Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Иммуноцитотерапия при привычном выкидыше, обусловленном аллоиммунными причинами (обзор литературы)
1.1 Привычный выкидыш. Этиологические факторы 13
1.2 Аллоиммунные причины в патогенезе привычного выкидыша и поздних гестационных осложнений .14
1.3 Методы иммунотерапии в лечении привычного выкидыша 22
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1 Критерии включения и исключения пациенток в группы 30
2.2 Методы исследования 32
2.3 Специальные методы исследования .34
2.4 Статистическая обработка материала 36
2.5 Методика проведения ИЦТ 37
Глава 3. Результаты собственных исследований
3.1 Клиническая характеристика женщин исследуемых групп 41
3.2 Результаты клинико-лабораторного обследования супружеских пар с привычным выкидышем 53
3.3 Течение и исходы беременностей у пациенток исследуемых групп 55
3.4 Анализ течения родов, послеродового периода и состояния новорожденных .66
3.5 Анализ течения беременности и родоразрешений у женщин, которым в предгестационной подготовке проводили ИЦТ, как монотерапию .72
3.6 Анализ течения беременности и родоразрешений у женщин с различными видами предгестационной подготовки 77
3.7 Результаты расширенного иммунологического обследования женщин с привычным выкидышем аллоиммунного генеза 81
3.7.1 Динамика выработки антилейкоцитарных антител в течение беременности у женщин с идиопатическим привычным выкидышем на фоне иммуноцитотерапии .81
3.7.2 Иммунологические показатели периферической крови беременных с идиопатическим привычным выкидышем на фоне иммуноцитотерапии .85
3.7.3Динамика иммунологических параметров у пациенток с ПВ в течение беременности, осложненной ИЦН .93
3.7.4 Ретроспективный анализ иммунологических параметров в зависимости от исходов беременности у пациенток с ПВ 96
Глава 4.Обсуждение полученных результатов 101
Выводы 119
Практические рекомендации 121
Список сокращений 123
Список литературы 125
Приложение 147
- Аллоиммунные причины в патогенезе привычного выкидыша и поздних гестационных осложнений
- Течение и исходы беременностей у пациенток исследуемых групп
- Иммунологические показатели периферической крови беременных с идиопатическим привычным выкидышем на фоне иммуноцитотерапии
- Ретроспективный анализ иммунологических параметров в зависимости от исходов беременности у пациенток с ПВ
Введение к работе
Актуальность исследования
Привычный выкидыш (ПВ) – актуальная проблема современного акушерства, требующая проведения дальнейших исследований. Несмотря на совершенствование диагностических подходов, причинные факторы ПВ в 30,0% -40,0% случаев остаются неясными. Аллоиммунные причины ПВ связывают с нарушенной реакцией материнской иммунной системы на отцовские антигены плода, что приводит к отторжению плодного яйца и ранним потерям беременности [Г.Т. Сухих, Л.В. Ванько, 2003].
Установлено, что у 25,0% женщин с ПВ отмечается неадекватный иммунный ответ на антигены трофобласта, сопровождающийся повышением в эндометрии и децидуальной ткани провоспалительных цитокинов и эмбриотоксических факторов [N.J. Hannan et al., 2015]
Кроме того, аллоиммунные факторы могут быть причиной формирования плацентарной недостаточности, осложняющей вторую половину беременности и приводящей к элективному досрочному родоразрешению [T.A. Atia et al., 2014]
В этой связи разработка оптимальных методов предгестационной подготовки у женщин с ПВ аллоиммунного генеза является актуальной задачей.
Иммуноцитотерапия (ИЦТ) - процедура, представляющая собой
иммунизацию женщин аллогенными клетками партнера используется для лечения женщин с ПВ в течение 35 лет [В.М Сидельникова, Г.Т. Сухих, 2011]. Исследователями установлено, что ИЦТ особенно эффективна именно у супружеских пар с многократными (4 и более) потерями беременностей [S. Hayakawa et al., 2000].
Несмотря на столь долгий опыт клинического применения, отсутствует
единое мнение о влиянии ИЦТ на клеточное, гуморальное звено иммунной системы,
нет четких критериев оценки эффективности проведенных процедур
аллоиммунизации. До сих пор не существует единых рекомендаций о кратности проведения ИЦТ клетками партнера вне и во время беременности, влиянии процедур на течение гестационного процесса.
