Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Применение методов криоконсервации эмбрионов и их исходы в программах вспомогательных репродуктивных технологий (обзор литературы) 11
1.1 Методы криоконсервации эмбрионов 11
1.2 Рецептивность эндометрия 24
1.3 Селективный перенос одного эмбриона 28
1.4 Акушерские и перинатальные исходы 31
Глава 2. Материал и методы исследования 40
2.1 Формирование исследуемых групп 40
2.2 Клиническая характеристика пациенток исследуемых групп 42
2.3 Методы исследования
2.3.1 Клинико-анамнестический 47
2.3.2 Микроскопический 48
2.3.3 Статистические методы анализа результатов исследования 50
2.4 Методы лечения 51
Глава 3. Результаты собственных исследований 57
3.1 Сравнение исследуемых групп 57
3.2 Оценка эффективности программ криоконсервации 57
3.3 Применение селективного переноса эмбриона в протоколах криоконсервации 63
3.4 Анализ результатов применения различных методов подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов 67
3.5 Оценка акушерских и перинатальных исходов в программах ВРТ с использованием методов криоконсервации 71
3.6 Заключение 94
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 97
Выводы 117
Практические рекомендации 119
Список сокращений 120
Список литературы
- Рецептивность эндометрия
- Клиническая характеристика пациенток исследуемых групп
- Оценка эффективности программ криоконсервации
- Оценка акушерских и перинатальных исходов в программах ВРТ с использованием методов криоконсервации
Введение к работе
Актуальность темы. Бесплодный брак является одной из важнейших
проблем современной медицины. По различным оценкам в России доля
бесплодных браков колеблется от 8,0 до 17,5% (Сухих Г.Т., 2010).
Вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) приобретают все большее
значение в лечении женского и мужского бесплодия. Методы криоконсервации
значительно расширяют возможности программ ВРТ. Криоконсервация
эмбрионов позволяет увеличить кумулятивную частоту беременностей, снизить
риск развития синдрома гиперстимуляции яичников и избежать повторных
циклов стимуляции суперовуляции, тем самым повышая эффективность и
безопасность ВРТ. Криоконсервированные эмбрионы могут быть использованы
после неудачного переноса нативных эмбрионов. Или же, в случае успешного
завершения беременности, при желании семейной пары иметь еще детей,
данные программы могут быть реализованы позже. Таким образом,
криоконсервация эмбрионов является альтернативным вариантом
использования оставшихся эмбрионов.
В настоящий момент существуют два основных метода криоконсервации – медленное замораживание и витрификация. В то время как медленное замораживание применяют уже более 20 лет, метод витрификации является относительно новым.
В научной литературе широко дискутируются преимущества и эффективность указанных методов. По данным различных исследователей выживаемость оттаянных бластоцист при использовании протокола медленного замораживания находится в пределах 56,9-92,1%, а после витрификации выживаемость составляет 72,0-100% (Huang C.C., 2005; Stehlik E.J., 2005; Kuwayama M., 2005; Lieberman J., 2006; Pavone M.E., 2011). Частота наступления беременности после применения витрификации составляет 24,2-53,0%, после применения метода медленного замораживания 16,7-51,0% (Stehlik E.J., 2005; Kuwayama M., 2005; Lieberman J., 2006; Sugiyama R., 2010).
Некоторыми авторами при сравнении эффективности методики медленного замораживания и витрификации были получены сопоставимые результаты (Lieberman J., 2006). Напротив, в большинстве исследований применение метода витрификации позволило улучшить выживаемость эмбрионов, а также привело к повышению частоты имплантации и наступления
беременности (Huang C.C., 2005; Stehlik E.J., 2005; Kuwayama M., 2005). Однако в недавно проведенных исследованиях удалось достичь удовлетворительных результатов при использовании медленного замораживания (Mesut N., 2011, T., 2011). Таким образом, вопрос, какой метод – витрификация или медленное замораживание – является оптимальным для криоконсервации эмбрионов, остается открытым.
Успешность имплантации во многом зависит как от качества эмбриона, так и морфофункционального состояния эндометрия. Нарушение рецепторного аппарата эндометрия может послужить причиной многократных неудач при проведении программ ВРТ. Клинические исследования, в которых проводили сравнение эффективности различных режимов подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов, немногочисленны и противоречивы (Sathanandan M., 1991; Morozov V., 2007; Kassab A., 2009; Weissman A., 2009; Glujonsky D., 2010; Fatemi H.M., 2010; Konc J., 2010; Chang E.M., 2011). Так, по мнению ряда авторов, перенос криоконсервированных эмбрионов в натуральном цикле приводит к лучшим результатам при сравнении с режимом подготовительной гормональной терапии (Morozov V., 2007; Kassab A., 2009; Chang E.M., 2011). Напротив, в других исследованиях достоверного различия между указанными методами получено не было (Sathanandan M., 1991; Konc J., 2010). Результаты применения хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) в качестве триггера овуляции в натуральном цикле также неоднозначны. Перенос размороженных эмбрионов в натуральном цикле при сравнении с натуральным циклом с использованием в качестве триггера овуляции препаратов ХГЧ приводил как к повышению частоты наступления беременности, так и к схожим результатам (Weissman A., 2009; Fatemi H.M., 2010). Таким образом, оценка эффективности различных режимов подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов является важной задачей.
