Lindau [150]. LBH589 подавляет ангиогенез за счет ингибиции формирования эндотелиальной трубки и экспрессии VEGF-сигнальных факторов, таких как ангипротеин 2, сурвивин и CXCR4 [187]. Таким образом, iHDAC подавляют неоваскуляризацию за счет ингибирования факторов, способствующих ангиогенезу, или развития отклонений от нормы в сигнальной регуляции ангиогенеза.
С вышеуказанных позиций особого внимания заслуживают данные Liu N., Zhao L.J., Li X.P. [158] об iHDAC, используемых в терапии РШМ в связи с их свойством вызывать апоптоз. Авторами были выявлены чрезвычайно интересные взаимосвязи между применением iHDAC, процессами ацетилирования, метилирования и апоптозом. В исследовании был выбран Trihostatin A (TSA — классический iHDAC) для исследования механизма индукции апоптоза в раковых клетках iHDAC. Авторы обнаружили, что iHDAC индуцируют апоптоз только раковых клеток ШМ, а в отношении нормальных клеток данные вещества не имели цитотоксического эффекта в терапевтических дозах, 90±8,4% нормальных клеток выжили после взаимодействия с TSA в концентрации 1 mol/L. Кроме того, iHDAC снижали уровень DNMT 3B в раковых клетках ШМ, но не в нормальных клетках. Спровоцированное падение уровня DNTM 3B вызвало интенсивный апоптоз раковых клеток ШМ [158].
Не менее интересными оказались результаты исследования Song C., Zhu S., Wu C. [211], в котором было выявлено, что уровень экспрессии HDAC 10 был ниже у пациенток с метастазами лимфатических узлов, чем у пациенток без метастазов лимфоузлов при плоскоклеточном РШМ. Усиленная экспрессия HDAC 10 в клетках РШМ значительно снизила подвижность клетки и её инвазивность в условиях in vitro и способность к метастазированию in vivo. Что касается механизма, то HDAC 10 подавляла экспрессию matrix metalloproteinase (MMP) 2 и 9 генов, которая, как известно, критически необходима для способности клетки к инвазии и метастазированию. На молекулярном уровне HDAC 10 связывается со 2 и 9 промоутерными зонами ММР, уменьшая уровень ацетилирования гистонов и блокируя возможность связывания с РНК-полимеразой 2 в этой области. Кроме того, мутантный HDAC 10, испытывая недостаток в активности деацетилазы гистонов, не выполнял функцию полновесного протеина. Результаты исследования обнаружили критически важную роль HDAC 10 в подавлении метастазирования РШМ, подчеркивая важность развития области поиска изомеров iHDAC для лечения больных плоскоклеточным РШМ [211].
Первоначально трихостатины были выделены из Streptomyces hygroscopicus в качестве противогрибкового антибиотика в 1976г. [224]. Спустя 10 лет было обнаружено, что трихостатин А (TSA) и его аналоги вызывают дифференцировку крысиных эритролейкемических клеток и индуцируют гиперацетилирование гистоновых белков в наномолярных концентрациях. TSA был экстенсивно изучен; он проявлял противоопухолевую активность и вызывал дифференцировку некоторых клеточных линий рака. Эффективная доза TSA, под воздействием которой ингибируется 50% клонального роста (ED 50) в клеточных линиях РШМ (CaSki, ME 180 и SiHa), была подсчитана и колебалась между 4,3х10-8М и 9,8х10-8 [219]. Кроме того, клетки РШМ HeLa, HT3 и С33А были пролечены комбинацией препаратов TSA с другим цитотоксическим агентом [123]. В дополнение стоит отметить примечательный факт, что TSA в состоянии уменьшать вредоносное воздействие радиации на кожу в ходе лучевой терапии [107].
Итак, iHDAC являются объектом интенсивных исследований для терапии онкологических болезней. Различные по структуре iHDAC находятся на разных стадиях клинических испытаний, при этом некоторые из них показывают многообещающие результаты в отношении терапии некоторых видов рака.
