Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Имплантационный потенциал эндометрия и значение криопротоколов в преодолении повторных неудач в программах вспомогательных репродуктивных технологий (обзор литературы) 11
1.1. Эволюция результативности вспомогательных репродуктивных технологий 11
1.2. Динамика развития и перспективы криоконсервации в структуре вспомогательных репродуктивных технологий 12
1.3. Многократные неудачи вспомогательных репродуктивных технологий 15
1.3.1. Роль имплантации эмбриона в структуре многократных неудач вспомогательных репродуктивных технологий 15
1.3.2. Механизмы имплантации как возможные предикторы многократных неудач вспомогательных репродуктивных технологий 16
1.3.3. «Окно имплантации» в аспекте повышения результативности имплантаций 18
1.3.4. Рецептивность эндометрия 20
1.3.5. Роль внутриматочной патологии в неудачных имплантациях 26
1.3.6. Роль толщины эндометрия в неудачных имплантациях 29
1.3.7. Роль соматического статуса пациентки в неудачных имплантациях 31
1.4. Перспективы оптимизации подготовки эндометрия в криопротоколах у пациенток с многократными неудачными имплантациями в программах вспомогательных репродуктивных технологий на современном этапе 33
Глава 2. Материал и методы исследования 36
2.1. Материал исследования 36
2.1.1. Цикл диагностики 38
2.1.2. Цикл лечения 39
2.1.3. Цикл подготовки эндометрия без переноса размороженного эмбриона 42
2.1.4. Цикл подготовки эндометрия с переносом размороженного эмбриона 44
2.1.5. Цикл контроля после переноса размороженного эмбриона 45
2.2. Методы исследования 47
2.2.1. Клинические методы исследования 49
2.2.2. Эхографические методы исследования 51
2.2.3. Эндоскопические методы исследования 52
2.2.4. Лабораторные методы исследования 53
2.2.5. Морфологические методы исследования 54
2.2.6. Статистические методы исследования 55
Глава 3. Ретроспективный анализ и клиническая характеристика пациенток с многократными неудачными имплантациями 57
Глава 4. Проспективный этап исследования. особенности ведения пациенток с многократными неудачными имплантациями в анамнезе 91
4.1. Клиническая характеристика пациенток проспективной группы исследования 91
4.2. Особенности гистероскопической картины у пациенток с многократными неудачными имплантациями в анамнезе 100
4.3. Морфологическая структура эндометрия у пациенток с многократными неудачными имплантациями в анамнезе 103
4.4. Дифференцированный подход к ведению пациенток с многократными неудачными имплантациями в анамнезе в цикле лечения 110
4.5. Результаты исследования структуры эндометрия в цикле подготовки при различных вариантах назначения заместительной гормональной терапии без переноса размороженного эмбриона 114
4.5.1. Особенности эхографической структуры эндометрия при различных его схемах подготовки на заместительной гормональной терапии 114
4.5.2. Оценка уровня экспрессии рецепторов эндометрия к эстрогенам и маркера пролиферативной активности эндометрия (Ki-67) при различных его схемах подготовки на заместительной гормональной терапии в протоколах подготовки эндометрия к переносу размороженного эмбриона 117
4.5.3. Особенности динамики эстрадиола крови в зависимости от препаратов заместительной гормональной терапии у пациенток с многократными неудачными имплантациями 121
4.6. Оценка эффективности предложенного алгоритма ведения пациенток с многократными неудачными имплантациями в анамнезе после переноса размороженного эмбриона 122
Глава 5. Обсуждение полученных результатов 124
Выводы 151
Практические рекомендации 153
Список сокращений и условных обозначений 154
Список литературы 157
- Рецептивность эндометрия
- Ретроспективный анализ и клиническая характеристика пациенток с многократными неудачными имплантациями
- Клиническая характеристика пациенток проспективной группы исследования
- Оценка уровня экспрессии рецепторов эндометрия к эстрогенам и маркера пролиферативной активности эндометрия (Ki-67) при различных его схемах подготовки на заместительной гормональной терапии в протоколах подготовки эндометрия к переносу размороженного эмбриона
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Согласно итоговому отчету о
репродуктивном здоровье населения Российской Федерации за 2011 г. у 4,0 %
женщин в возрасте от 15 до 44 лет установлен диагноз «бесплодие» (Росстат,
2012). Одним из наиболее эффективных методов лечения бесплодия являются
вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ), в числе которых перенос
селективно выбранного размороженного эмбриона (бластоцисты). Однако,
несмотря на все достижения в этом направлении, частота наступления
беременности в программах переноса размороженных эмбрионов в расчете на
цикл составляет – 38,6%, на перенос — 39,9 %, и не менее 40,0–45,0 %
пациенток, даже после многократно проведенных криопереносов (2 и более)
имеют неудачи имплантации эмбрионов (отрицательный результат)
(Корсак В. С., 2017).
