Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Современные представления о патогенезе преждевременной отслойки плаценты 12
1.1.1. Факторы, ассоциированные с нарушением формирования и созревания плаценты 13
1.1.2. Маркеры патологии плаценты в клинической практике 17
1.1.3. Теории возникновения преждевременной отслойки плаценты 23
1.2. Факторы риска преждевременной отслойки плаценты 37
1.3. Инструментально-лабораторные предикторы преждевременной отслойки плаценты 42
Глава 2. Материал и методы исследования 48
2.1. Материал исследования 48
2.2. Методы исследования 54
Глава 3. Клинико-анамнестические предикторы развития преждевременной отслойки плаценты 61
3.1. Характеристика экстрагенитального и репродуктивного анамнеза женщин с преждевременной отслойкой плаценты 61
3.2. Структура генетически-обусловленных тромбофилий у женщин с преждевременной отслойкой плаценты 69
Глава 4. Морфологические и иммунологические характеристики плацент при преждевременной отслойке 78
4.1 Морфологическое описание плацент 79
4.3 Иммуногистохимическое исследование плацент 86
Глава 5. Прогностическая оценка особенностей течения гестационного периода у женщин с преждевременной отслойкой плаценты 92
Обсуждение полученных результатов 126
Выводы 140
Практические рекомендации 142
Список сокращений 143
Список литературы
- Факторы, ассоциированные с нарушением формирования и созревания плаценты
- Методы исследования
- Структура генетически-обусловленных тромбофилий у женщин с преждевременной отслойкой плаценты
- Иммуногистохимическое исследование плацент
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Значительный прогресс в перинатальной медицине в течение последних
десятилетий повлиял на снижение перинатальной смертности и заболеваемости
(Зайнуллина М.С. Пути снижения материнской и перинатальной смертности при нарушении системы гемостаза // Медицинский Академический журнал. - 2013. - Т. 13, №1.
- С. 73-82; Савельева Г.М. Материнская смертность и пути её снижения // - 2009. - - С.11-14). Однако материнские осложнения, влияющие на
перинатальные исходы, а именно маточные кровотечения во время беременности и в
родах, являются актуальными, встречаются до 10% и обсуждаются различными авторами
(Бикмуллина Д.Р. //
- 2010. - - С.46-51; Букатина С.В. Возможности исследования регуляторных
аутоантител для прогнозирования акушерских кровотечений // - 2011. - Т. 92, - С.224-227; Курцер М.А. Значение перевязки внутренних
подвздошных артерий в лечении массивных акушерских кровотечений // - 2008. - - С.18-22; Жаркин Н.А. Кровотечения в акушерской практике //
- 2013. - Т. 47,
- С.3-8). Кровотечения, связанные с преждевременной отслойкой плаценты, в
популяции достигают 3%, а по данным Областного перинатального центра г.
Екатеринбурга регистрируются от 10,5 до 14,7 на 1000 родов (Жилин А.В.
Органосохраняющая тактика при аномалиях плацентации // Репродуктивный потенциал
России: «Здоровье женщины — здоровье нации»: тез. докл. III Общероссийский научно-
образовательный семинар. – Казань, 2013). Прогноз для плода при развитии
преждевременной отслойки плаценты крайне неблагоприятный. Возникающая острая
гипоксия является определяющей в неонатальной смертности и заболеваемости.
Заболеваемость может иметь долгосрочные неблагоприятные последствия для здоровья
детей. Формирование инвалидности с детства приводит к тому, что эта проблема
выходит за рамки медико-биологической и приобретает социальное значение
(Сидельникова В.М. Профилактика и лечение угрожающих преждевременных родов //
Акушерство и гинекология. - 2008. - № 3. - С. 43-47).
При написании работы был привлечен достаточно широкий круг отечественных и зарубежных источников. Вклад в изучение проблемы внесли не только акушеры-гинекологи, но и патологоанатомы. Проработка различных аспектов понимания этой проблемы позволяет полагать, что необычайно выражена многофакторность патогенеза преждевременной отслойки плаценты. В то же время нельзя не отметить, что единого представления о причинах и механизмах ее развития нет.