На сегодняшний день уже более 5 миллионов детей были рождены после применения ВРТ. Здоровье таких детей продолжает вызывать обеспокоенность и является предметом дискуссий. Большой интерес представляют исследования, посвященные оценке акушерских и перинатальных исходов после переноса криоконсервированных эмбрионов, особенно в связи с распространением метода витрификации, в процессе которого используют более высокие концентрации потенциально токсичных криопротекторов по сравнению с
медленным замораживанием. Научные работы, посвященные оценке
акушерских и перинатальных исходов после переноса размороженных
эмбрионов, немногочисленны, что делает необходимым дальнейшие
исследования в этой области.
Цель исследования состояла в повышении эффективности программ
вспомогательных репродуктивных технологий в протоколах с
криоконсервацией эмбрионов.
Задачи исследования
-
Сравнить выживаемость эмбрионов при использовании методов витрификации и медленного замораживания.
-
Провести сравнение частоты наступления клинической беременности и ее исхода при переносе эмбрионов после криоконсервации и нативных эмбрионов.
-
Сравнить частоту наступления клинической беременности и ее исход при использовании различных методов криоконсервации – витрификации и медленного замораживания.
-
Оценить способы подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов после криоконсервации (модифицированный натуральный цикл (МНЦ) и назначение подготовительной гормональной терапии (ПГТ)).
Научная новизна и теоретическая значимость работы.
Впервые проведена оценка преимущества метода витрификации в сравнении с медленным замораживанием у пациенток с различными способами подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов (натуральный цикл и назначение подготовительной гормональной терапии).
Впервые проведена оценка эффективности селективного переноса одного
эмбриона в программах ВРТ с использованием криконсервированных
эмбрионов. Изучена выживаемость эмбрионов 5 дня развития,
криконсервированных различными методами, в зависимости от качества и стадии (бластоцисты и морулы отличного и хорошего качества).
Впервые проведено сравнение эффективности метода медленного замораживания и витрификации по таким параметрам, как частота родов и показатель “take home baby”.
Впервые проведен комплексный анализ течения беременности, родов,
перинатальных исходов, включающих массу, длину новорожденных, оценку по шкале Апгар, частоту врожденных пороков развития в зависимости от метода криоконсервации эмбрионов и способа подготовки эндометрия. Показано, что использование криоконсервированных эмбрионов не оказывает негативного влияния на акушерские и перинатальные исходы при сравнении с программами ВРТ с применением нативных эмбрионов.
Практическая значимость работы.
Проведенное исследование показало, что витрификация является более эффективным методом криоконсервации по сравнению с методом медленного замораживания. Установлено, что для подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов может быть назначена как подготовительная гормональная терапия, так и перенос эмбрионов в модифицированном натуральном цикле. Полученные результаты позволяют рекомендовать в целях снижения частоты наступления многоплодной беременности применение селективного переноса одного эмбриона в программах ВРТ с использованием криоконсервированных эмбрионов.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Витрификация является более эффективным методом криоконсервации эмбрионов по сравнению с медленным замораживанием, позволяющим не только повысить выживаемость эмбрионов, но и улучшить клинические результаты.
-
Морулы хорошего и отличного качества при криоконсервации методом медленного замораживания, а также морулы хорошего качества при витрификации характеризуются достоверно более низкой выживаемостью по сравнению с другими эмбрионами 5 дня развития.
-
Использование витрификации, в отличие от метода медленного замораживания, позволяет достичь схожих с нативными циклами клинических результатов.
-
Применение различных режимов подготовки эндометрия, включающих модифицированный натуральный цикл и назначение подготовительной гормональной терапии, не влияет на эффективность программ ВРТ. При этом при достижении толщины эндометрия более 11,7 мм шанс наступления беременности увеличивается в 4 раза по сравнению с толщиной эндометрия менее 8,8 мм.
5. Криоконсервация эмбрионов, а также использование различных режимов
подготовки эндометрия (подготовительная гормональная терапия (ПГТ) и
модифицированный натуральный цикл (МНЦ)), не оказывают
негативного влияния на течение беременности, родов и перинатальные исходы, включающие массу и длину новорожденных, оценку по шкале Апгар, частоту врожденных пороков развития при сравнении с нативными циклами программ ВРТ.
Апробация и внедрение результатов исследования в практику.
Материалы диссертации доложены на конференции “Лечение бесплодия и
подготовка пациентов к программам ВРТ”, Санкт-Петербург, 2013 г.; XXIV
международной конференции РАРЧ «Репродуктивные технологии сегодня и
завтра», Ярославль 2014 г.; IV международной научно-практической
конференции "ЭКО: предикторы успеха", Екатеринбург, 2014 г.