Одна из главных причин отрицательного результата в криопротоколах с
многократными неудачными имплантациями остается проблема эндометрия
(Кулакова В. И., 2010). Ключевым фактором, определяющим результативность
программ ВРТ в криопереносах селективно выбранной бластоцисты, является
его адекватная подготовка (Halasz M., 2013; Тапильская, Н. И., 2015). По
данным литературы, контрольные гистероскопии с последующим
выскабливанием полости матки и гистологическим исследованием у этих пациенток показывают изменения в эндометрии в 24,0–62,0 % случаях (Рудакова Е. Б, 2015; Корсак В. С., 2017). Нередко невозможность преодолеть патологию эндометрия приводит к необходимости переходить на программу суррогатного материнства.
Состояние рецепторного аппарата эндометрия в условиях подготовки эндометрия на заместительной гормональной терапии в криопротоколах ВРТ является отражением сложных и многофакторных процессов. С одной стороны, гормональные препараты оказывают существенное влияние на систему рецепторов (Артымук Н. В. и др., 2016; Kim J. J. et al., 2003). С другой – нарушения в рецепторном аппарате эндометрия, на фоне тех или иных приобретенных патологических состояний, могут привести к недостаточной его восприимчивости к экзогенному гормональному воздействию (Pierson R. A., 2003; Вартанян Э. В., 2012; Grindler N. M., 2013). В то же время, сведения о соотношениях между показателями экспрессии рецепторов эндометрия к различным по химической структуре эстрогенам при различных его схемах подготовки на заместительной гормональной терапии в криопротоколах противоречивы и фрагментарны.
Все вышеперечисленное указывает на актуальность проблемы повышения эффективности программ ВРТ с использованием размороженных эмбрионов, особенно у женщин с многократными неудачными имплантациями в анамнезе, и перспективность исследований в этой области.
Несмотря на немалое количество отечественных и зарубежных
публикаций по проблеме неудачных имплантаций в криопротоколах ВРТ, литературные данные по выбору оптимальной схемы подготовки эндометрия практически отсутствуют, хотя необходимость в этом, на современном этапе не вызывает сомнений. Все это и определяет актуальность выбранного научного направления.
Степень разработанности темы исследования. Вопросу преодоления
многократных неудачных имплантаций в программах ВРТ уделяется большое
внимание как отечественными, так и зарубежными специалистами (Горбачева
Т. И., 2013; Мартынова А. Е., 2013; Носенко Е. Н., 2013; Порубова Я. П., 2014;
Маслова М. А, 2015; Машкова Т. Я., 2016; Горшинова В. К., 2016;
Монастырная О. А., 2016; Shahrokh-Tehraninejad E., 2016; Pabucu E. G., 2016).
Однако, большинство исследований не затрагивают программы с
использованием размороженных эмбрионов. Наличие принципиальных различий не позволяет транспонировать результаты исследований, полученных в программах ВРТ с использованием «свежих» эмбрионов, на программы с использованием размороженных эмбрионов. Единичные исследования по данной проблеме не отображают проблему многократных неудачных имплантаций в программах ВРТ с использованием размороженных эмбрионов в полном объеме и не позволяют ответить на вопросы, поставленные в данном исследовании.
Остается до конца нерешенным вопрос использования заместительной гормональной терапии при подготовке эндометрия к переносу размороженного эмбриона. Методические рекомендации и исследования по данной проблеме крайне ограничены. Российской Ассоциации Репродукции Человека был предпринят ряд мер, направленных на систематизацию и разработку алгоритмов использования эстрогенов в программах ВРТ (Научно-практические рекомендации РАРЧ, 2015). Однако несмотря на широту представленных материалов, ряд вопросов остался незатронутым, в том числе клинические особенности влияния различных форм эстрогенов на эндометрий. Ближайшим по содержанию является исследования китайских ученых (Xu W. et al., 2013), однако особенности влияния различных форм эстрогенов на рецепторный статус эндометрия авторами изучены не были.
Ограниченные литературные данные и единичные исследования в рамках проблемы многократных неудачных имплантаций в программах переноса размороженных эмбрионов указывают на актуальность проведенного исследования и необходимость поиска новых путей решения данной проблемы.
Цель исследования. Повысить частоту наступления беременности в
программах переноса размороженного эмбриона на заместительной
гормональной терапии у пациенток с многократными неудачными имплантациями в анамнезе.
Задачи исследования:
1. Провести ретроспективный анализ частоты, причин и факторов риска
многократных неудачных имплантаций в программах переноса
размороженного эмбриона.
2. Проанализировать состояние репродуктивной системы у пациенток с
многократными неудачными имплантациями в криопротоколах в анамнезе с
целью их дальнейшего предупреждения.
3. Изучить морфологическую структуру эндометрия у пациенток с
многократными неудачными имплантациями в криопротоколах в анамнезе.
-
Сравнить уровни экспрессии рецепторов эндометрия к эстрогенам и маркера пролиферативной активности эндометрия (Ki-67) при различных его схемах подготовки на заместительной гормональной терапии в криопротоколах.