Степень разработанности темы исследования
В нашей стране первые работы в данной области принадлежат В.И. Говалло и В.М. Сидельниковой (1978). В настоящее время в Японии до 70% клиник практикуют ИЦТ в терапии супругов с ПВ, в то время как в США ИЦТ не включена
в программу лечения ПВ. Исследователями было показано, что иммуноцитотерапия наиболее эффективна у супругов с многочисленными (четырьмя и более) выкидышами [K. D. Beaman et al., 2015].
Несмотря на столь долгий опыт клинического применения, отсутствует единое мнение о влиянии ИЦТ на клеточное и гуморальное звенья иммунной системы, нет четких критериев оценки эффективности проведенных процедур аллоиммунизации. До сих пор не существует единых рекомендаций о кратности проведения ИЦТ клетками партнера.
Цель исследования:
оптимизация программы диагностики и терапии у супружеских пар с привычным выкидышем аллоиммунного генеза в динамике беременности с использованием иммуноцитотерапии.
Задачи исследования
1. Охарактеризовать клинико-анамнестические особенности супружеских пар
с привычным выкидышем аллоиммунного генеза.
2. Изучить клинические особенности течения и исходов беременности у
женщин с ПВ в зависимости от наличия предгестационной подготовки, а также от
вида предгестационной подготовки.
3. Провести проспективное наблюдение за течением беременности и
динамическое определение иммунологических параметров в течение всего
гестационного процесса в группах женщин с привычным выкидышем и при
физиологической беременности.
4. Оценить значимость иммунологических параметров для прогнозирования
осложнений и исходов беременности у женщин с привычным выкидышем
аллоиммунного генеза.
5. Разработать алгоритм лечебных мероприятий и контроля их эффективности
для предотвращения потерь беременности и поздних гестационных осложнений у
женщин с привычным выкидышем аллоиммуного генеза.
Научная новизна
В результате проведенной работы получены данные, расширяющие представление об иммунопатологических процессах, лежащих в основе привычных ранних потерь беременности аллоиммунного генеза.
На основании изучения иммунологических параметров женщин с привычным выкидышем и фертильных женщин определена патогенетическая роль факторов материнской иммунной системы в реализации механизмов защиты/отторжения плода: регуляторных клеток с фенотипом СD4+CD25highCD127low/-, субпопуляций NK-клеток, CD200+-клеток, антиотцовских антилейкоцитарных антител на клетках с фенотипом CD3+.
Динамика вышеуказанных параметров оценена в процессе физиологической беременности и в течение беременности женщин с ПВ. Сопоставлены динамические изменения иммунологических показателей в процессе лечения с и без использования ИЦТ.
Проведенное исследование дополнило понимание иммунологических изменений в течение беременности при различных методах медикаментозного и клеточного воздействия, что позволило получить новые данные, как о механизмах воздействия ИЦТ, так и об изменениях иммунологических параметров при реализации гестационных осложнений.
Анализ исходов беременностей в сопоставлении с иммунологическими
параметрами позволил оценить вклад различных регуляторных механизмов (клеток
СD4+CD25highCD127low/-, субпопуляций NK клеток, CD200+-клеток,
антиотцовских антилейкоцитарных антител на клетках с фенотипом CD3+) в реализацию успешного течения беременности, либо акушерской патологии.
Практическая значимость
На основании проведенных исследований выделены наиболее
информативные иммунологические маркеры, при помощи которых становится возможным осуществлять мониторинг эффективности проводимой терапии во время беременности.
Проведена оценка прогностической значимости определения содержания Т-регуляторных клеток, субпопуляций NK-клеток, CD200+клеток и антиотцовских антител на клетках (с фенотипом CD3+) для оптимизации терапии женщин с привычным выкидышем аллоиммунного генеза.
Предложенная программа предгестационной подготовки позволила повысить эффективность вынашивания беременностей у женщин с многократными ранними потерями, снизить частоту поздних гестационных осложнений.
Итогом работы явилась разработка алгоритма ведения беременности и контроля за эффективностью проводимых терапевтических мероприятий у супружеских пар с привычным выкидышем (см. приложение).
Методология и методы исследования
В работе использованы общеклинические методы диагностики.
Поверхностный фенотип клеток периферической крови определяли с помощью стандартного набора моноклональных антител (мАт), меченных флуоресцеин-изотиоцианатом (ФИТЦ) или фикоэритрином, против антигенов CD3, CD16, CD56, CD200 (Becton Dickinson и eBioscience, США). Оценивали содержание CD200+-клеток, NK-клеток (СD56+, СD16+), а также содержание Т регуляторных клеток. Для определения АОАТ лимфоциты супруга выделяли методом центрифугирования в градиенте фиколл-пак (плотность 1,077). АОАТ определяли методом перекрестного реагирования с помощью проточной цитометрии.