Результаты исследования внедрены в работу клиники “Ава-Петер”, отделения вспомогательных репродуктивных технологий СПБГБУЗ “Городская Мариинская больница”, в учебный процесс кафедры репродуктивного здоровья женщин ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И. Мечникова МЗ РФ.
По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 6 статей в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях.
Личный вклад автора.
Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии в проведении отбора, обследования, назначении терапии и последующем ведении пациенток. Автором проведен статистический анализ результатов исследования, на основании которого сделаны выводы.
Структура и объём диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, общей
характеристики материалов и методов исследования, клинической
характеристики обследованных групп, результатов собственных исследований,
заключения, выводов, обсуждения полученных результатов, практических
рекомендаций, списка литературы, включающего 160 источников. Материалы
диссертации изложены на 139 страницах машинописного текста,
иллюстрированы 13 таблицами, 29 рисунками.
Рецептивность эндометрия
Успешность процесса витрификации зависит от таких факторов, как скорость охлаждения, вязкость среды с эмбрионами, объем замораживаемого образца. Высокая скорость охлаждения достигается при помощи жидкого азота. При погружении замораживаемого образца в жидкий азот скорость охлаждения колеблется от сотен до десятков тысяч градусов Цельсия в минуту. Вязкость среды определяется концентрацией и поведением различных криопротекторов и других добавок в процессе витрификации. Чем выше концентрация криопротекторов, тем выше температура стеклования, что в свою очередь снижает вероятность кристаллообразования. Токсичность и осмотический эффект криопротекторов ограничивают повышение их концентрации. Различные криопротекторы обладают различной токсичностью, проницаемостью и температурой витрификации. Как правило, применяют комбинацию различных криопротекторов с целью повышения вязкости, температуры стеклования и снижения токсичности. Кроме того, Vanderzwalmen P. et al. в 2010 году установили, что при проведении витрификации внутриклеточная концентрация криопротекторов ниже, чем при медленном замораживании [147].
Меньшие объмы замораживаемого образца обеспечивают лучшую теплопередачу, тем самым повышая скорость охлаждения. Прорыв в области витрификации был связан с внедрением различных технологий (Cryotop, Cryoloop, Cryotip, Cryo-E, Rapid-i и т. д.), позволивших уменьшить объем, что позволило снизить концентрацию криопротекторов и значительно повысить эффективность метода [26, 77, 104, 135]. Все эти технологии можно разделить на две категории – открытые и закрытые. При использовании открытых методик прямой контакт замораживаемого образца с жидким азотом обеспечивает более высокую скорость охлаждения. Так же высокая скорость оттаивания достигается за счет прямого воздействия согревающего раствора. Но при этом существует возможный риск вирусной и микробной контаминации [15]. Однако по данным Cobo A. et al., при исследовании образцов жидкого азота, оставшихся после проведения программ ВРТ с использованием криоконсервированных эмбрионов у пациенток с хроническим вирусным гепатитом С, В или ВИЧ инфицированных пациенток, последовательностей вирусных ДНК или РНК методом полимеразной цепной реакции обнаружено не было [146].
При сравнении эффективности закрытой системы Cryotip и открытой Cryotop Kuwayama M. et al. в 2005 году достоверного различия не получили. Выживаемость бластоцист составила 93,0% и 97,0%, частота наступления беременности – 51,0% и 59,0%, а частота родов – 48,0% и 51,0% соответственно [31]. Схожие результаты были получены Hashimoto et al. в 2013 году [8]. Напротив, в исследовании, проведенном Valbuena D. et al., выживаемость витрифицированных бластомеров эмбриона человека была достоверно выше в группе, в которой применяли Cryotip (53,8%), по сравнению с группой, в которой использовали открытую систему Cryotop (22,8%) [30]. По данным, опубликованным Panagiotidis Y. et al. в 2013 году, выживаемость бластоцист (84,1% и 82,1%), частота наступления клинической беременности (45,9% и 42,4%), частота имплантации (25,6% и 24,5%), частота родов (41,2% и 41,0%) достоверно не различались при сравнении открытых и закрытых систем [92]. AbdelHafez et al. в 2011 году при сравнении выживаемости эмбрионов мыши и наличия признаков повреждения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) после витрификации с применением открытой системы Cryoloop и закрытых систем Cryotip и HSV straw достоверного различия не получили. При этом общее количество клеток, обнаруживающих повреждение ДНК, было выше после размораживания эмбрионов на стадии бластоцисты по сравнению с эмбрионами, криоконсервированными на стадии дробления [149]. Таким образом, по всей видимости, для витрификации эмбрионов могут быть использованы асептичные закрытые устройства, позволяющие устранить риск контаминации и достичь эффективности, не уступающей закрытым технологиям.