-
Оптимизировать схему подготовки эндометрия в криопротоколах у пациенток с многократными неудачными имплантациями в анамнезе и оценить ее клиническую эффективность.
Научная новизна. В работе впервые определены вероятные факторы
риска, нарушающие имплантационный потенциал эндометрия и
способствующие многократным неудачным имплантациям в протоколах переноса размороженного эмбриона.
Впервые выявлена и детально изучена структура морфофункциональных изменений эндометрия у пациенток с многократными неудачными имплантациями в протоколах переноса размороженного эмбриона.
Впервые проведен сравнительный анализ уровней экспрессии
-эстрогеновых рецепторов в эндометрии и пролиферативной активности клеток при различных его схемах подготовки на заместительной гормональной терапии в протоколах переноса размороженного эмбриона.
На основании полученных данных разработан и внедрен
дифференцированный подход в тактике ведения пациенток с многократными неудачными имплантациями в протоколах переноса размороженного эмбриона в анамнезе.
Теоретическая и практическая значимость работы. Определены факторы риска и сформированы группы риска пациенток с многократными неудачными имплантациями в протоколах переноса размороженного эмбриона.
Разработан алгоритм диагностических мероприятий с целью повышения частоты наступления беременностей у пациенток с многократными неудачными имплантациями в протоколах переноса размороженного эмбриона в анамнезе.
Разработан алгоритм лечебных мероприятий, способствующих
повышению результативности программ ВРТ с использованием
размороженного эмбриона.
Методология и методы исследования. Клинические, инструментальные, биохимические, морфологические и статистические.
Объект исследования. Женщины с многократными неудачными имплантациями в криопротоколах в анамнезе.
Предмет исследования. Причины неудачных имплантаций в
криопротоколах, морфологическая структура эндометрия у женщин с многократными неудачными имплантациями в криопереносах; уровни экспрессии -эстрогеновых рецепторов (-ЭР) и маркера пролиферативной активности клеток эндометрия (Ki-67) в различных схемах подготовки эндометрия на заместительной гормональной терапии в криопротоколах; предложенная схема подготовки эндометрия в криопротоколе у пациенток с многократными неудачными имплантациями в анамнезе.
Положения, выносимые на защиту:
1. Факторами риска развития многократных неудачных имплантаций в
протоколах переноса размороженных эмбрионов являются: два и более
гинекологических заболевания в анамнезе, два и более экстрагенитальных
заболевания, два и более оперативных вмешательств на органах малого таза в
анамнезе, два и более внутриматочных вмешательств в анамнезе, наличие в
анамнезе одной и более беременностей с абортивным исходом,
патоморфологические изменения в эндометрии, два и более фактора бесплодия,
длительность бесплодия более 10 лет.
2. В основе многократных неудачных имплантаций в протоколах
переноса размороженного эмбриона лежит морфофункциональная патология
эндометрия. Прогностическим критерием успешной имплантации в протоколах
переноса размороженного эмбриона является уровень экспрессии -
эстрогеновых рецепторов в эндометрии, не коррелирующий с уровнем
эстрадиола крови.
3. Разработанный алгоритм лечебно-диагностических мероприятий
позволяет увеличить результативность программ ВРТ с использованием
размороженного эмбриона у пациенток с многократными неудачными
имплантациями в протоколах переноса размороженного эмбриона в анамнезе.
Степень достоверности и апробация результатов. Основные положения работы доложены и обсуждены на заседаниях: проблемной комиссии Медицинской академии имени С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского» и межкафедральном собрании сотрудников кафедр акушерства и гинекологии № 1 и № 2, кафедры акушерства, гинекологии и перинатологии ФПКМК и ДПО (протокол № 4 от 30 мая 2018 года); на XX международной медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина – человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2017); XXX международном конгрессе с курсом эндоскопии «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологического заболеваний» (Москва, 2017); научно-практической конференции для студентов и молодых ученых (Ялта, 2017); 89-й международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Теоретические и практические аспекты современной медицины» (Симферополь, 2017); XXVII международной конференции «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (Санкт-Петербург, 2017); III Научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава,
аспирантов, студентов и молодых ученых «Дни науки КФУ им. В. И. Вернадского» (Симферополь, 2017); Международном конгрессе «Актуальные вопросы акушерства, гинекологии и перинатологии» (Судак, 2017, 2018).
Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 поименованных в перечне Высшей аттестационной комиссии (ВАК).
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 177 страницах компьютерного текста (Time New Roman 14) и состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, раздела обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций. Список цитируемой литературы включает 182 источников, из которых 62 на русском языках, 120 на иностранных языках. Работа иллюстрирована 45 таблицами, 32 рисунками.
Рецептивность эндометрия
Рецептивность эндометрия представляет собой комплекс морфофункциональных характеристик эндометрия с четкими временными рамками и определяющий способность эндометрия к имплантации бластоцисты [13, 29, 39, 107, 111, 150]. Долгое время для оценки уровня рецептивности эндометрия использовались различные морфологическе критерии, основным из которых являлись пиноподии, определяемые методом сканирующей электронной микроскопии (СЭM).