Клиническая часть работы выполнена во 2-м отделении акушерском
патологии беременности (заведующий – д.м.н. Н.К. Тетруашвили). Весь объем
иммунологических обследований проведен в лаборатории клинической
иммунологии Центра (заведующий – к.м.н. Л.В. Кречетова).
Статистическую обработку данных производили общепринятыми методами вариационной статистики. Проверку гипотезы о нормальном распределении осуществляли, используя критерий Шапиро-Уилка. Значимость наблюдаемых отклонений средних значений измеренных параметров оценивали с помощью двухвыборочного t-критерия Стьюдента с различными дисперсиями для средних значений с использованием пакета статистического анализа для Microsoft Office Excel 2007. В случае отклонения распределения от нормального представлены медиана, минимум и максимум распределения, а также среднее значение и стандартное отклонение (Mean±SD). В этом случае для оценки различий применяли U-критерий Манна-Уитни для независимых выборок. Достоверными различия считали при уровне значимости р0,05. Для оценки диагностической значимости тестов фенотипирования лимфоцитов периферической крови женщин с привычным беременности выкидышем использовали ROC-анализ пакета MedCalc12 для Windows 7.
Положения, выносимые на защиту
1. Предгестационная иммуноцитотерапия (ИЦТ) обеспечивает стойкий
иммуномодулирующий эффект в течение года после ее проведения: вне зависимости
от срока наступления беременности после окончания процедур (в течение первых 6 месяцев или в сроке от 6 до 12 месяцев), течение и исходы беременностей у женщин с привычным выкидышем достоверно не отличались.
-
Предгестационная подготовка, включающая две процедуры ИЦТ, является необходимой для супружеских пар с привычным выкидышем аллоиммунного генеза: частота преждевременных родов была достоверно ниже (11,0% по сравнению с 34,8%; р= 0,009), чем у женщин без проведения предгестационной подготовки. По иммунологическим показателям группа с проведенной предгестационной ИЦТ не отличается от группы контроля.
-
Анализ субпопуляционного состава лимфоцитов у пациенток с привычным выкидышем аллоиммунного генеза позволяет выделить следующие предикторы осложнений беременности: в сроке 5-6 недель беременности снижение содержания субпопуляции NK- клеток (CD56+, CD16+, CD56,16+ , CD3-CD56,16+) является предиктором ранних потерь беременности, а в сроке 12 недель беременности низкое содержание Т - регуляторных клеток позволяет прогнозировать преждевременные роды.
-
После проведения ИЦТ в первом триместре беременности уровень АОАТ остается одинаковым на протяжении всей беременности, как у пациенток с предгестационной подготовкой, так и без нее. Оценить эффективность иммуноцитотерапии позволяет количественное определение антиотцовских антилейкоцитарных антител: при уровне, превышающем 50%, эффект является стойким и достаточным.
Личный вклад автора Автор непосредственно участвовал в определении темы научного исследования, разработке дизайна работы. Самостоятельно сформулированы цель и задачи диссертации, проведено обследование женщин, включенных в исследование, ведение беременных в течение всего гестационного процесса. Автором проведен анализ литературных данных по выбранной теме, разработана анкета для сбора данных анамнеза, выполнен анализ клинических и лабораторных результатов обследования 445 женщин в проспективном исследовании. Автор принимал участие в заборе биологического материала, подготовке и проведении иммунологических исследований, родоразрешении пациентов. Статистическая обработка полученных данных проведены автором лично в соответствии с правилами, что обеспечивает достоверность результатов и сформулированных выводов. Написание и публикация результатов выполнены автором лично.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01 – «акушерство и гинекология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1 и 4 паспорта акушерства и гинекологии.
Апробация диссертации Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференции 2-го отделения акушерского патологии беременности совместно с лабораторией клинической иммунологии 29.08.2017 г. и на заседании апробационной комиссии ФГБУ «НМИЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (01.09.2017 г., протокол №9).
Внедрение результатов работы в практику Основные рекомендации, полученные в ходе исследования, используются во 2-м отделении акушерском патологии беременности ФГБУ «НМИЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России при обследовании и лечении супружеских пар с привычным выкидышем.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 13 научных трудов, в т.ч. 11 статей в рецензируемых научных изданиях. Материалы диссертации доложены на Форуме «Мать и Дитя» и V, VI и VII Конференциях «Невынашивание беременности: социальная проблема, медицинские решения» в 2015, 2016, 2017 годах.
