Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Возможности решения проблемы прогнозирования и ранней диагностики преждевременных родов (обзор литературы) 11
1.1. Современные представления о патогенезе преждевременных родов 11
1.2. Оксидативный стресс, как один из ключевых этапов развития преждевременных родов 23
1.3. Представления о прогнозировании и диагностике преждевременных родов 31
Глава 2. Материал и методы исследования 41
2.1. Материал исследования 41
2.2. Методы исследования 43
Результаты собственных исследований
Глава 3. Общая клиническая характеристика обследованных беременных 53
Глава 4. Особенности течения и исходы беременности, родов, послеродового периода, состояние микробиоценоза влагалища и факторов антиоксидантной защиты перед родами у пациенток при преждевременных родах 61
4.1. Особенности течения беременности, родов, послеродового периода у наблюдаемых пациенток 61
4.2. Состояние микробиоценоза влагалища у беременных перед родами 65
4.3. Диагностическая роль факторов антиоксидантной защиты при преждевременных родах 75
4.4. Исход родов для плода, течение раннего неонатального периода у женщин при преждевременных родах 83
Глава 5. Обсуждение полученных результатов 85
Выводы 98
Практические рекомендации 100
Список сокращений 102
Список литературы 105
- Оксидативный стресс, как один из ключевых этапов развития преждевременных родов
- Общая клиническая характеристика обследованных беременных
- Особенности течения беременности, родов, послеродового периода у наблюдаемых пациенток
- Диагностическая роль факторов антиоксидантной защиты при преждевременных родах
Оксидативный стресс, как один из ключевых этапов развития преждевременных родов
В современной литературе в патогенезе преждевременных родов ключевая роль отводится синдрому системного воспалительного ответа (ССВО), при котором происходят реакции приводящие к метаболическим расстройствам в организме матери. [17, 20, 35]. Поскольку метаболические нарушения изменяют равновесие между окислительными и восстановительными процессами в периферической крови и тканях, ПР часто сопровождаются манифестацией симптомов, типичных для хронического оксидативного стресса – накоплением продуктов перекисного окисления липидов, аддуктов ковалентной модификации белков, падением эффективности энергопреобразующих мембран митохондрий и ростом числа повреждений ядерной и митохондриальной ДНК [47, 48, 69]. Однако, на сегодняшний день в работах, посвященных проблеме преждевременных родов, представлено недостаточно данных, на основании которых можно с точностью определить вклад процессов окислительного стресса, которые происходят в системе «мать-плацента-плод» [5, 66, 69].
Как описано выше, в патогенезе осложнений беременности и раннего неонатального периода значимая роль отводится воспалительной реакции, в генезе которой необходимо выделять компонент, приводящий к хроническому оксидативному стрессу [3, 5, 20, 129]. Таким компонентом является дисбаланс между нормальной продукцией активных форм кислорода (АФК), имеющей ключевое значение для иммунного ответа и передачи внутриклеточных сигналов, и утилизацией свободных радикалов системой антиоксидантной защиты, активирующейся при избыточной продукции АФК [6, 19, 35, 145]. В физиологических условиях 95% всего потребляемого клетками кислорода используется в процессе окислительного фосфорилирования в митохондриях, то есть восстанавливается с образованием молекул воды. При этом до 5% кислорода в результате разных ферментативных реакций превращаются в АФК (первичные радикалы), которые могут запускать процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) с образованием липидных радикалов (вторичные радикалы) [7, 129, 110]. В нормальных условиях в клетке свободные радикалы являются ключевыми участниками таких важных процессов, как перенос электронов, обновление состава липидных биомембран, деградация поврежденных макромолекул до простых соединений, аутофагия и внутриклеточный лизис органелл, митогенез, проведение нервного импульса и др. [6, 130, 131]. Основной мишенью свободных радикалов при их избыточной продукции в крови являются клетки эндотелия и пролиферирующие клетки стромы стенки сосудов [137, 160]. Учитывая вышесказанное, при беременности избыточная продукция свободных радикалов может нарушать нормальный рост плаценты, ее обновление и функционирование, что часто приводит к развитию плацентарной недостаточности и ассоциированных с ней патологий, а также к ПР и/или мертворождению [145, 155, 156].