Участие пиноподий в процессе имплантации во многом остается достаточно дискутабельным вопросом. Существует ряд данных, что адгезия эмбриона к рецептивному эндометрию начинается именно на поверхности пиноподий. Помимо участия в начальных этапах адгезии, пиноподии участвуют в формировании специфического микроокружения, необходимого для успешной имплантации. Отдельные исследования демонстрируют позитивное влияние пиноподий на создание необходимой для успешной инвазии концентрации внутриматочных жидкостей [83, 98], а также усиление экспрессии ряда биологически-активных веществ и факторов роста. Установлена связь между экспрессией LIF и его рецептора на поверхности пиноподий и содержанием трансмембранной формы LIF в полости матки — необходимого условия для успешной имплантации [83]. Отмечается положительная корреляция между «зрелостью» пиноподий и концентрацией интегрина V3 и остеопонтина, также участвующих в процессе адгезии [71].
Научные достижения последних лет позволили значительно углубить изучение рецептивности эндометрия и выявить ряд факторов, влияющих на исход имплантации.
Вовлеченность генов в циклическую трансформацию эндометрия огромна. «Окно имплантации» характеризуется усиленной экспрессией приблизительно 395 генов при одновременной супрессии около 186 генов, кодирующих различные протеазы, транспортные белки кальция и других ионов, молекулы клеточной адгезии и внеклеточные матриксные белки [72]. Наиболее изученными в аспекте имплантации эмбриона на сегодня являются гены семейства HOX и гены, участвующие в регуляции временных рамок «окна имплантации» (ebaf, ВК66) [5, 67, 72, 89, 114, 115, 131, 158, 164, 171]. Ряд исследований продемонстрировал увеличение частоты встречаемости аллельных вариантов генов интерлейкина 1 (IL–l) и фактора некроза опухоли-альфа (TNF-) у пациенток с многократными неэффективными попытками ЭКО [4].
Исследования вовлеченности и особенности экспрессии генов в аспекте имплантации эмбриона крайне интересны и могут быть использованы для повышения результативности программ ВРТ, однако, использование данных технологий на практике в настоящее время крайне затруднительно ввиду необходимости больших материальных вложений, а также наличия высокотехнологической материально-технической базы и подготовленных специалистов.
На данный момент определены некоторые протеомные маркеры, связанные с рецептивностью эндометрия — молекулы адгезии, факторы роста, цитокины и рецепторы: семейство интерлейкина 1 (IL–1), LIF и его рецептор, интегрин V3, эпидермальный фактор роста (EGF), гепарин связывающий эпидермальный фактор роста (HB–EGF), L–селектин (CD62L), колониестимулирующий фактор–1 (CSF–1), IGF1, TNF, интерферон–гамма (IFN–), фактор роста фибробластов (FGF) и множество других [21, 27, 44, 64, 137, 173].
Достаточно изучены в аспекте влияния на процесс имплантации человеческого эмбриона LIF и интегрины (V3, 41, 11). Ряд исследований выявили взаимосвязь между снижением продукции LIF в эндометрии и неудачами в программах ВРТ у женщин репродуктивного возраста [11, 41, 42, 83, 86].
Вовлеченность в процесс имплантации множества иммунных и ангиогенных механизмов обуславливает его похожесть на процесс развития воспаления [20, 31, 66, 156]. Роль иммунных механизмов в имплантации эмбриона активно изучается в настоящее время. Имеются данные о значительном влиянии соотношения провоспалительных (Т–хэлперы 1-го типа (Th–1)) и противовоспалительных (Т–хэлперы 2-го типа (Th–2)) цитокинов на исход имплантации. Однако мнения ученых и результаты проводимых в этой области исследований противоречивы. Ряд данных свидетельствует о наличии положительной взаимосвязи синтеза цитокинов типа Th–2 с наступлением и протеканием беременности [75, 92]. В других исследованиях выявлено решающее значение Th–1-ассоциированных цитокинов в поддержании и пролонгировании беременности [81, 161]. В некоторых работах ведущая роль в успехе имплантации отводится маточным натуральным киллерам (NK), активно влияющих и регулирующих инвазию трофобласта [180] и являющихся важной частью в процессе децидуализации эндометрия. Одним из вероятных иммунологических факторов, нарушающих имплантацию, является аутоиммунизация — у пациенток с классическими аутоиммунными заболеваниями зачастую первым диагностируется бесплодие, еще до появления клинических симптомов заболевания [9, 78, 176].