Структура работы
Аллоиммунные причины в патогенезе привычного выкидыша и поздних гестационных осложнений
Несмотря на совершенствование диагностических подходов, причинные факторы ПВ в 30,0–40,0% случаев остаются неясными. В тех зарубежных клиниках, где иммунологическое исследование не введено в алгоритм обследования супружеских пар, процент идиопатического ПВ достигает 60,0–70,0%. По данным ряда исследователей, до 80,0% ПВ неясного генеза обусловлено нераспознанными иммунологическими нарушениями. Возможно, аллоиммунные нарушения связаны с «неадекватным» распознаванием антигенов отцовского происхождения материнской иммунной системой, что может приводить к последующему отторжению плодного яйца и ранним потерям беременности.
Отцовские антигены распознаются материнской иммунной системой до зачатия, то есть до оплодотворения уже есть предпосылки к формированию иммунологической толерантности, которая в дальнейшем способствует вынашиванию нормальной беременности. В связи с крайне ранними сроками потерь большинства беременностей при ПВ аллоиммунного генеза, иммунокорригирующая терапия, должна начинаться до момента наступления беременности. Иммунокоррекция направлена модулировать неадекватное распознавание иммунной системой матери отцовских антигенов. Отсутствие своевременно проведенной диагностики, и назначение лечебных мероприятий, только во время беременности, зачастую оказывается нерезультативным и приводит к повторяющимся ранним гестационным потерям [4-10].
Многие исследования показали, что у женщин с ПВ в 25% случаев отмечается несбалансированная иммунная реакция на антигены трофобласта, которая провоцирует увеличение в эндометрии и децидуальной ткани провоспалительных цитокинов и эмбриотоксических факторов [11,12].
Неправильная реакция иммунной системы матери на антигены плода является одним из ключевых механизмов нарушения процессов имплантации и плацентации [6]. Также, аллоиммунные факторы могут являться пусковым механизмом в реализации плацентарной недостаточности, синдрома задержки роста плода, преэклампсии, осложняющих течение второго и третьего триместров беременности и приводящие к досрочному родоразрешению.
К известным аллоиммунным факторам, приводящим к привычному выкидышу, относятся: наличие у супружеских пар трех и более идентичных антигенов системы HLA (гистосовместимость родителей); уменьшение продукции аллоантител к отцовским антигенам; увеличение содержания цитотоксических клеток в децидуальной ткани, эндометрии и в периферической крови женщины [4,13-17].
В течение долгого времени совместимость супругов по системе HLA и ее роль в репродукции вызывает интерес у врачей иммунологов и акушеров-гинекологов. Есть данные о роли HLA – совместимости в патогенезе развития преэклампсии, синдрома задержки развития плода, приводящих к ранним преждевременным родам [4,18]. Компонентом аллоиммунных нарушений также является измененная продукция аллоантител к отцовским антигенам (антигенам плода отцовского происхождения). Данные антитела считаются блокирующими антителами, поскольку во время беременности взаимодействуют с антигенами фетоплацентарных тканей и препятствуют распознаванию материнскими лимфоцитами антигенов фетоплацентарных тканей. Полагают также, что блокирующие антитела являются антиидиотипическими антителами, направленными против антиген - специфических участков (идиотипов) других антител [4,13-15]. Снижение блокирующих свойств женской сыворотки некоторые авторы ассоциируют с совместимостью по антигенам системы HLA [19,20].
В 70-е годы XX века исследователи доказали наличие иммунорегуляторных компонентов, выделенных из семенной жидкости. Было установлено, что существует иммуномодулирующий эффект, связанный с воздействием цитокинов G-CSF (гранулоцитарно колониестимулирующий фактор), G-MCSF (гранулоцитарно макрофагальный колониестимулирующий фактор), TGF-P (трансформирующего фактора роста-Р), IL-6 (интерлейкин 6), IL-8 (интерлейкин 8), VEGF (фактор роста сосудистого эндотелия), простагландинов (в частности, Е2) [21]. Есть данные, что присутствие в семенной плазме TGF-b1 (трансформирующего фактора роста-Р-1), IL-8, фактора, ингибирующего лейкемию (LIF), IL-1 и IL-6 влияет на успех имплантации. В частности, путем изменения активности клеток иммунной системы беременной, формируется преобладание в децидуальной ткани цитокинов профиля Т хелперов 2 типа (Th-2). [4,19,20].
Естественные киллеры - NK-клетки в иммунных механизмах реализации привычного выкидыша занимают особое место. Маркеры естественных киллерных клеток - CD56 (молекула адгезии) и CD 16 (рецептор для Fc-фрагмента молекулы Ig). На этих клетках также имеются рецепторы, которые способны распознавать молекулы FILA I класса и которые задействованы в процессах активации или ингибирования киллерных клеток [4,14,22,23,24].