Известно, что при физиологически протекающей беременности также отмечается окислительный стресс, который носит контролируемый характер и является одним из важнейших участников механизма, обеспечивающего общую об адаптацию организма к стрессовым факторам [119, 120]. При этом у женщин отмечается повышение концентрации АФК и продуктов ПОЛ в крови (плазме и клетках крови), что компенсируется увеличением активности антиоксидантных ферментов, при этом антиоксидантную систему организма можно рассматривать как многокомпонентную систему, проявляющую специфическую и неспецифическую активность [7, 19, 129]. Как уже упоминалось ранее, контроль уровня окислительного стресса (ОС) осуществляется посредством баланса активности про- и антиоксидантной систем, однако, по мере развития беременности это равновесие может нарушаться [120, 121, 154]. При физиологически протекающей беременности ОС возникает на стадии формирования артериальной циркуляции и, по мере увеличения напряжения кислорода в плаценте, выполняет роль триггера процессов дифференцировки клеток, необходимых для поддержания функционального состояния плаценты [119, 122]. В кратковременный период относительного дисбаланса продукции и утилизации АФК происходит адаптация системы антиоксидантной защиты организма матери к сдвигу физиологического равновесия [197, 199]. При этом изменение уровня равновесных концентраций свободных радикалов приводит к дефициту системы антиоксидантной защиты и нарастающим процессам свободно радикального окисления, что определяет значительное снижение не только детоксикационной, но и метаболической функции плаценты [119, 158, 183].
Суммируя вышесказанное, продукция свободных радикалов и других прооксидантов может превысить емкость антиоксидантных буферных систем матери и плода, что приведет к накоплению поврежденных макромолекул и индукции программированной гибели клеток плаценты [6, 35, 162]. Данный механизм запускает не только такие осложнения беременности, как преждевременные роды, преэклампсия, синдром задержки роста плода, преждевременный разрыв плодных оболочек, но и в целом опосредует плацентарную недостаточность [66, 145, 155]. Наконец, неконтролируемый ОС является одним из этиопатогенетичеких факторов развития ряда осложнений в раннем неонатальном периоде, например бронхолегочной дисплазии и внутрижелудочковым кровоизлияниям, поскольку у недоношенного новорожденного системы антиоксидантной защиты еще недостаточно развиты [30, 33, 128]. Роль триггера развития патологии обычно выполняет длительная инфекционная активность, при которой наблюдается нарушение механизмов активации фагоцитов и, как следствие, повышенный воспалительный ответ [47, 132]. Критичным фактором является длительность транзитного снижения активности антиоксидантных систем и/или избыточной продукции радикалов НАДФН-оксидазой, миелопероксидазой или митохондриями макрофагов, приводящих к накоплению продуктов ПОЛ до пороговых значений, при которых происходит инактивирующая белки модификация их структуры, связанная с образованием внутримолекулярных сшивок или ковалентных аддуктов [6, 17, 110, 112]. Особенно опасна подобная модификация в том случае, если затрагивает структуру регуляторных или транскрипционных факторов, поскольку при этом инициируется последовательность событий, приводящих к формированию петли положительной обратной связи на уровне регуляции генома. В результате этого происходит снижение уровня экспрессии элементов системы антиоксидантной защиты, приводящее к дальнейшему существенному падению ее емкости [6, 30, 33, 48]. Таким образом, долговременное несбалансированное воздействие АФК на клетки и ткани организма приводит к нарушению тканевого гомеостаза, дисфункции тканей и органов, системным нарушениям [7, 19, 35, 164]. Для предотвращения цитотоксического повреждения протеинов, липидов и ДНК под действием активных форм кислорода и азота (АФА) необходимо согласованное действие ферментативных и неферментативных компонентов антиоксидантной защитной системы [36, 69, 113]. АФК при беременности могут запускать простагландиновый каскад, приводящий к раскрытию шейки матки, развитию родовой деятельности, а также способствующий вазоконстрикции, результатом которой может стать преэклампсия [33, 36, 155]. В то же время АФА оказывают повреждающее действие на клеточную ДНК, а также при беременности способны блокировать сигнальный путь нормальной вазодилатации, что, способствует повышению артериального давления и нарушению плацентарного кровотока, также приводят к развитию преэклампсии, плацентарной недостаточности, задержки роста плода (ЗРП), преждевременным родам [101, 145, 155].