Роль иммунных нарушений в аспекте неудачных имплантаций начали изучать одной из первых. Еще в конце ХХ века ряд ученых выделил пять категорий иммунных нарушений, являющихся причиной неудачных имплантаций в циклах ЭКО: HLA–совместимость супругов, циркуляция антифосфолипидных, антинуклеарных и антиспермальных антител, а также увеличение содержания в крови естественных киллеров CD56 или высокое содержание / патологическая активация CD19+5+. Повышение CD56+ выше 18,0 % ассоциируется с чрезмерным синтезом провоспалительных цитокинов, в том числе, TNF–, которые повреждают клетки трофобласта и нарушают процесс имплантации. Количество CD19+5+ клеток свыше 10,0 %, или их избыточная активация вызывает синтез аутоантител к эстрадиолу и прогестерону, что также приводит к неудачной имплантации. По некоторым данным, на избыточную концентрацию CD56+ и CD19+5+ клеток приходится 45,0 % неудачных имплантаций как в цикле ЭКО, так и при естественном оплодотворении [124].
Анализ влияния уровня секреции макрофагально-гранулоцитарного (GM-CSF) колониестимулирующего фактора в яичниках у больных с сочетанными формами бесплодия на эффективность программ ВРТ выявил, что уровень GM CSF в циркулирующей крови может служить прогностическим маркером исхода имплантации и программы ВРТ [81]. Внутриматочное ведения гранулоцитарно-колониестимулирующего фактора (G-CSF) пациенткам с «тонким» эндометрием (менее 7 мм) и слабым ответом на проводимую ЗГТ эстрогенами приводило к динамическому усилению роста эндометрия. Данные исследования крайне интересны для изучения в аспекте улучшения результативности программ ВРТ и с большой вероятностью окажут положительное влияние на повышение частоты наступления беременности у пациенток с МНИ.
Одной из ведущих причин неудачных имплантаций является патология системы гемостаза [9, 20, 28]. Рост, развитие и регрессия кровеносных сосудов во многом являются решающими в процессе имплантации эмбриона в эндометрий [53]. Влиянию ангиогенеза на имплантацию было посвящено множество исследований и был выявлен массивный пул ростовых факторов, оказывающих как супрессивное, так и стимулирующее воздействие на процесс ангиогенеза. Наибольшее значение выявлено для ростовых факторов семейств фибробластов (FGFs), трансформирующих (TGF) и эндотелиальных факторов роста (EGF). Наиболее изученным представителем семейства EGF является VEGF, отрицательное влияние которого на имплантацию было определено в серии экспериментов, выявивших увеличение уровня VEGF в сыворотке крови при неудачной имплантации эмбриона [9].
Ряд исследований демонстрирует высокую частоту встречаемости тромбофилий у пациенток с неудачными имплантациями в циклах ЭКО (до 90,0 %). В тоже время существует данные об отсутствии различий в частоте мутаций Лейдена, протромбина и гена MTHFR-С677Т в группе пациенток с неудачными имплантациями в циклах ЭКО и группе фертильных женщин без акушерских осложнений [22, 78, 176]. Ряд наблюдений демонстрирует более высокую частоту неудачных имплантаций у пациенток с полиморфными вариантами генов, ответственных за развитие гиперкоагуляции [22, 160, 169].
Ретроспективный анализ и клиническая характеристика пациенток с многократными неудачными имплантациями
С целью оценки частоты, причин и факторов риска МНИ в криопротоколах ВРТ на ретроспективном этапе нами было проанализировано 987 амбулаторных карт пациенток (учетная форма №025/у) и вкладышей в медицинскую карту амбулаторного больного при применении методов ВРТ, проходивших лечение в период с 2012 по 2017 года по транспортной схеме в клиниках: ООО МК «Ваш Доктор» (г. Симферополь) и ООО ЭКО-Центр «Альтра Вита» (г. Москва). Из них было отобрано 200 пациенток по следующим критериям:
1) возраст от 24 до 45 лет;
2) длительность бесплодия от 3 до 16 лет;
3) отсутствие генетической патологии у женщины и партнера;
4) подготовка эндометрия к переносу РЭ с использованием ЗГТ;
5) перенос одного размороженного эмбриона на стадии бластоцисты, хорошего и отличного качества (3–5 ВВ, ВА, АВ, АА) согласно классификации Gardner D. K., Schoolcraft W. B. (1999).
С целью выявления и определения наиболее значимых факторов риска МНИ в криопротоколах ВРТ 200 пациенток ретроспективной группы, отобранных согласно ранее описанных критериев, были разделены две группы:
1А — 100 пациенток, у которых клиническая беременность наступила с первой попытки переноса РЭ.
1Б — 100 пациенток с 2 и более неудачными имплантациями в анамнезе, которые продолжили лечение методами ВРТ.
В ходе анализа 987 амбулаторных карт пациенток ретроспективной группы нами были исключены 629, поскольку они не соответствовали вышеперечисленным критериям включения (Рисунок 3.1). Количество исключенных амбулаторных карт не соответствует общему числу наблюдений, поскольку некоторые из них не соответствовали нескольким критериям включения одновременно.
Среди пациенток, не вошедших в исследование, была отмечена низкая обращаемость их в клиники ВРТ в возрасте младше 24 и старше 45 лет, 1,8 % (16) и 4,6 % (41) соответственно. Низкая обращаемость пациенток младшего возраста отвечает тенденции к откладыванию реализации репродуктивных планов на более поздний возраст под воздействием социальных факторов. Женщины позднего репродуктивного возраста имеют общую тенденцию к увеличению количества противопоказаний к циклам ВРТ, а также невозможности проведения процедуры в следствие увеличения у них генитальной и экстрагенитальной патологий, что объясняет небольшое количество пациенток старше 45 лет.