За последние несколько десятилетий рост понимания эпигенетики привел к значительному расширению наших знаний о её роли в развитии рака. Значение эпигенетических исследований в генезе РШМ вызывает большой интерес и должно быть изучено более глубоко. Дальнейшее углубление понимания этой системы позволило бы вникнуть в механизмы большого количества клеточных процессов, опосредующих РШМ. Разработка iHDAC открывает принципиально новый подход в терапии онкологических заболеваний. Эпигенетическая терапия стала значимым актуальным вопросом в изучении проблемы рака. iHDACs и DNMTs демонстрируют значительные терапевтические преимущества. И хотя впереди еще длинный путь до вступления в равноправную борьбу с раком, эпигенетическая терапия может стать для всех нас началом блестящего будущего.
Таким образом, очевидная роль эпигенетических изменений в генезе РШМ вынуждает оценить значение и характер изменений эпигенетических маркеров, наряду с клиническими особенностями, в прогрессировании патологических процессов ШМ, ассоциированных с ПВИ, для патогенетического формирования групп пациенток повышенного онкологического риска.
Общая клиническая характеристика больных
При изготовлении препаратов методом жидкостной цитологии использовали методы центрифугирования, осаждения и/или фильтрации. Для проведения жидкостной цитологии материал в фиксаторе помещался в контейнер цитоцентрифуги, после центрифугирования проводили вортексирование, полученный осадок разводили в фиксаторе в пропорции приблизительно 1:30, далее изготавливали однослойный цитологический препарат с использованием предметных стекол.
Важным этапом цитологического исследования является качественное окрашивание, что позволяет провести правильную идентификацию и оценку клеточного материала.
В нашем исследовании использовали метод окрашивания мазков по Папаниколау (Papanicolaou), с точным соблюдением протоколов приготовления растворов и окрашивания, с оптимальным подбором концентрации красителей и времени окрашивания.
При оценке микропрепаратов осуществляли двухэтапный осмотр. Первый этап световой микроскопии проводил цитотехнолог. Второй этап — врач-цитолог, особенно детально при выявлении патологии на первом этапе оценки.
На первом этапе проводится оценка качества препарата. Цитотехнолог выявляет, насколько правильно был взят материал для исследования, точность маркировки, качество фиксирования и окрашивания мазков. Также он дает заключение об удовлетворительном или неудовлетворительном качестве препарата, с указанием возможной причины. Например, материал считается неудовлетворительным при недостаточном числе клеток, не правильно маркированном препарате, преобладании воспалительных клеток и т.д. В частности, если более 75% клеток многослойного плоского эпителия покрыто эритроцитами, лейкоцитами, то качество мазка считается неудовлетворительным.
Адекватным считается препарат, содержащий около 10000 клеток плоского и метаплазированного эпителия из зоны трансформации для традиционной цитологии и около 5000 — для жидкостной цитологии, а количество клеток из эндоцервикса и зоны трансформации — не менее 10 для обоих вариантов цитологического исследования.
При однозначной трактовке HSIL или рака количество клеток не имеет определяющего значения.
На втором этапе проведения цитологического исследования осуществляют оценку препаратов, отобранных цитотехнологом для дальнейшего диагностического изучения.
В итоге врач-цитолог формирует стандартизованное заключение, включающее следующие пункты (рис. 1):
В наших исследованиях цитологическое заключение и диагноз оформлялись в соответствии с классификацией, предложенной национальным институтом США по изучению рака — цитологическая система оценки Bethesda system. Согласно системе Bethesda существуют два варианта цитологических изменений — плоскоклеточная атипия неопределенной значимости ASCUS (atypical squamous cells of undetermined significance) и плосколеточные интраэпителиальные поражения SIL (Squamous Intraepitelial Lesions). SIL в свою очередь подразделяется на низкую степень плоскоклеточного интраэпителиального поражения LSIL (Low grade squamous intraepitelial lesion) и высокую степень плоскоклеточного интраэпителиального поражения HSIL (High grade squamous intraepitelial lesion). LSIL включают поражения, ассоциированные с ВПЧ и CIN I, а НSIL — CIN II, CIN III, карциному in situ и случаи, подозрительные на наличие инвазии.