В настоящее время лидирующая роль по совершенствованию метода витрификации и исследованию в области криоконсервации принадлежит японскому ученому Kuwayama M. Длительность хранения эмбрионов не влияет на их качество. В исследовании, проведенном Riggs R. et al. в 2010 году, хранение эмбрионов в течение двадцати лет не оказывало влияния на такие параметры, как выживаемость после оттаивания, частота имплантации, частота наступления беременности, количество прерываний беременности и родов [40]. По данным Wirleitner B. et al., опубликованным в 2012 году, частота наступления беременности и частота родов достоверно не различалась после переноса витрифицированных эмбрионов, хранившихся в течение 1, 2, 3, 4, 5 и 6 лет. В среднем эти показатели составили 43,6% и 29,0%, соответственно [87].
В ряде исследований было показано, что количество интактных бластомеров является важным прогностическим фактором наступления беременности после переноса размороженных эмбрионов [133, 145].
Несмотря на значительные успехи в области криоконсервации эмбрионов, до сих пор нет единого мнения относительно стадии развития эмбрионов, наиболее оптимальной для криоконсервации.
В некоторых странах, в частности в Германии, криоконсервация эмбрионов после пронуклеарной стадии запрещена по этическим соображениям. В лабораториях других стран криоконсервацию проводят на 2 и 3 дни развития эмбрионов. В последнее время в связи с улучшением методов культивирования предпочтение отдается более продвинутой стадии развития эмбрионов – стадии бластоцисты [2].
Клиническая характеристика пациенток исследуемых групп
Процедуру контролируемой овариальной стимуляции выполняли по общепринятой методике. С целью предотвращения пика лютеинизирующего гормона (ЛГ) применяли антагонисты ГнРГ или агонисты ГнРГ. При использовании протокола с агонистами Гн-РГ по “длинной” схеме введение препарата аналога Гн-РГ (Диферелин, Декапептил) в дозе 0,05-0,1 мг начинали с середины лютеиновой фазы цикла, предшествующего КОС. После достижения десенситизации аденогипофиза, начиная с 3-4 дня менструального цикла, назначали препарат рекомбинантного гонадотропина (Гонал-Ф, Пурегон). Стартовую дозу подбирали в зависимости от показателей овариального резерва, оценку которого проводили на основании уровней основных биомаркеров: антимюллерова гормона (АМГ), ФСГ, эстрадиола, подсчета количества антральных фолликулов; также учитывали возраст пациенток и результаты предшествующих протоколов стимуляции яичников. В период КОС осуществляли УЗ мониторинг числа и скорости роста фолликулов, толщины эндометрия. При необходимости проводили коррекцию дозы препарата гонадотропина. В протоколе с антагонистами Гн-РГ введение препарата рекомбинантного гонадотропина (Гонал-Ф, Пурегон) начинали со 2-3 дня менструального цикла. Подбор стартовой дозы и ее коррекцию осуществляли по тем же принципам. При достижении размера фолликулов 14 мм пациенткам назначали антагонист Гн-РГ (Оргалутран, Цетротид) в дозе 250 мкг. В обоих протоколах КОС проводили до дня достижения лидирующим фолликулом 18-20 мм, после чего назначали “овуляторную” дозу ХГЧ (Прегнил, Овитрель). Через 36 часов после инъекции ХГЧ проводили трансвагинальную пункцию фолликулов с целью аспирации преовуляторных ооцитов. Трансвагинальную пункцию осуществляли через задний свод влагалища с помощью УЗ аппарата B-K Medical PRO Focus, оснащенного трансвагинальным датчиком с пункционным адаптером и специальными иглами. Аспирацию содержимого фолликулов приводили с помощью аспирационного насоса COOK ASPIRATION UNIT. В случае, если ооцит не был получен, проводили промывание фолликула специальной средой.
Количество вводимой среды не превышало объем фолликула. Для оплодотворения ооцитов применяли методику ЭКО или интрацитоплазматическую инъекцию сперматозоида (ИКСИ). При выполнении ЭКО эякулят обрабатывали по стандартным протоколам в сертифицированных средах. Затем проводили инсеминацию ооцитов активно подвижной фракцией сперматозоидов. При выполнении ИКСИ через 4 часа после забора ооцитов проводили их очистку от клеток cumulus гиалуронидазой. Через 40 минут осуществляли введение отобранного сперматозоида в цитоплазму ооцита с помощью микроинъектора. Через 19 часов после ЭКО или ИКСИ проводили контроль качества оплодотворения.