По результатам исследований, во время беременности уровни NK-клеток, как в крови, так и в децидуальной ткани значительно отличаются по количеству и уровню цитотоксичности, спектру и количеству выделяемых цитокинов. Существенное различие отмечено в содержании NK-клеток в эндометрии, а также в их спектре и цитотоксичности в зависимости от анамнестических данных женщины: в норме и при привычном выкидыше [25, 26,27].
Особое место в репродукции среди иммунных клеток, занимают Т-лимфоциты с различной функцией. Цитотоксические Т-лимфоциты несут маркер CD8, отвечающий за связывание с молекулами HLA II класса. После контакта с антигеном периферические Т-лимфоциты образуют, как минимум, две различные субпопуляции - Th-1 и Th-2, которые формируют цитокиновый профиль, определяющий ход иммунного ответа. Полагают, что при неосложненной беременности происходит супрессия материнских NK-клеток и Т-лимфоцитов [4,28-31].
Большой интерес вызывают исследования функции СD200 (которая признана толерогенной молекулой) в участии формирования иммунного ответа женщины на антигены партнера, способствующего успешной имплантации и вынашиванию беременности. СD200, как известно, экспрессируется и на клетках трофобласта, дендритных клетках, лимфоцитах. На экспериментальных животных было доказано, что блокада СD200 вызывает прерывание беременности [14]. При взаимодействии CD200 с рецепторами как дендритных клеток, так и NK-клеток, происходит индукция секреции индоламиндиоксигеназы, что посредством продукции TGF "Р стимулирует генерацию Т-регуляторных клеток и, соответственно, формирование периферической толерантности [32-34]. С количеством СВ200-позитивных клеток среди лимфоцитов, которые вводили женщинам с ПВ, ассоциируют положительный эффект ИЦТ: у женщин, беременность которых закончилась родами, число CD200-позитивных клеток среди введенных лимфоцитов было существенно выше, чем у женщин, беременность которых закончилась выкидышем [14].
Исследование иммунологических механизмов, лежащих в основе реализации поздних гестационных осложнений – еще одна актуальная задача современного акушерства. Известно, что неполноценная инвазия трофобласта и формирующаяся в дальнейшем плацентарная недостаточность являются факторами, приводящими к ранней преэклампсии, задержке роста плода, элективному досрочному родоразрешению, неблагоприятным перинатальным исходам. С другой стороны, терапевтические мероприятия, направленные на формирование полноценной инвазии трофобласта, возможно, способны предотвратить поздние гестационные осложнения. Данное утверждение является в известной мере дискуссионным, так как нет единого мнения об эффективности терапии, в частности ИЦТ до 12 недель, в аспекте предотвращения осложнений третьего триместра беременности.
Оценка состояния клеток иммунной системы во втором и третьем триместрах беременности в ассоциации с клиническим течением гестационного процесса и исходами беременности представляет научный и практический интерес.
Ранняя преэклампсия, характеризующаяся дебютом до 32 недель в виде повышения артериального давления, протеинурии, отеков и часто сопровождающаяся задержкой роста плода, наблюдается у беременных в 3-5% случаев и является частой причиной материнской смертности в развитых странах. Ключевым патогенетическим механизмом преэклампсии является нарушенная инвазия маточно – плацентарных артерий вневорсинчатым трофобластом. Редуцированная инвазия трофобласта ассоциируется с избыточным количеством макрофагов вокруг них. Клетки вневорсинчатого трофобласта после экспозиции с экзогенным ФНО- увеличивали степень апоптоза при культивировании с активированными макрофагами [35].
Течение и исходы беременностей у пациенток исследуемых групп
Все женщины основной и контрольной групп наблюдались и родоразрешались в НМИЦ АГиП. Проведен анализ осложнений и исходов наблюдаемых беременностей.
В 70,8% (68) случаях у пациенток основной группы беременность осложнилась угрожающим/начавшимся выкидышем, подтвержденным клиническими признаками и данными ультразвукового исследования, 39 женщинам (40,6%) потребовалось стационарное лечение.
Клиническими признаками угрозы выкидыша являлись боли внизу живота тянущего характера и кровянистые выделения из половых путей.
При обращениях с жалобами на кровянистые выделения, проводилось ультразвуковое исследование, в результате чего выявлена ретрохориальная гематома в 33,3% (32) случаев и ретроамниотическая гематома в 7 случаях (7,3%). У остальных 22,0 % (28) беременных жалоб на тянущие боли внизу живота и кровянистые выделения из половых путей в течение I триместра беременности не регистрировалось.