В норме в цитологических препаратах обнаруживают клетки плоского эпителия, группы клеток цилиндрического и метаплазированного эпителия, небольшое число лейкоцитов, необильную микрофлору (палочки). В системе Bethesda существует градация «интраэпителиальные изменения и злокачественные процессы отсутствуют — NILM». NILM соответствует нормальному состоянию эпителия, или же возможному наличию не неопластических патологических процессов.
При наличии не неопластических процессов определяют их характер и причину: воспаление, прием оральных контрацептивов, атрофия и др. Также указывают на признаки наличия микроорганизмов: Trichomonas vaginalis, Candida, Actinomyces spp., Herpes simplex virus и др.
Количество дней от момента забора материала до цитологического заключения не должно быть больше 14–15.
Расширенная кольпоскопия осуществлялась по стандартной методике с помощью 3% раствора уксусной кислоты и 3% раствора Люголя. Ее проводили с помощью оптического кольпоскопа Sensitec OC-100 и цифрового видеокольпоскопа Sensitec SLC-20003. Sensitec OC-100 характеризуется высококачественной апохроматической оптикой с антирефлексным покрытием, позволяющей получить высококачественное стереоскопическое изображение. Технические характеристики Sensitec OC-100: рабочее расстояние — 300 мм; 5-ти ступенчатое оптическое увеличение: 4/6/10/16/25x; регулировка диоптрий на окулярах ±5D; угол между оптической осью объектива и окулярами 450; встроенный зеленый фильтр и др.
Цифровой видеокольпоскоп Sensitec SLC-2000 характеризуется: 36-кратным оптическим увеличением; эффективной системой шумоподавления; ультрабелыми светодиодами 5 поколения; трехдиапазонным зеленым фильтром; программным обеспечением Colpovision. Описание кольпоскопии проводилось согласно международной классификации кольпоскопических терминов, одобренной в 2011 г. в Рио-де-Жанейро на 14 Всемирном Конгрессе IFCPC [55]. Согласно классификации, следует указать информацию об адекватной или неадекватной кольпоскопической картине, а при неадекватной — отметить причину: например, кольпоскопия затруднена вследствие воспалительного процесса ШМ, кровотечения, рубцовой деформации и др. Важно отметить наличие (полностью, частично) или отсутствие визуализации стыка между многослойным плоским и цилиндрическим эпителием, а также тип зоны трансформации.
Молекулярно-биологические особенности процессов ацетилирования, метилирования и пролиферации при заболеваниях шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией
Чувствительность модели составила 82,7%, специфичность — 84,0%, точность модели — 83,2%. Положительное прогностическое значение (вероятность обнаружения болезни у лиц с положительным результатом теста) — 88,3%. Отрицательное прогностическое значение — вероятность отсутствия болезни у лиц с отрицательным результатом теста — 76,8%.
Таким образом, полученные результаты клинико-анамнестических и диагностических особенностей в исследуемых группах больных позволили выявить статистически значимые факторы риска развития злокачественной патологии ШМ. Однако выявленная недостаточная чувствительность и специфичность предложенной модели прогнозирования обусловливают поиск дополнительных критериев. В связи с этим мы провели исследование по выявлению патогенетических факторов риска развития РШМ путем детального анализа молекулярно-биологических особенностей с вышеуказанными факторами риска при патологических процессах ШМ, ассоциированных с ПВИ.
Молекулярно-биологические особенности процессов ацетилирования, метилирования и пролиферации при заболеваниях шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией
Для выявления особенностей процесса ацетилирования при заболеваниях ШМ провели оценку уровней экспрессий гистондеацетилазы HDAC 1 и гистондеацетилазы HDAC 2 в ткани ШМ у больных в исследуемых группах (диаграмма 3.2.1, табл. 3.2.1, рис. 3.2.2).
Максимальные уровни экспрессий HDAC 1 и HDAC 2 отмечались в 4 и 5 группах (по сравнению с первыми тремя группами), составляя соответственно: в 4 группе HDAC 1 — 3,53, а HDAC 2 — 3,83; в 5 группе HDAC 1 — 1,7, а HDAC 2 —1,8.