Максимально обсуждаемой темой последних лет стала взаимосвязь генетически-обусловленных тромбофилий и преждевременной отслойки плаценты. Наибольший интерес, с точки зрения степени разработки изучаемой проблемы, представляют работы следующих исследователей: Зайнуллиной М.С., Макацария Н.А., Самбуровой Н.В., Степановой А.А., Панфиловой О.Ю., J. Brenner, Rodger М.А., Silver R.M. Интерес к данному аспекту связан с тем, что существует ряд работ, доказывающих семейную предрасположенность к преждевременной отслойке плаценты (Heiskanen N. Obstetric prognosis in sisters of preeclamptic women // BMC Womens Health. - 2003. - Vol. 3, №1. - Р. 1-5; Rasmussen S. Occurrence of placental abruption in relatives // An International Journal of Obstetrics & Gynaecology. - 2009. – Vol. 116, №5. - P. 693-699). Было установлено, что женщины с анамнезом преждевременной отслойки плаценты имеют 7-20-кратный риск отслойки при последующих беременностях, поэтому они должны относиться к группе высоко риска (Krupitzki H.B. Environmental risk factors and perinatal outcomes in preterm
newborns, according to family recurrence of prematurity // American Journal of Perinatology. -2013. - Vol. 30, № 6. - Р. 451– 461).
По данным отечественных авторов, распространение генетически-обусловленных тромбофилий у женщин с преждевременной отслойкой плаценты в анамнезе достоверно выше, чем у женщин, не имеющих этого осложнения (Бицадзе В.О. Тромбофилия как важнейшее звено патогенеза осложнений беременности // - 2012. - Т. 60, С. 22-29; Зарудская О.М. Роль наследственной тромбофилии в генезе осложненного течения беременности // - 2013. - - С.4-7; Зайнуллина М.С. Маркеры дисфункции эндотелия и тромбофилии в диагностике преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты // Журнал акушерства и женских болезней. - 2005.- Т. 54, № 2. - С. 11-16; Макацария Н.А. Мутация фактора V Лейден и преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты у матери и дочери при одноплодной и многоплодной беременности // Материалы I международного конгресса по перинатальной медицине и VI ежегодного конгресса специалистов перинатальной медицины. Москва, 2011. - С.110). Однако мета-анализ, проведенный зарубежными учеными, не выявил значимой взаимосвязи между любым видом тромбофилии и отслойкой плаценты (Ananth C.V. Reduced folate carrier 80A/G polymorphism, plasma folate, and risk of placental abruption // Human Genetics. - 2008. Vol. 124, № 2. - P. 137-145; Oyelese Y. Placental abruption // Obstetrics and Gynecology. - 2006.-Vol. 10, № 4. - P. 1005-1016). Хотя генетические исследования в настоящее время ведутся очень активно, выводы о связи наследственных тромбофилий и отслойки плаценты еще преждевременны и непоследовательны.
Ряд авторов поддерживает теорию о том, что преждевременная отслойка плаценты является результатом воспалительной реакции, которая прогрессирует вследствие несостоятельности механизмов местного иммунитета. Основанием для развития данной теории послужили результаты гистологического исследования плацент. Большая работа в этом направлении проведена такими авторами, как: Д.К. Нажмутдинова, Л.П. Перетятко, C.V. Ananth, H. Furukawa, Sh. Suzuki.
Некоторые исследователи выделяют доминирующую роль нарушения
ремоделирования спиральных артерий в возникновении преждевременной отслойки плаценты: Б.И. Глуховец, А.П. Милованов, В.Е. Радзинский, M. Brosens, J. Dommisse, M. Williams. Отдельный интерес представляет теория А.Г. Савицкого, выделившего «гипотонический» и «гипертонический» варианты развития преждевременной отслойки плаценты, которые укладываются в теорию патологии маточных сосудов.
Проблемам ассоциации между преждевременной отслойкой плаценты и нарушением иммунных взаимодействий матери и плода посвящены труды авторов: Е.Н. Шаховской, Н.А. Якимовой, A.S. Cerdeira, M.J. Kupferminc, L.H. Mortensen, A. Steinborn, M. Tikkanen [14].