Осложнения у пациенток контрольной группы в I триместре беременности отмечались следующие: ОРВИ с субфебрильной температурой тела – 2,4 %, умеренная рвота беременных – 11,9 % и анемия беременных – 4,8%. Признаков угрожающего/начавшегося выкидыша в виде скудных кровянистых выделений, болей внизу живота и в пояснице отмечено не было.
У пациенток основной группы, которые не получали предгестационную подготовку, угроза выкидыша наблюдалась в 100% случаев. Пациентки данной группы были госпитализированы во 2-е отделение патологии беременности, где была проведена терапия направленная на пролонгировнаие беременности. Осложнения беременности I триместра обеих групп представлены в таблице 16.
Госпитализация пациенток в стационар произведена во всех случаях угрожающего/начавшегося выкидыша, проводилась сохраняющая терапия, включающая прием гормональных, гемостатических, спазмолитических препаратов.
Однако, несмотря на проводимую сохраняющую терапию, прерывания беременностей в сроке до 12 недель отмечено у 15 (15,6%) пациенток основной группы. Прерывание в сроках от 12 до 22 недель гестации отмечены у 2 (2,1%) пациенток основной группы.
Осложнением беременности после 12 недель у беременных с привычным невынашиванием была угроза позднего выкидыша, которая встречалась в 29 (30,2%) наблюдениях (таблица 17), при этом была назначена сохраняющаяя терапия (гемостатическая, спазмолитическая), после чего клинические признаки угрозы прерывания беременности регрессировали.
Также во II триместре следующим по частоте осложнений беременности определена истмико-цервикальная недостаточность, потребовавшая хирургической коррекции у 38 (39,6%) пациенток с привычным невынашиванием, и у 3 (7,1%) пациенток группы контроля.
Угроза ранних преждевременных родов в сроке 23-28 недель наблюдалась у 26 (27,1%) беременных основной группы, проводилась терапия, направленная на пролонгирование беременности (магнезиальная, токолитическая, спазмолитическая).
Течение беременности во втором триместре протекало с более частыми осложнениями в группе женщин без предгестационной подготовки (таблица 18), хирургическая коррекция ИЦН, угроза позднего выкидыша и ранних преждевременных родов в данной группе наблюдалась у большинства женщин.
Исходы наблюдаемых беременностей у женщин основной и контрольной групп
Проведен анализ исходов беременностей у женщин исследуемых групп, установлено 15 самопроизвольных потерь беременностей (все женщины из основной группы), в подавляющем большинстве случаев (15,6%) по типу неразвивающихся беременностей. Проведено инструментальное удаление неразвивающегося плодного яйца с дальнейшим кариотипированием абортуса.
Прерывание беременности по медицинским показаниям наблюдалось в двух случаях, в виду множественных пороков развития плода.
В двух случаях (2,1%) у женщин основной группы (ИЦТ), отмечены потери в 16-17 недель гестации. В 2 клинических наблюдениях произошло излитие околоплодных вод, в одном случае оно сопровождалось клиническими признаками хориоамнионита, кариотипирование провести не удалось.
Сроки самопроизвольного прерывания беременности и результаты кариотипирования абортусов представлены в таблице 19.
Иммунологические показатели периферической крови беременных с идиопатическим привычным выкидышем на фоне иммуноцитотерапии
Были исследованы показатели иммунного статуса периферической крови женщин изучаемых групп в течении беременности, результаты представлены на рисунках 2-6.
На рисунке 2 представлено содержание в периферической крови Трег и СО200+-клеток в различные сроки беременности.
Как следует из данных на рисунке 2, содержание Трег в 8-9 недель беременности в обеих группах с ПВ было значимо ниже, чем в контроле.
В 12 недель беременности содержание Трег значимо ниже было только в крови беременных без предгестационной аллоиммунизации (группы БПП). Однако, в сроках 37-38 недель (последнее обследование проведено перед родами) в группе БПП содержание Трег оказалось значимо выше, чем в контроле и чем в группе, прошедших предгестационную подготовку (группа СПП).
С 12 недель беременности уровни Трег в группе с предгестационной подготовкой и в контрольной не различались в течение всего дальнейшего периода наблюдения.
Содержание CD200+-клеток в сроке 5-6 недель (до проведения ИЦТ в I триместре) в группе с предгестационной подготовкой было значимо выше, чем в группах без предгестационной подготовки и контрольной, а в 8 86 недель – значимо выше, чем в контроле. После первой процедуры аллоиммунизации исчезли различия в содержании CD200+-клеток в группах с и без предгестационной подготовки.