Частота обращаемости женщин с длительностью бесплодия менее 3-х лет составляет всего 3,8 % (34), что, вероятно, указывает на низкую информированность и заинтересованность женского населения в наступлении беременности, а также недостатки обследования и диагностики на амбулаторно-поликлиническом этапе. Пациентки с длительностью бесплодия более 16 лет составили 5,75 % (51), при этом 86,2 % (35) вошли в группу позднего репродуктивного возраста.
У 218 пациенток (22,1 %) в предшествующих криопротоколах был осуществлен перенос 2-х размороженных эмбрионов, у 21 (2,1 %) — 3-х и более.
Генетические мутации были диагностированы в 28 случаях (2,8 %) –— 11 случаев (1,1 %) у женщин и 17 (1,7 %) — у мужчин.
При анализе кратности неудачных имплантаций РЭ у 987 пациенток в 29,8 % (294) беременность наступила после первой попытки переноса РЭ, у 197 (20,0 %) в анамнезе имелась только 1 неудачная имплантация, 2 и более неудачные имплантации встречались у 496 (50,3 %) женщин.
Треть пациенток, 298 женщин (33,6 %), с МНИ в анамнезе, которые не вошли в исследование, отказались продолжить лечение методами ВРТ, при этом 49,0 % (146 из 298) из них полностью отказались от реализации репродуктивных планов в дальнейшем (Рисунок 3.2), что подчеркивает не только медицинский, но и социальный характер проблемы МНИ.
Таким образом, из 146 женщин с 2 и более неудачными имплантациями РЭ в анамнезе и продолживших лечение методами ВРТ в соответствии с критериями было отобрано 100 пациенток, сформировавших основную группы 1Б.
Из 194 пациенток, у которых беременность наступила после первой попытки переноса РЭ и соответствовавших критериям включения, в рандомном порядке было отобрано 100, составивших контрольную группу 1А ретроспективного этапа исследования.
На ретроспективном этапе на основании амбулаторных карт (учетная форма №025/у) и вкладышей в медицинскую карту амбулаторного больного при применении методов ВРТ был проведен детальный анализ пациенток групп 1А и 1Б. Изучались соматические факторы (возраст, ИМТ, наличие и характер экстрагенитальной патологии), способные повлиять на исход имплантации, особенности репродуктивной функции женщины (характер и длительность бесплодия, особенности менструальной функции, наличие и исходы предыдущих беременностей, используемая контрацепция, перенесенные заболевания ОМТ, в том числе инфекционные, а также объем и характер оперативных вмешательств, использование программ ВРТ в анамнезе, данные морфологического и УЗ– обследования), детально изучались предшествующие протоколы подготовки эндометрия к переносу РЭ (схемы подготовки эндометрия к криопереносу, объем проведенного лечения до переноса, результаты предшествующего обследования), а также количество и качество перенесенных эмбрионов и исходы лечения.
Большинство исследуемых нами женщин находились в возрастном диапазоне 31–35 лет — 43,0 % (43) в группе 1А и 39,0 % (39) в группе 1Б, то есть в активном репродуктивном возрасте. 23,0 % (23) в группе 1А составили женщины от 36 до 39 лет, в группе 1Б пациентки данной возрастной группы составили 27,0 % (27). Пациентки старше 39 лет, т. е. позднего репродуктивного возраста составили в группах 1А и 1Б 20,0 % (20) и 22,0 % (22) соответственно. Наименьшее количество пациенток в обеих группах было отмечено нами в возрасте до 30 лет — 14,0 % (14) в группе 1А и 12,0 % (12) в группе 1Б (Таблица 3.1).
Для оценки возможных различий в распределении пациенток по выбранным нами возрастным категориями нами был использован критерий «хи-квадрат» (Таблица 3.1). Получение результаты с большой вероятностью (р = 0,917) демонстрировали отсутствие отличий в распределении. Для сравнения групп по среднему возрасту пациенток был использован критерий Стьюдента c двусторонней критической областью (Таблица 3.1). Результаты применения данного критерия с учетом большого размера выборок также продемонстрировали отсутствие значимых различий в среднем возрасте женщин в группах 1А и 1Б (p = 0,485).
Клиническая характеристика пациенток проспективной группы исследования
В проспективную группу проводимого нами исследования вошли пациентки ретроспективной группы 1Б (100). Проспективный этап исследования включал в себя весь период обследования и лечения, согласно разработанному нами алгоритму, а также подготовку эндометрия с использованием ЗГТ к переносу размороженной бластоцисты, непосредственно эмбриотрансфер РЭ и динамическое наблюдение после переноса РЭ с контролем наступления клинической беременности. В связи с этим весь проспективный этап был разделен на 5 циклов: диагностики, лечения, подготовки эндометрия без переноса РЭ, подготовки эндометрия с переносом РЭ и контроля результатов.