Для криоконсервации эмбрионов методом медленного замораживания применяли набор для замораживания Blast Freeze Medicult. Бластоцисты переносили в чашку, содержащую раствор для замораживания из виалы 1, и помещали чашку в условия CO2 на 10 минут. Затем бластоцисты переносили в раствор 2 в CO2 инкубатор на 10 минут. После чего помещали бластоцисты в маркированную стразу, используя в качестве среды для заполнения раствор из виалы 2. Запечатывали отверстие в соломинке, предотвращая проникновение жидкого азота внутрь стразы. Затем помещали соломинки в замораживающее устройство (Planer, Cryologic) и начинали программу замораживания. Охлаждали от комнатной температуры до минус 6оС с интервалом 2оС. Проводили сидинг вручную при температуре минус 6оС. Охлаждали от минус 6оС до минус 40оС с интервалом 0,3оС в минуту. Затем охлаждали от минус 40оС до минус 150оС с интервалом 35оС в минуту. После чего переносили соломинки в коробку с жидким азотом и помещали их в криотубы с азотом, затем в маркированный холдер. Переносили холдер в жидкий азот и хранили при минус 196оС.
Для размораживании эмбрионов, криоконсервированных методом медленного замораживания, использовали набор для размораживания BlastThaw, Medicult. Стразу вынимали из жидкого азота и держали при комнатной температуре в течение 10-15 секунд, затем держали стразу в руках до полного оттаивания. Содержимое стразы выдували в чашку Петри, перемещали в лунку, содержащую раствор для размораживания 1, уравновешенный до комнатной температуры и культивировали в течение 10 минут. Затем перемещали бластоцисты в лунку, содержащую раствор для размораживания 2, и культивировали 10 минут при комнатной температуре. После размораживания бластоцисты помещали в среду Blast Assist System Medium 2 и тщательно промывали. После промывания помещали бластоцисты в свежую среду Blast Assist System Medium 2 и оставляли в инкубаторе в условиях CO2 до переноса.
Криоконсервацию эмбрионов методом витрификации проводили при комнатной температуре с использованием набора Kitazato Cryotop Safety Kit Vitrification #VT401. Методика витрификации эмбрионов состояла в следующем. Аспирированную из культуральной среды бластоцисту на кончике пипетки в минимальном объеме переносили в лунку чашки Nunc, содержащую 300 мкл раствора ES, и инкубировали в течение 15 минут. Затем в минимальном объеме ES переносили бластоцисту в лунку, содержащую 300 мкл раствора VS, и инкубировали в течение 1 минуты. В процессе инкубации бластоцисту трижды переносили на новый участок лунки, сопровождая перенос помешиванием вокруг бластоцисты кончиком пинцета. После чего бластоцисту переносили в лунку, содержащую 300 мкл раствора VS, и инкубировали в течение 30 секунд. В процессе инкубации бластоцисту дважды переносили на новый участок лунки, сопровождая перенос помешиванием вокруг бластоцисты кончиком пинцета. В минимальном объеме среды переносили бластоцисту на кончик Cryotop. Кончиком пипетки отбирали излишки среды. Затем быстро опускали конец Cryotop в витрификационный контейнер с жидким азотом и под слоем жидкого азота пинцетом надевали защитный чехол на Cryotop.
Размораживание криоконсервированных эмбрионов проводили при комнатной температуре с использованием набора Kitazato Cryotop Safety Kit Thawing #VT402. Предварительно за полтора часа до начала размораживания виолу со средой TS и чашку Петри 35 мм помещали в инкубатор на 37оС. Остальные среды для размораживания инкубировали при комнатной температуре в течение часа. Для проведения процедуры размораживания под жидким азотом пинцетом снимали с Cryotop защитный чехол. За минимальное время доставали Cryotop и опускали его конец в чашку Петри, содержащую раствор TS. Инкубировали бластоцисту в TS 1 минуту. Затем аспирировали капилляром бластоцисту в некотором количестве среды TS, помещали на дно лунки, содержащей раствор DS, и инкубировали 3 минуты. После чего аспирировали капилляром бластоцисту и некоторое количество раствора DS, переносили на дно лунки, содержащей раствор WS1, и инкубировали в течение 5 минут. Затем аспирировали капилляром только бластоцисту и переносили ее в лунку, содержащую раствор WS 2, на поверхность раствора. После опускания бластоцисты на дно несколько раз повторяли процедуру. Инкубация в растворе WS 2 составляла 1 минуту. Затем бластоцисты переносили в подготовленную и уравновешенную в инкубаторе чашку со средой Blast Assist System Medium-2, Medicult.
После размораживания эмбрионов проводили вспомогательный хэтчинг при помощи лазерного аппарата Saturn laser. Длина волны лазера составляла 650 нм. Выживаемость эмбрионов оценивали при наличии 50% и более интактных бластомеров. Размороженные эмбрионы переносили в полость матки. Количество перенесенных эмбрионов не превышало 2. Перенос эмбрионов осуществляли под контролем УЗИ с помощью катетера для переноса эмбрионов Wallace.
Для подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов применяли режим подготовительной гормональной терапии и перенос эмбрионов в модифицированном натуральном цикле.