В сроках 25 и 30 недель беременности содержание CD200+-клеток в группе без предгестационной подготовки было значимо ниже, чем в контроле и в группе с предгестационной подготовкой. Различий в содержании CD200+-клеток в эти сроки, как и в другие сроки, в контрольной группе пациенток и в группе с предгестационной подготовкой не выявлено.
Во все сроки обследования не обнаружено различий между обследованными группами в содержании NKT-клеток с фенотипом CD3+CD16+ (рисунок 3). Содержание NKT-клеток с фенотипом CD3+CD56,16+ было выше в группе с предгестационной подготовкой, чем в контроле, только в сроке 8 -9 недель беременности, при этом было одинаковым с содержанием этой субпопуляции в группе без предгестационной подготовки. Далее в течение беременности различий между группами по данному показателю не выявлено (рисунок 3).
Содержание субпопуляций NK-клеток различных фенотипов в течение беременности у пациенток с ПВ представлено на рисунках 3-6. Не обнаружено различий в содержании NK-клеток с фенотипом CD3CD56,16+ между группами в разные сроки обследования. Содержание общей популяции NK-клеток с фенотипом CD56,16+ в группе без предгестационной подготовки было значимо выше, чем в группе с предгестационной подготовкой в сроке 34 недели гестации (рисунок 4).
Содержание NK-клеток с фенотипом CD16+ в группе без предгестационной подготовки в 8-9 недель гестации было значимо выше, чем в контроле, а содержание NK-клеток с фенотипом CD3"CD16+ в этой группе в сроке 20 недель гестации было значимо ниже, чем в группах с предгестационной подготовкой и контрольной (рисунок 5).
Содержание NK-клеток с фенотипом CD56+ в сроки 5 - 6 и 8 - 9 недель беременности в группе с предгестационной подготовкой было ниже, чем в группе без подготовки и в контроле, в 12, 16 и 20 недель беременности различия между группами не выявлялись, а в 25 и 34 недели содержание субпопуляции CD56+ в группе без предгестационной подготовки было выше, чем в контроле (рисунок 6).
Резюмируя результаты исследования субпопуляционного состава периферической крови беременных с привычным выкидышем, получавших терапию в предгестационной подготовке с включением процедуры аллоиммунизации, и пациенток без предгестационной аллоиммунизации, можно отметить, что, начиная со срока 12 недель гестации, то есть через 3-4 недели после второй процедуры ИЦТ в I триместре, различий в содержании исследованных субпопуляций в группе с предгестационной подготовкой и контрольной не выявлено. Наибольшее число отклонений в исследованных иммунологических показателях во II и III триместре беременности выявлено в группе пациенток не прошедших предгестационную подготовку. К примеру, в группе без предгестационной подготовки на сроке 37-38 недель беременности выявлено высокое содержание Трег-клеток (в группе БПП 10,4±0,7 в контроле 7,3±0,4, р=0,014, в группе СПП 7,8±0,7, р=0,017).
В сроках 25 и 30 недель беременности содержание CD200+-клеток было ниже, чем в контроле и в группе с предгестационной подготовкой (25 недель: в группе БПП 4,8±0,8, в контроле 8,0±0,4, р=0,0004, в группе СПП 8,6±0,3, р=0,002; 30 недель: в группе БПП 4,9±0,3, в контроле 6,6±0,5, р=0,010, в группе СПП 8,0±1,2, р=0,015).
В группе без предгестационной подготовки содержание NK-клеток с фенотипом CD56,16+ в сроке 34 недели было выше, чем в группе с предгестационной подготовкой (соответственно, 15,1±1,0 и 10,7±1,3, р=0,05), с фенотипом CD56+-клеток в сроках 25 и 34 недели было выше, чем в контроле (25 недель: соответственно, 18,3±2,0 и 13,8±1,8, р=0,048; 34 недели: соответственно, 17,7±1,8 и 12,9±1,6, р=0,041), а с фенотипом CD3-CD16+ в сроке 20 недель гестации было ниже, чем в группах с предгестационной подготовкой и контрольной (в группе БПП 3,4±1,3, в контроле 12,2±1,6, р=0,0004, в группе СПП 11,1±2,0, р=0,002).
Можно сделать вывод, что поскольку различий в субпопуляционном составе лимфоцитов пациенток с привычным выкидышем из группы с предгестационной подготовкой и женщин контрольной группы в период с 12 недель гестации, в отличие от пациенток с привычным выкидышем без предгестационной подготовки, не обнаружено, можно предположить, что для «нормализации» состояния иммунной системы пациенток с ПВ двух процедур аллоиммунизации в I триместре недостаточно, и предгестационная аллоиммунизация является необходимой процедурой в подготовке пациенток с ПВ к беременности.