Снижение активности антиоксидантных ферментов в крови может привести к накоплению АФК и окислительному повреждению мембранных белков, в том числе рецепторных комплексов [101, 117, 128]. Известно, что уже при угрозе прерывания беременности происходит изменение структурно-функционального состояния поверхностных компонентов мембран [20, 129]. Кроме того, нарушение структурно-функционального состояния мембран при патологии беременности может быть связано с окислительной деструкцией, как белков, так и липидов клеточных мембран [145, 155]. При этом уже на начальной стадии патологического процесса происходит накопление в периферической крови матери продуктов распада клеток и внутриклеточных органелл синцитиотрофобласта, в том числе в результате развития инфекции и/или асептического воспаления [8, 10, 70]. Этот процесс инициирует активацию клеток иммунной системы матери, приводящей к окислительному взрыву и массовому лизису эритроцитов [6, 122, 123].
Известно, что эритроциты, являясь одной из самых массовых клеточных популяций крови, помимо функции переноса кислорода и СО2 выполняют также роль первичных деструкторов АФК. Для поддержания постоянного уровня АФК в крови эритроциты содержат в своих мембранах большое количество антиоксидантных ферментов, снижение активности которых может приводить к локальному повышению уровня АФК и вызывать окислительное повреждение мембранных белков циркулирующих клеток крови и клеток стенки сосудов и прилегающих тканей [103, 129, 152].
Общая клиническая характеристика обследованных беременных
В период с октября 2013 года по август 2016 года было проведено проспективное исследование с участием 250 женщин, наблюдавшихся в научно-поликлиническом отделении и родоразрешенных в акушерских отделениях ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Проведен комплексный анализ исходной клинической характеристики, особенностей течения беременности и ее исходов для матери, плода и новорожденного. На основании полученных данных клинико-лабораторного обследования, а так же с учетом особенностей течения беременности и разработанных критериев включения 223 пациентки продолжили участие в исследовании.
Беременные женщины были включены в исследование по
обращаемости. В соответствии с полученными данными клинико-лабораторного обследования, выставленным диагнозом и разработанными критериями включения в исследование все, пациентки были разделены на 3 группы.
Критериями включения в основную группу и группу сравнения послужили: информированное добровольное согласие женщины, одноплодная беременность, угрожающие преждевременные роды на сроке гестации с 22 недель до 36 недель и 6 дней, отсутствие регулярной родовой деятельности.
Критериями включения в контрольную группу являлись: информированное добровольное согласие женщины, одноплодная беременность, родоразрешение на сроке от 37 недель до 40 недель 6 дней беременности, отсутствие регулярной родовой деятельности. Критериями исключения являлись: преждевременное излитие околоплодных вод, многоплодная беременность, внутриутробные пороки развития плода, наличие тяжелой экстрагенитальной патологии и истмико-цервикальной недостаточности.
Группу 1 (основная группа) составили 46 беременных, родивших в сроках от 22 до 36 недель, в течение 7 дней после проведения обследования. Группу 2 (группа сравнения) – 79 пациентки с угрожающими преждевременными родами с последующим родоразрешением в доношенном сроке беременности. Группу 3 (контрольная группа) – 98 условно здоровых беременных, родоразрешенных в срок. На рисунке 4 продемонстрирован дизайн проведенного проспективного когортного исследования.
Анализ соматического и акушерско-гинекологического анамнеза
Все беременные женщины, включенные в исследование, были сопоставимы по возрасту и соматическому здоровью.