В качестве подготовительной гормональной терапии использовали препарат эстрадиола со 2-3 дня менструального цикла: Прогинова 2 мг 3 раза в день или Эстрофем 2 мг 3 раза в день или Дивигель 1 г 3 раза в день, а также комбинации препаратов. При достижении толщины эндометрия 8 мм и более по данным УЗИ к указанной терапии добавляли препарат прогестерона: Утрожестан 200 мг 3 раза в день интравагинально или гель Крайнон 8% – 90 мг по 1 аппликатору 1 раз в день интравагинально. На 5 день после назначения препарата прогестерона проводили перенос размороженных эмбрионов.
Оценка эффективности программ криоконсервации
Наиболее частым осложнением родов стало несвоевременное (преждевременное) излитие околоплодных вод. В I группе преждевременное излитие околоплодных вод произошло в 4 (6,3%), во II группе в 1(2,9%) случае, в контрольной группе в 5 (17,2%) случаях. Слабость родовой деятельности отмечалась в 2 случаях в I (3,2%) и II (5,9%) группах, в 1 (3,4%) случае в контрольной группе. Чрезмерно сильная родовая деятельность, в результате которой произошли быстрые роды, имела место в 1 (4,8%) случае во IIa подгруппе. Аномалия прикрепления плаценты наблюдалась только в Ia подгруппе. В 1 (3,0%) случае имело место плотное прикрепление плаценты. Приращение плаценты также было установлено в 1 (3,0%) случае. Острая гипоксия плода произошла в 1 случае в Ia (3,0%) и Ib (3,3%) подгруппах. Осложнения родов достоверно не различались между исследуемыми группами и подгруппами.
У женщин Ia подгруппы родился 41 новорожденный. Из них 25 (61,0%) детей были рождены в результате одноплодной беременности, 16 (39,0%) детей составили двойни. В lb подгруппе из 35 новорожденных 10 (28,6%) детей были двойни. Таким образом, в I группе количество новорожденных составило 76, из которых 26 детей (34,2%) были двойни. У женщин Па подгруппы родились 24 новорожденных, во lib подгруппе - 16. Количество детей из двоен в обеих подгруппах составило 6 (25,0% и 37,5% соответственно). Таким образом, во II группе количество новорожденных составило 40, из которых 12 детей (30,0%) были двойни. Количество рожденных двоен в контрольной группе было достоверно выше по сравнению со II группой (р 0,05), а также наблюдалась тенденция к различию при сравнении с I группой (р=0,07). После переноса нативных эмбрионов из 41 новорожденного количество детей из двоен составило 24 (58,5%).
Масса тела новорожденных была достоверно выше в I (3269±570,5 г; р 0,05) и II (3293±597,0 г; р 0,05) группах по сравнению с контрольной группой (2847±946). Длина новорожденных также была выше в I (50,9±2,9 см; р 0,01) и II (51,6±2,7 см; р 0,01) группах по сравнению с контрольной группой (48,3±6,5 см). Оценки по шкале Апгар в баллах на 1 и 5 минутах достоверно не различались между I (7,7±0,5 и 8,7±0,5), II (1,1 ±0,6 и 8,6±0,7) и контрольной группами (7,3±1,6 и 8,3±1,3).
При анализе указанных показателей между подгруппами получены следующие результаты. Масса тела новорожденных в граммах была достоверно больше в 1а (3285±617; р 0,01), в lb (3252±519; р 0,05) и Па (3443±668; р 0,001) подгруппах по сравнению с контрольной группой. Во ПЬ подгруппе масса тела новорожденных достоверно не различалась при сравнении с данным показателем в исследуемых подгруппах и составила 3067±391 г. Длина новорожденных была достоверно выше в исследуемых подгруппах по сравнению с контрольной группой. Данный показатель составил 51,0±3,0 см (р 0,01), 50,8±2,8 см (р 0,01), 52,0±2,9 см (р 0,001), 50,9±2,1 см (р 0,05) соответственно.
Оценки по шкале Апгар в баллах на 1 и 5 минутах достоверно не различались между исследуемыми подгруппами. В 1а подгруппе данные показатели составили 7,6±0,6 и 8,6±0,6, в lb подгруппе - 7,8±0,4 и 8,8±0,4, во Па подгруппе - 7,8±0,4 и 8,6±0,6, во ПЬ подгруппе - 7,6±0,8 и 8,6±0,8.