Ретроспективный анализ иммунологических параметров в зависимости от исходов беременности у пациенток с ПВ
По исходам настоящей беременности были выделены 2 подгруппы пациенток ПВ: с осложнениями ранних сроков беременности (подгруппа 1, n=17) и с осложнениями поздних сроков беременности (подгруппа 2, n=16).
В подгруппе 1 у 15 пациенток выкидыш состоялся до 11 недель беременности и у 2 пациенток – в сроке с 12 до 16 недель беременности.
В подгруппе 2 – у одной пациентки в сроке 28-29 недель развилась тяжелая преэклампсия, потребовавшая досрочного родоразрешения. В связи с прогрессированием плацентарной недостаточности, ухудшением состояния плода проведено родоразрешение в сроке 29-30 недель беременности. В связи с преждевременным излитием околоплодных вод при дихориальной диамниотической двойне в двух случаях проведено кесарево сечение в сроках 35-36 недель, также при преждевременном излитием околоплодных вод в двух случаях проведено кесарево сечение в связи с конизацией шейки матки. В одном случае родоразрешение проведено в виду начала родовой деятельности и угрозы разрыва матки по рубцу. В сроке 33-34 недели в одном случае произошла антенатальная гибель плода. У 4-х пациенток было проведено экстренное кесарево сечение в связи с нарастающей гипоксией плода в сроке 35-36 недель. В остальных случаях развилась регулярная родовая деятельность в 34-36 недель беременности.
На рисунке 9 отражены результаты ретроспективного анализа исследованных иммунологических показателей в 5-6 недель (до аллоиммунизации в I триместре) в первой подгруппе с целью выявления предикторов ранних потерь беременности.
Показано, что у пациенток с выкидышем содержание субпопуляций NK-клеток было значимо ниже, чем у женщин с физиологически протекающей беременностью. Для показателей, значимо отличающихся от контрольных значений, проведена оценка диагностической значимости тестов, представленная в таблице 41.
Как следует из проведенной оценки, специфичность определения исследованных субпопуляций NK-клеток одинакова (100%). Это означает, что при снижении содержания указанных показателей ниже критериальных значений будут выявляться все пациентки с угрозой потери беременности в I триместре, поскольку специфичность теста – вероятность того, что тест будет отрицательным, если пациент здоров.
Чувствительность тестов высокая, но максимальной чувствительностью обладает тест определения содержания субпопуляции CD3-CD56,16+ (91,7%). Величина данного параметра означает, что примерно у 8,3% пациенток с ПВ потери беременности в I триместре может не быть.
На рисунке 10 отражены результаты ретроспективного анализа исследованных иммунологических показателей в 12 недель беременности (через 3-4 недели после 2-кратной аллоиммунизации лимфоцитами партнеров в I триместре) во второй подгруппе с целью выявления предикторов поздних осложнений беременности, которые могут потребовать досрочного элективного родоразрешения.
Как следует из данных, представленных на рисунке 10, различия обнаружены только в содержании Трег клеток, которые в подгруппе с преждевременным родоразрешением оказались ниже, чем в контроле (6,0±0,5 и 8,0±0,5 соответственно, р=0,010). Проведенный расчет диагностической значимости определения Трег для прогноза развития беременности показал, что при содержании в периферической крови пациенток с ПВ Трег 7,5% в 12 недель беременности после проведенной аллоиммунизации в I триместре с чувствительностью 100% и специфичностью 61,5% можно прогнозировать развитие осложнений беременности, которые могут потребовать досрочного родоразрешения. Это означает, что у всех женщин с осложнениями, приводящими к досрочному родоразрешению, содержание Трег в периферической крови будет ниже 7,5%, но примерно у 38,5% беременных с ПВ с содержанием Трег ниже порогового значения такого исхода беременности можно не ожидать.
Таким образом, обобщая полученные данные, можно утверждать, что у женщин с неблагоприятными исходами первой половины беременности содержание субпопуляций NK-клеток было значимо ниже, а у женщин с преждевременным досрочным родоразрешением уровни Трег клеток достоверно отличались от контрольной группы в ранние сроки беременности. Данные иммунологические маркеры могут быть предикторами развития акушерской патологии - ранних потерь беременности и досрочного родоразрешения. Дальнейшие исследования в данной области позволят определить роль субпопуляций NK-клеток и Т-регуляторных клеток в предикции различных акушерских осложнений.