Возраст беременных, включенных в исследование, колебался в пределах от 18 до 41 года и составил в среднем – 31,4±0,5, 30,2±0,5 и 28,4±0,5 года (по группам соответственно). В таблице 1 представлено более подробное распределение женщин по возрастным градациям.
Как видно из представленных в таблице 1 данных в группе 3 (группа контроля) количество пациенток в возрасте от 18 до 23 лет (23,5%) было несколько больше, а в возрастной категории от 36 лет и старше достоверно меньше (4,1%) (р 0,05), чем в двух других группах. При анализе распределения пациенток внутри подгрупп достоверных различий выявлено не было. В целом можно заключить, что пациентки исследуемых групп были сопоставимы по возрасту.
Анализ массо-ростовых соотношений у обследованных беременных отклонений от популяционных норм не выявил. Средняя масса тела составила 64,1+2,1, 65,3+ 2,2, 63,8+2,0 кг, средний рост – 166,1+3,2, 165,4+ 3,9 и 167,9+4,6 см в группах 1, 2 и 3 соответственно.
Проведенный сравнительный анализ исходной клинической характеристики женщин в исследуемых группах выявил интересные закономерности (таблица 2).
Анализ структуры экстрагенитальной патологии показал (таблица 2, рисунок 5), что у пациенток с преждевременными родами (основная группа) отмечалось достоверное увеличение частоты нарушения жирового обмена (n=22, 47,8%) (OR=1,95 (0,1-22,2)), p 0,05) и хронического цистита (n=9, 19,6% (OR=1,78 (0,6-5,1)), p 0,05).
Среди пациенток с реализацией преждевременных родов (основная группа) и угрожающими преждевременными родами (группа сравнения) выявлено достоверное увеличение частоты варикозного расширения вен нижних конечностей (n=13, 28,3% (OR=3,93 (0,2-64,7)), p 0,05), (n=15, 18,9% (OR=2,98 (0,2-35,1)), p 0,05) и хронического пиелонефрита (n=8, 17,4% (OR= 1,55 (0,5-4,3)), p 0,05), (n=6, 7,6% (OR=1,78 (0,6-5,1)), p 0,05).
Таким образом, статистически значимыми факторами в развитии преждевременных родов можно считать заболевания органов мочеполовой системы, варикозное расширение вен нижних конечностей и нарушение жирового обмена.
С целью изучения состояния репродуктивного здоровья женщин, вошедших в исследование, был проведен анализ акушерско гинекологического анамнеза.
Как видно из данных, представленных в таблицах 3 и 4 достоверных различий в возрасте наступления менархе и характере менструальной функции, по группам не выявлено.
Среди гинекологических заболеваний в группе 1 было отмечено достоверное увеличение цервицита (n=21, 45,7%, OR= 1,72 (0,5-5,3)), p 0,05), хронического эндометрита (n=5, 10,9%, OR= 2,36 (0,7-7,6)), p 0,05) и бесплодия в анамнезе (n=6, 13,1%, OR= 1,11 (0,2-4,7)), p 0,05).
Данные анализа частоты гинекологической заболеваемости представлены в таблице 5.
Особенности течения беременности, родов, послеродового периода у наблюдаемых пациенток
С учетом данных о частоте и структуре осложнений беременности, родов и послеродового периода у женщин с преждевременными родами, включенных в исследование, был проведен анализ течения беременности, родов, послеродового периода.
Несмотря на разделение пациенток на две группы по реализации преждевременных родов, представляется интересным анализ сочетания этого фактора с другими осложнениями беременности, которые могут быть как причиной ПР, так и сопутствующими осложнениями.
У пациенток группы 1 в I триместре достоверно чаще встречались такие осложнения беременности как ранний токсикоз (n=12, 26,1%), (OR=4,61 (15,24-1,39), p 0,05) и ретрохориальная гематома (по данным УЗИ) (n=6, 13,1%) (OR=2,2 (0,4-12,1), p 0,05), а во II триместре – хроническая артериальная гипертензия (n=4, 8,7%, (OR=6,67 (1,8-23,7)), p 0,05).