В зависимости от выбора ЗГТ при подготовке эндометрия к переносу РЭ все пациентки были разделены на 2 группы:
2А — 50 пациенток, которые в рамках подготовки эндометрия к криопереносу получали пероральную форму ЭВ в дозе 4 мг со 2 дня МЦ.
2Б — 50 пациенток, которые в рамках подготовки эндометрия к криопереносу получали пероральную форму 17–Э в дозе 4 мг со 2 дня МЦ.
Распределение женщин на группы в проспективном этапе исследования было проведено таким образом, что группы были сопоставимы по возрасту, частоте встречаемости сопутствующей экстрагенитальной патологии, количеству факторов бесплодия и характеру лидирующего из них, а также частоте неудачных имплантаций в анамнезе.
Средний возраст женщин, вошедших в группу 2А (50) составил 35,3 ± 0,63 лет, в группе 2Б — 35,2 ± 0,64 лет, таким образом, большинство пациенток в обеих группах составили женщины активного репродуктивного возраста (Таблица 4.1). Проведенный статистический анализ с использованием критериев Стьюдента и «хи-квадрат» не выявил достоверных различий как в выборочных средних в возрасте пациенток (2 = 8,810, р = 0,455, df = 9), так и при попарном сравнении различных возрастных групп (2 = 0,06 при р = 0,996, df =3), что позволяет констатировать полную идентичность групп 2А и 2Б по возрасту и исключить влияние возраста пациенток на исход проведенного лечения и наступления успешной имплантации.
В обеих группах 96,0 % (48) пациенток имели в анамнезе сопутствующую экстрагенитальную патологию, при этом среднее число заболеваний на одну пациентку в группе 2А (50) составило 1,66 ± 0,13, а в группе 2Б (50) — 1,68 ± 0,12 (Таблица 4.2). В структуре экстрагенитальной патологии в обеих группах преобладали заболевания щитовидной железы в виде других форм нетоксического зоба (66,0% (33) в группе 2А, и 68,0% (34) в группе 2Б).
Статистический анализ распределения частоты встречаемости сопутствующих заболеваний был проведен с использованием критерия «хи-квадрат» и не выявил достоверных различий в распределениях (2 = 0,08 при р = 0,994, число степеней свободы df = 3), что свидетельствует о практически полном совпадении групп по частоте встречаемости сопутствующей патологии, что позволяет минимизировать влияние сопутствующей экстрагенитальной патологии при анализе результативности ЗГТ в протоколах подготовки эндометрия к переносу РЭ.
В группах проспективного этапа исследования среднее число вероятных факторов бесплодия составило 2,04 ± 0,09 для группы 2А и 2,06 ± 0,1 в группе 2Б (Таблица 4.3), при этом лидирующим из установленных факторов бесплодия в обеих группах являлся трубно-перитонеальный — 52,9 % в группе 2А и 48,0 % в группе 2Б.
Статистический анализ структуры групп 2А и 2Б в зависимости от количества вероятных факторов бесплодия по критерию хи-квадрат не выявил достоверных различий в распределениях (2 = 0,37, р = 0,831, df = 2), что сделало возможным выбор препарата ЗГТ без учета факторов бесплодия и позволило исключить влияние непосредственно самого преобладающего фактора на результативность проводимого цикла переноса РЭ.
В обеих группах большинство пациенток имели в анамнезе три неудачных имплантации РЭ — 42,0 % (21) в группе 2А и 44,0 % (22) в группе 2Б. Среднее число переносов РЭ на одну женщину в группе 2А составило 3,96 ± 0,2, в группе 2Б этот показатель составил 3,84 ± 0,18 (Таблица 4.4). Проверка различий в распределениях количества неудачных имплантаций в анамнезе с помощью критерия «хи-квадрат» показала гомогенность групп по данному признаку (2 = 1,24, р = 0,941, df = 5).
Цикл диагностики на проспективном этапе исследования в обеих группах включал в себя обследование согласно приказу Минздрава России от 30.08.2012 № 107н (ред. от 11.06.2015) «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению», а также согласно разработанному нами алгоритму обследования женщин с МНИ при подготовке эндометрия к переносу РЭ.
Учитывая широкое распространение заболеваний ОМТ у исследуемых пациенток, выявленное на ретроспективном этапе (100 %, среднее количество гинекологических заболеваний на одну пациентку 2,2 ± 0,08), в обеих группах было проведена расширенная диагностика патологии ОМТ, что включало в себя проведение экспертного УЗИ ОМТ, анализ биоценоза влагалища, в том числе методом ПЦР, оценку гормонального статуса пациентки в раннюю фолликулярную фазу цикла (со 2 по 5 день МЦ — ФСГ, ЛГ, эстрадиол, АМГ, ДЭА-сульфат, тестостерона свободного) и вторую фазу менструального цикла (с 21 по 25 день МЦ — прогестерон), а также гистероскопию с последующей морфологической оценкой структуры эндометрия. Использованный нами комплексный подход к изучению состояния репродуктивной функции выявил ряд несовпадений в результатах обследования пациенток на ретроспективном и проспективном этапах.