С целью изучения молекулярно-биологических особенностей процесса метилирования при патологических процессах ШМ были оценены уровни экспрессии ДНК-метилтрансферазы 1 (DNMT1) и ДНК-метилтрансферазы 2 (DNMT2) в ткани ШМ у исследуемых групп больных (диаграмма 3.2.2, табл. 3.2.1. рис. 3.2.3.).
Наибольшие показатели экспрессий DNMT1 и DNMT2 отмечались в 4 и 5 группах (по сравнению с первыми тремя группами), составляя соответственно: в 4 группе DNMT1 — 5,51, а DNMT2 — 5,50; в 5 группе DNMT1 — 3,63, а DNMT2 — 3,61.
Для оценки уровней пролиферативной активности при заболеваниях ШМ были определены показатели экспрессии Ki-67 и р-53 в ткани ШМ больных 5 групп (диаграмма 3.2.3, диаграмма 3.2.4, табл. 3.2.1, рис. 3.2.1). Уровни экспрессий Ki-67 и р-53 отмечались в 4 и 5 группах (по сравнению с первыми тремя группами), составляя соответственно: в 4 группе Ki-67 — 86,1, а р-53 — 8,2; в 5 группе Ki-67 — 77,2, а р-53 — 3,61. группа группа группа группа группа р-53 U±0,4 3,0±0,2 6,0±0,4 / 8,2±0,5Pi_4 0,001 P2-4 0,001 P3.4 0,001 6,5±0,3Pi.5 0,001 P2-5=0,017 p 0,05 статистически значимые различия по сравнению с 1 группой p 0,05 статистически значимые различия по сравнению с 2 группой p 0,05 статистически значимые различия по сравнению с 3 группой p 0,05 статистически значимые различия по сравнению с 4 группой (критерий Манна-Уитни)
Нами был проведен многофакторный анализ (бинарная логистическая регрессия) с учетом полученных клинико-молекулярных показателей для оценки риска прогрессирования (прогнозирования) и злокачественной трансформации (переход в CIN 3 и инвазивный плоскоклеточный рак), в связи с чем была построена значимая модель (Хи-квадрат=92,620 p 0,00001) для оценки факторов риска.
Коэффициенты уравнения наиболее значимых клинических прогностических факторов прогрессии, высчитанных на основании расчета формулы бинарной логистической регрессии, представлены в табл. 3.2.3. Коэффициенты уравнения регрессионной модели Показатель Коэффициенты уравнения Значимость коэффициента в регрессионной модели Константа -42,107 0,0091 Диагноз, соответствующий доброкачественным процессам (0), CIN I -1, CIN II – 2 CIN I III – 3 2,401 0,001 Вирусная нагрузка (ВПЧ-ВР) более 105 геномных эквивалентов 2,314 0,001 Персистенция ВПЧ-ВР 2,195 0,001 Морфологически верифицированный CIN в анамнезе 1,386 0,006 ИППП микст-инфекции (3 и более) 1,371 0,012 Рецидивирующий бактериальный вагиноз 1,342 0,0293 Травматические повреждения ШМ (послеродовые, постабортные и др.) 1,328 0,0021 Возраст более 40 лет 1,304 0,0043 Раннее начало регулярной половой жизни (до 18 лет) без применения барьерных методов контрацепции 1,298 0,0058
После получения окончательной модели прогноза прогрессирования злокачественной трансформации (переход в CINIII и инвазивный плоскоклеточный рак) нами была проверена работа модели на всех пациентках. Ниже приведен фрагмент расчета вероятности прогрессирования злокачественной трансформации, где observed — наблюдаемые пациентки, у которых нам известна степень заболевания — значение, равное 1, означает наличие злокачественной трансформации (переход в CIN 3 и инвазивный плоскоклеточный рак); значение, равное 0, означает отсутствие злокачественной трансформации, а predicted — ОР; расчетный прогноз вероятности — значение более 0,5 — означает высокую вероятность злокачественной трансформации (переход в CIN 3 и инвазивный плоскоклеточный рак), а значение менее 0,5 означает низкую вероятность злокачественной трансформации.