Как видно из данных, представленных в таблице 6 и на рисунке 8, в III триместре беременности в группе 1 статистически значимо чаще отмечалась задержка роста плода и хроническая плацентарная недостаточность (n=10, 21,7%) (OR=4,40 (1,1-16,3), p 0,05), анемия беременных (n=13, 28,1%) (OR=5,37 (1,0-10,3), p 0,05).
У женщин, вошедших в группы 1 и 2, в отличие от группы контроля, имело место обострение воспалительных заболеваний, как с дальнейшим развитием внутриутробной инфекции у новорожденных, так и без такового. Этот факт говорит в пользу предположения об инфекционно-воспалительном характере развития преждевременных родов. По-видимому неспецифический вульвовагинит и многоводие, которые отмечались достоверно чаще (р 0,05)
Особый интерес представляло изучение течения настоящей беременности. Следует отметить, что в основной группе течение I триместра отмечалось достоверное увеличение (р 0,05) частоты раннего токсикоза (26,1%), угрозы прерывания (13%) и отслойки хориона (52,2%). При этом достоверных различий в отношении других осложнений выявлено не было. Течение II триместра у пациенток основной группы сопровождалось достоверно более высокой частотой (р 0,05) патологии околоплодных вод в виде многоводия (10,9%) и маловодия (19,6%). В III триместре в этой же группе отмечалась высокая частота задержки роста плода (21,7%) и анемии (28,1%), превышающие таковые показатели в группе сравнения в 3 раза (р 0,05).
Средний гестационный срок, на котором беременные были родоразрешены, составил 33,6 недель в группе 1, 36,4 недели в группе 2 и 39,3 недели в группе контроля.
При анализе течения родов была установлена более высокая частота (р 0,05) абдоминального родоразрешения у беременных основной группы в связи с прогрессирующей гипоксией плода, преждевременной отслойкой плаценты и др. Достоверных различий по продолжительности родового акта, объему кровопотери по группам выявлено не было.
При этом в послеродовом периоде у пациенток группы 1 в 23,1% случаев были диагностированы эндометрит (7,7%) и субинволюция матки (15,4%) (p 0,05).
Анализ клинико-анамнестических данных пациенток позволяет с достаточно высокой вероятностью выделить такие факторы риска преждевременных родов, как нарушение жирового обмена, варикозное расширение вен нижних конечностей, хронический пиелонефрит, цистит, эндометрита, бесплодие, самопроизвольные выкидыши и неразвивающаяся беременность в анамнезе, неспецифический вульвовагинит и мало- или многоводие во время беременности.
Однако, все вышеуказанные факторы являются неспецифическим и могут быть применимы для различных акушерских синдромов. В связи с чем, наиболее актуальным и целесообразным является поиск патогенетически обоснованных молекулярно-генетических предикторов.
Для выяснения механизмов реализации данных патологических процессов, представляется важным дополнительное изучение состояния защитных систем организма, в частности системы врожденного иммунитета и факторов антиоксидантной защиты при преждевременных родах.
Диагностическая роль факторов антиоксидантной защиты при преждевременных родах
В данный этап исследования вошло 112 женщин в возрасте от 19 до 40 лет. Группу 1 составили 36 беременных, родивших в сроках от 22 недель до 36 недель, причем каждая группа была дополнительно разделена на три подгруппы в зависимости от срока гестации на момент включения в исследование – очень ранние ПР – 22-27 недель, ранние ПР – 28-32 недели и ПР – 33-36 недель гестации. В группу 2 вошли 42 случая угрожающих ПР также дополнительно стратифицированы по сроку гестации, с последующим родоразрешением в доношенном сроке беременности. Группу 3 составили 34 условно здоровых беременных разделенных по сроку гестации на момент включения в исследование – 22-27 недель, 28-32 недели и 33-36 недель с последующим родоразрешением в доношенном сроке беременности.
На первом этапе исследования мы провели анализ концентрации малонового диальдегида (МДА) и ферментативной активности каталазы в плазме крови был проведен для трех групп (преждевременные роды, угроза преждевременных родов, условно здоровые беременные, родоразрешенные в доношенном сроке). Результаты измерения ферментативной активности каталазы представлены в таблице 11 и на рисунке 14.