Структура патологии ОМТ, выявленной при экспертном УЗИ представлена в таблице 4.5. Среднее число заболеваний ОМТ в анализируемых группах практически идентично и составило 2,08 ± 0,03 и 2,14 ± 0,02 соответственно для групп 2А и 2Б. Статистический анализ проводился путем попарного сравнения долей каждой из патологий в разных группах с использованием критерия «Угловое преобразование Фишера» с поправкой Йейтса и не выявил достоверных различий, что свидетельствуют о гомогенности групп.
Определяется высокая частота обнаружения косвенных признаков спаечного процесса (нарушение нормального топографического соотношения ОМТ, сактосальпинкс) в обеих группах — 62,0 % (31) в группе 2А и 68,0 % (34) в группе 2Б, что согласуется с большим количеством оперативных вмешательств на ОМТ и ВЗОМТ в анамнезе, выявленных на ретроспективном этапе исследования.
На проспективном этапе определяется более высокая частота встречаемости миомы матки — 29,0 % (29), по сравнению с ретроспективным этапом 24,0 % (24), что связано с выявлением интрамуральных миоматозных узлов размерами менее 1,5 см. Несмотря на литературные данные об отсутствии их непосредственного влияния на процесс имплантации эмбриона и частоту наступления беременности [117], мы предполагаем определенную взаимосвязь между МНИ в криопротоколах и наличием миоматозных узлов в матке, что, вероятно, связано с общими для данных патологических состояний этиопатогенетическими механизмами развития, в числе которых нарушения нейрогуморальной регуляции функции клеток эндо- и миометрия, а также инфекционные процессы. Несовпадение количества наблюдений с числом пациенток в группах проспективного этапа исследования объясняется наличием у них сочетания нескольких патологических изменений ОМТ.
Оценка уровня экспрессии рецепторов эндометрия к эстрогенам и маркера пролиферативной активности эндометрия (Ki-67) при различных его схемах подготовки на заместительной гормональной терапии в протоколах подготовки эндометрия к переносу размороженного эмбриона
Для сравнения влияния препаратов ЗГТ в обеих группах на рецептивность эндометрия, а именно уровень экспрессии –ЭР и маркера пролиферативной активности эндометрия (Ki-67), пациенткам обеих групп в цикле подготовки эндометрия без переноса РЭ проводилась пайпель-биопсия эндометрия в раннюю пролиферативную фазу МЦ (с 9 по 11 день ЗГТ) с последующим ИГХ исследованием материалов.
При ИГХ исследовании –ЭР у пациенток 2А группы, которым подготовка эндометрия осуществлялась пероральной формой ЭВ, отмечалась умеренно выраженная экспрессия –ЭР, которая составляла 123,6 ± 0,69 балла (Рисунок 4.16).
У пациенток 2Б группы, получавших в рамках ЗГТ пероральную форму 17–Э, при ИГХ исследовании отмечалась выраженная экспрессия –ЭР, составлявшая 207,2±1,13 балла (Рисунок 4.17).
При ИГХ исследование биоптатов эндометрия с маркером пролиферативной активности клеток Ki-67 у пациенток 2А группы процент позитивно окрашенных клеток составлял 22,8 ± 0,35 в железах (слабо выраженная экспрессия Ki-67) и 7,7 ± 0,18 в строме (Рисунок 4.18).
Исследование материалов, полученных от пациенток 2Б группы, выявило больший процент пролиферативно активных клеток, по сравнению с результатами, полученными в группе 2А, как в железах, так и в строме, который составлял соответственно 37,2 ± 0,41 и 21,1 ± 0,49 (Рисунок 4.19).
Проведенный статистический анализ с использованием критерия Стьюдента для независимых выборок, выявил статистически достоверные и очень высоко значимые различия (р 0,001) в анализируемых группах. Полученные нами данные демонстрируют, что использование препарата 17–Э в рамках ЗГТ при подготовке эндометрия к переносу РЭ у пациенток 2Б группы сопровождалось более выраженной, по сравнению с группой 2А, экспрессией –ЭР и статистически достоверным повышением пролиферативной активности клеток желез и стромы эндометрия (Таблица 4.13).
Более высокий уровень чувствительности рецепторного аппарата эндометрия и пролиферативной активности клеток, свидетельствует о лучшей подготовке эндометрия и формировании более благоприятных условий для имплантации. Такие изменения позволяют прогнозировать повышение частоты наступления беременности в протоколах переноса РЭ у пациенток с МНИ в криопротоколах в анамнезе.
Более выраженное влияние препарата 17–Э, вероятно, связано с особенностями его химического строения, биоидентичного натуральному эстрогену, вырабатываемому в организме женщины, а также фармакокинетики и фармакодинамики изучаемых препаратов.