При анализе массо-ростовых показателей и оценок по шкале Апгар на 1 и 5 минутах у новорожденных раздельно при одноплодной и многоплодной беременности получены следующие результаты. При одноплодной беременности масса тела, длина и оценки по шкале Апгар новорожденных достоверно не различались между исследуемыми группами. Данные показатели в I группе составили 3469±414 г, 52,0±2,9 см, 7,9±0,3 и 8,8±0,4 баллов соответственно. Во II группе - 3448±601 г, 52,0±2,9 см, 7,8±0,5 и 8,7±0,6 баллов соответственно. В контрольной группе масса тела новорожденных была 3269±856 г, длина 50,3±6,3 см, оценки по шкале Апгар на 1 и 5 минутах составили 7,9±0,3 и 8,8±0,4 баллов. При анализе указанных показателей между исследуемыми подгруппами получены следующие результаты. При одноплодной беременности масса тела новорожденных была достоверно больше в 1а (3597±371 г) и Па (3627±607 г) подгруппах по сравнению со ПЬ подгруппой (3125±456 г, р 0,05). Между остальными подгруппами достоверного различия установлено не было. В lb подгруппе масса тела новорожденных составила 3341±421 г. Длина новорожденных достоверно не различалась между исследуемыми подгруппами. Этот показатель составил в 1а подгруппе 52,6±2,0 см, в lb подгруппе - 51,3±2,2 см, во Па подгруппе - 52,6±2,9 см, во ПЬ подгруппе - 50,9±2,6 см. Оценки по шкале Апгар в баллах на 1 и 5 минутах также достоверно не различались между исследуемыми группами и подгруппами. В 1а подгруппе эти показатели составили 7,9±0,3 и 8,8±0,4, в lb подгруппе - 7,9±0,3 и 8,9±0,3, во Па подгруппе - 7,8±0,4 и 8,7±0,6, во ПЬ подгруппе - 7,8±0,6 и 8,8±0,6. В контрольной группе оценки по шкале Апгар на 1 и 5 минутах были 7,9±0,3 и 8,8±0,4 баллов.
При двойнях при оценке массы тела новорожденных достоверного различия между исследуемыми группами получено не было. Однако наблюдалась тенденция к различию при сравнении I (2886±639 г; р=0,06) и II (2932±418 г; р=0,08) групп с контрольной группой (2548±856 г). Длина новорожденных была достоверно больше во II группе (50,6±1,9 см; р 0,01) по сравнению с данным показателем в контрольной группе (46,9±6,4 см). При сравнении I (48,9±3,1 см) и контрольной групп по указанному параметру наблюдалась тенденция к различию (р=0,07). Оценки по шкале Апгар в баллах на 1 и 5 минутах достоверно не различались между группами. Эти показатели составили в I группе 7,4±0,7 и 8,4±0,7, во II группе 7,4±0,8 и 8,2±0,7, в контрольной группе - 6,9±1,9 и 8,0±1,6.
При анализе указанных показателей между исследуемыми подгруппами получены следующие результаты. При двойнях масса тела новорожденных была достоверно больше в lb подгруппе (3029±683 г) по сравнению с контрольной группой (р 0,05). Между остальными подгруппами достоверного различия установлено не было. В 1а подгруппе масса тела новорожденных составила в граммах 2798±616, во Па подгруппе - 2893±561, во lib подгруппе - 2971±258. Длина новорожденных была достоверно больше во ПЬ подгруппе (51±0,6 см) по сравнению с контрольной группой (р 0,05). Между остальными подгруппами достоверного различия установлено не было. В 1а подгруппе длина новорожденных составила 48,6±2,7 см, в lb подгруппе - 49,5±3,9 см, во Па подгруппе - 50,2±2,6 см. Оценки по шкале Апгар в баллах на 1 и 5 минутах также достоверно не различались между исследуемыми подгруппами. Однако наблюдалась тенденция к различию по данным показателям между lb подгруппой (7,6±0,5; р=0,057 и 8,6±0,5; р=0,054) и контрольной группой. В 1а подгруппе эти показатели составили 7,2±0,8 и 8,2±0,8 баллов, во Па подгруппе - 7,7±0,5 и 8,3±0,5 баллов, во ПЬ подгруппе - 7,2±1,0 и 8,2±1,0 баллов (рисунки 19, 20, 21, 22).
Оценка акушерских и перинатальных исходов в программах ВРТ с использованием методов криоконсервации
В нашем исследовании наибольшее количество детей с низкой (14,6%) и экстремально низкой (9,8%) массой тела наблюдалось в контрольной группе. Указанные показатели в I группе не превышали 3,9% и 1,3% соответственно. Во II группе количество новорожденных с низкой массой тела составило 7,5%, детей с экстремально низкой массой тела в этой группе не было. При этом во всех исследуемых группах низкая масса новорожденных наблюдалась только при двойнях. Экстремально низкая масса тела новорожденного при одноплодной беременности имела место лишь в контрольной группе. Остальные новорожденные были двойнями.