При однофакторном дисперсионном анализе выявили значимое влияние срока беременности на ферментативную активность каталазы в группе 2 (F(2.39)=3.6, p=0.04, рисунок 14) – активность каталазы увеличивалась по мере прогрессирования беременности. В группе 1 наблюдали тенденцию той же направленности, что и в группе II (F(2.33)=2.9, p=0.07, рисунок 14). В группе 3 влияние срока беременности на активность каталазы не было существенным (F(2.31)=0.4, p=0.6, рисунок 14). Интересно отметить, что в группе 2 (женщины с угрозой преждевременных родов, завершившейся в доношенном сроке беременности) максимальное значение активности каталазы наблюдали в сроке гестации 28-32 недели, в то время как в группе 1 (реализовавшиеся преждевременные роды) повышенную активность каталазы наблюдали вплоть до 33-36 недель беременности.
Данные представлены в виде среднего ± ст. откл. достоверное отличие от группы III, p 0,05; # тенденция к отличию от группы III, p 0,1; $ достоверное отличие от группы I, p 0,05 При сроке беременности 22-27 недель в группе 2 активность каталазы была достоверно выше (p=0.02) по сравнению с группой 3, а в группе 1 отмечалась тенденция к повышению (p=0.06). Между собой группы 1 и 2 не различались по данному показателю. Однако при сроке беременности 28-32 недели в группах 1 и 2 наблюдали достоверное повышение активности каталазы (p=0.004; p=0.002) по сравнению с группой 3. Сравнительный анализ активности каталазы в группах 1 и 2 показал, что в группе 2 встречается достоверно больше пациенток с активностью каталазы выше 95 Е/мл плазмы (p=0.045 по точному критерию Фишера).
Таким образом, можно сказать, что при угрозе преждевременных родов на сроке 28-32 недели беременности активность каталазы плазмы крови ниже 95 Е/мл является негативным прогностическим фактором.
При сроке беременности 33-35 недель активность каталазы в группах 1 и 2 оставалась достоверно выше, чем в группе 3 (p=0.0001 и p=0.0003), в то время как между собой эти две группы не различались.
Результаты измерения концентрации МДА в плазме крови беременных женщин исследуемых групп представлены в таблице 12.
С помощью однофакторного дисперсионного анализа было выявлено достоверное увеличение концентрации МДА в плазме крови с увеличением срока беременности у женщин группы 3 (F(2.31)=5.3411, p=0.01). При этом в двух других группах концентрация МДА не зависела от срока беременности и уже на ранних сроках гестации достигала максимальной величины, соответствующей моменту родов в группе 3, отражая состояние выраженного окислительного стресса для данной патологии (рисунок 15).
Концентрация МДА в группе II ни на одном из исследуемых сроков гестации достоверно не отличалась от данного показателя в группах 1 и 3. Концентрация МДА в плазме женщин в группе I в сроке 22-27 недель была достоверно выше по сравнению с контролем (p=0.029), а в сроке 28-32 недели наблюдали тенденцию к повышению МДА (p=0.069) до соответствующего сроку гестации уровню (см. данные для группы 3 на рисунке 15), при этом в сроке 33-35 недель достоверных различий между группами не обнаружили (рисунок 15), при этом в сроке 33-35 недель достоверных различий между группами не обнаружили.
Данные представлены в виде среднего ± ст.откл. достоверное отличие от группы III, p 0.05; # тенденция к отличию от группы III, p 0.1; 1,2,3 – сроки гестации обозначены в соответствии с таблицей 12. Таким образом, данные анализа содержания основного маркера перекисного окисления липидов в крови – малонового диальдегида и активности основного деструктора перекиси водорода – фермента каталазы, свидетельствуют о выраженном характере окислительного стресса в группе женщин с ПР на сроке гестации 22-27 недель.
Данные, полученные при анализе относительного содержания белков СОД1 и СОД2 в ткани пупочного канатика и миометрия в исследуемых группах, представлены на рисунке 16.