В исследовании, проведенном Shi W. et al., при двойнях количество детей с низкой и экстремально низкой массой тела было достоверно выше в группе, в которой проводили перенос нативных эмбрионов (48,2%, 2,6%), по сравнению с группой, в которой применяли витрифицированные эмбрионы (41,6%, 0) [101]. Напротив, Raju R. et al. по указанным параметрам различия не получили (31,9%, 6,9%, 33,7%, 8,9% соответственно) [151]. Схожие результаты были получены Takahashi K. et al [102]. Однако в последних двух исследованиях детей, рожденных от одноплодной беременности, и двоен оценивали совместно. В научных работах, проведенных Pinborg A. et al. и Wikland M. et al., оценивали только детей, рожденных от одноплодной беременности. При этом по данным Pinborg A. et al., количество новорожденных с низкой массой тела было достоверно больше после применения нативных эмбрионов (7,4%) по сравнению с применением криоконсервированных эмбрионов (4,4%) [72]. Напротив, Wikland M. et al. подобного различия не установили (4,5% и 3,1%) [91]. Таким образом, данные литературы несколько противоречивы, но все же большинством авторов было установлено, что применение криоконсервированных эмбрионов привело к снижению количества детей с низкой и экстремально низкой массой тела. В нашем исследовании новорожденные с низкой и экстремально низкой массой тела также достоверно чаще наблюдались в группе, в которой применяли нативные эмбрионы (14,6% и 9,8%). Обращает на себя внимание высокий процент новорожденных с низкой массой тела, полученный такими авторами как Shi W. et al. (48,2%), Raju R. et al. (33,7%) [101, 151]. Результаты нашего исследования по указанному параметру более близки к данным, опубликованным A. Pinborg A. et al. (7,4%), Wikland M. et al. (4,5%), несмотря на то, что в перечисленных работах оценивали детей, рожденных от одноплодной беременности [72, 91]. Повышение частоты преждевременных родов, а также числа новорожденных с низкой массой тела после переноса нативных эмбрионов авторы связывают со следующими причинами. Одним из объяснений подобных различий может быть качество эмбрионов. Для криоконсервации отбирают эмбрионы высокого качества. Кроме того не все эмбрионы способны перенести процедуру замораживания/оттаивания. Таким образом, наиболее жизнеспособные эмбрионы остаются для переноса. Другим объяснением может быть негативное влияние КОС. По всей видимости, высокий уровень эстрогенов приводит к снижению рецептивных свойств эндометрия, приводя к нарушению инвазии трофобласта и плацентарной дисфункции.
В нашем исследовании оценки по шкале Апгар на 1 и 5 минутах достоверно не различались между группами и подгруппами как при одноплодной беременности, так и при двойнях. Полученные нами результаты совпадают с данными, опубликованными Raju R. et al. В указанной работе средняя оценка по шкале Апгар достоверно не различалась между группами, в которых применяли витрифицированные и нативные эмбрионы [151]. Shi W. et al. так же не установили различия по аналогичному параметру при двойнях [101]. При одноплодной беременности дети, рожденные после переноса витрифицированных эмбрионов, имели более высокий балл по шкале Апгар на 1 минуте, но при оценке на 5 минуте подобного различия не было. В остальных публикациях авторы учитывали количество новорожденных, получивших менее 7 баллов при оценке на 5 минуте.
Перинатальная смертность в контрольной группе составила 7,3%. Данные литературы, касающиеся анализа перинатальной смертности немногочисленны и противоречивы. Показатель перинатальной смертности в научных работах различных авторов был выше при применении криоконсервированных эмбрионов, ниже или сходным с аналогичным показателем в группе детей, рожденных после переноса нативных эмбрионов [17, 60, 72, 90, 103]. Результаты нашего исследования совпадают с показателями, представленными Wada I. et al., Pinborg A. et al., Pelkonen S. et al. Согласно данным перечисленных исследований показатель перинатальной смертности достоверно не различался после переноса нативных и криоконсервированных эмбрионов. Однако в последних двух исследованиях рассматривались одноплодные беременности.
Выявление возможного влияния методов криоконсервации эмбрионов, в процессе которых эмбрионы подвергают воздействию криопротекторов, на частоту развития ВПР является важной задачей. В нашем исследовании применение витрификации (5,2%) и медленного замораживания (0,0%) эмбрионов не приводило к достоверному повышению частоты ВПР при сравнении с нативными циклами (2,4%). По данным различных авторов частота врожденных пороков развития после переноса криоконсервированных методом медленного замораживания эмбрионов в программах находилась в пределах 0,7-8,6%, при применении витрифицированных эмбрионов – 1,2-1,4% [17, 74]. В случае нативных циклов этот показатель составлял 0,7-8,7% [33, 74, 112, 86]. Некоторыми авторами было показано, что на частоту ВПР оказывает метод оплодотворения – ЭКО и ИКСИ [86]. В нашем исследовании ввиду небольшого числа установленных ВПР подобный анализ не проводили. В крупных исследованиях, проведенных Kallen B. et al., Li H. et al., Shi W. et al, Raju R. et al., Takahashi K. et al. достоверных различий между нативными циклами и циклами с использованием витрифицированных и криоконсервированных методом медленного замораживания эмбрионов найдено не было, что совпадает с результатами нашего исследования [33, 74, 101, 151].
Таким образом, в нашем исследовании перенос размороженных эмбрионов, криоконсервированных методом медленного замораживания и методом витрификации, не оказывал негативного воздействия, а по некоторым параметрам позволил улучшить акушерские и перинатальные исходы при сравнении с нативными циклами.