Все работы в значительной мере способствуют расширению знаний о патогенезе и
возможных предикторах преждевременной отслойки плаценты. Однако в значительной
части они представляют собой кросс секционные исследования, демонстрирующие
расстройство механизмов регуляции в пределах одного, двух факторов. Поэтому для
более взаимосвязанного и неразрывного представления о данной патологии
представляется важным рассмотреть одномоментно с позиции нарушения работы различных систем органов в совокупности с учетом особенностей формирования системы мать-плацента-плод на ранних этапах гестации.
Кроме того, в разных исследованиях использованы различные критерии
включения в основную группу по срокам реализации преждевременной отслойки плаценты. Учитывая, что в 2012 г. Министерством здравоохранения и социального развития Российской Федерации издан приказ №1687н от 27 декабря 2011 года «О медицинских критериях рождения, форме документа о рождении и порядке ее выдачи» о
критериях живорождения, рекомендованных ВОЗ, становится актуальным рассмотрение
проблемы преждевременной отслойки плаценты с 22 недель гестации. В работах же
вышеуказанных авторов преобладают исследования пациенток на доношенном сроке,
хотя сверхранние и ранние преждевременные роды – это гораздо больший риск
мертворождений и инвалидности детей. Проблема преждевременных родов является не только медицинской, но и социальной проблемой, так как рождение недоношенного ребенка, его болезнь и смерть являются серьезной психологической травмой.
Комплексный анализ демонстрирует, что накопленный материал о
преждевременной отслойке плаценты нельзя считать исчерпывающим. Таким образом, существует обширное научное поле рассмотрения теоретического и практического содержания данной проблемы.
Цель исследования
Разработать прогностические критерии преждевременной отслойки плаценты на основе анализа клинико-анамнестических факторов, изменений иммунологических, коагулологических констант и оценки патологии плацент.
Задачи исследования
-
Провести многофакторный анализ соматической, акушерско-гинекологической патологии и носительства мутаций генов гемостаза у пациенток с преждевременной отслойкой плаценты.
-
Оценить гистологические и иммуногистохимические характеристики плацент у женщин с преждевременной отслойкой плаценты и выделить специфические маркеры, являющиеся предикторами данной патологии.
3. Изучить особенности течения беременности у женщин с преждевременной
отслойкой плаценты.
4. Определить изменения показателей прогестерона, иммунного статуса и системы
гемостаза в сыворотке крови пациенток с преждевременной отслойкой плаценты.
5. Разработать прогностическое правило развития преждевременной отслойки
плаценты.
Методология и методы исследования
В работе использована общенаучная методология, основанная на системном
подходе с применением формально-логических, общенаучных и специфических методов.
Для проведения настоящего исследования использовался комплексный подход,
включающий эпидемиологические, клинические, инструментальные, молекулярно-генетические, иммунологические, морфологические, статистические методы.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Достоверность и надежность результатов исследования обеспечивались
посредством реализации методологических и научных принципов с соблюдением
нормативов теоретического и эмпирического исследования. В работе использованы адекватные целям и задачам методы и методики сбора данных. Основой для выводов послужили результаты математико-статистической обработки данных, выполненных с помощью компьютерных программ G*Power 3.1.6., Statgraphics Centurion и демо-версии MedCalc. В частности для сравнительного анализа параметрических данных применены критерии Стьюдента, для непараметрических данных Манна-Уитни. Для трех групп использовалась поправка Бонферрони. При сравнении бинарных показателей использовался критерий хи-квадрат (x). Для определения прогностического значения диагностического теста строились ROC-кривые (Receiver Operating Characteristic) с последующим определением чувствительности и специфичности в точке разделения. Корреляционный анализ использовался для определения наличия взаимосвязи между двумя признаками в группе, а также для определения силы связей между признаками в
группах, т.е. осуществлялся межгрупповой корреляционный анализ. Для построения прогностических моделей и определения качественных и количественных предикторов, имеющих наибольшее влияние на прогноз преждевременной отслойки плаценты, использовался метод логистической регрессии и дискриминационного анализа.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены в рамках: II Уральского медицинского Форума «Здоровая семья – Здоровая Россия», Екатеринбург 2013; III Уральского медицинского Форума «Здоровая семья – Здоровая Россия», Екатеринбург, 2014; II Евразийского конгресса «Медицина, фармация и общественное здоровье» с международным участием, Екатеринбург, 2015; на заседании проблемной комиссии и Ученого Совета, Екатеринбург, 2016.
Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах
диссертационного исследования. Основная идея, планирование научной работы, включая
формулировку научной гипотезы, определение методологии и общей концепции
диссертационного исследования проводились совместно с научным руководителем д.м.н.,
профессором Зильбер М.Ю. Цель и задачи сформулированы совместно с научным
руководителем. Дизайн исследования разработан лично диссертантом. Анализ
современной отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме проведен лично диссертантом. Автор лично проводил все клинические исследования, собирал весь необходимый фактический материал. В едином целом автор представил клинические, лабораторные, инструментальные методы диагностики. Интерпретация полученных данных осуществлялась совместно с научным руководителем. Статистическая обработка первичных данных, интерпретация и анализ полученных результатов, написание и оформление рукописи диссертации, представление результатов работы в научных публикациях и в виде докладов на конференциях осуществлялись диссертантом лично.
Положения, выносимые на защиту
1.Факторами риска преждевременной отслойки плаценты у беременных являются: инфекции урогенитального тракта, хроническая венозная недостаточность, артериальная гипертензия, хронический эндометрит, носительство более трех мутаций генов гемостаза, бесплодие, рубец на матке и гиперандрогения.
2.Преждевременная отслойка плаценты реализуется при сочетании
морфологических признаков: гипо- и аваскуляризация ворсин плаценты, незавершенная
гестационная перестройка спиральных артерий, усиление компенсаторно-
приспособительных процессов с разнонаправленными профилями иммуннокомпетентных клеток.
3.Преждевременная отслойка плаценты обусловлена изменением уровня
прогестерона, нарастанием провоспалительной фракции цитокинов и гиперкоагуляцией.
4.Разработанный прогностический алгоритм преждевременной отслойки плаценты позволяет учесть реализацию данного осложнения по срокам гестации.
Научная новизна
Впервые выявлено неодинаковое влияние различных факторов на сроки
реализации преждевременной отслойки плаценты. В результате проведенного
исследования сформированы классификационные модели, позволяющие прогнозировать
риск возникновения преждевременной отслойки плаценты в различные периоды
гестации: 22-27 недель, 28-36 недель, 37-41 неделя.
Впервые анализ гистологических изменений плацент после преждевременной
отслойки проводился с использованием балльной оценки показателей, что дало
возможность оценить степень интенсивности патологических процессов в плаценте.
Макроскопическое и микроскопическое исследование материала позволило сформировать
представление о данной патологии как о длительно текущем патологическом процессе,
морфологическую основу которого представляет плацентарная недостаточность,
возникшая в результате неполной гестационной перестройки спиральных артерий и
являющаяся причиной компенсаторно-приспособительных и инволютивно-
дистрофических изменений в плаценте, независимо от сроков реализации
преждевременной отслойки плаценты.
Впервые проведена иммунногистохимическая оценка плацент после
преждевременной отслойки в сроки гестации 22-41 неделя с определением экспрессии
кластеров дифференцировки CD20+, CD56+, CD8+, CD4+, что выявило различные
провокационные иммунные факторы в этиологии и патогенезе преждевременной
отслойки плаценты в зависимости от срока ее реализации. На основе сопоставления
параметров морфологического и иммунногистохимического материала последов,
пациенток с преждевременной отслойкой плаценты и клинико-лабораторных данных
проспективного когортного исследования установлено синергическое влияние
дисфункции иммунологической системы, коагуляционной системы и патологии эндометрия в возникновении преждевременной отслойки плаценты.
Теоретическая и практическая значимость работы
На основе данных, полученных в результате проведенного исследования, расширены представления о факторах риска возникновения преждевременной отслойки плаценты и ее предикторах, что дополняет понимание патогенеза данного осложнения беременности. Внедрение в практику разработанного прогностического правила позволяет выявлять группу риска по развитию преждевременной отслойки плаценты в сроки гестации 22-41 неделя. Раннее выявление таких пациенток способствует предупреждению неблагоприятных перинатальных исходов, так как обнаруженные предикторы развития преждевременной отслойки плаценты дают возможность оптимизировать комплекс мероприятий по ее профилактике. Результаты выполненной работы доступны и осуществимы в повседневной практической деятельности врачей акушеров-гинекологов.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования внедрены в практику гинекологического отделения и женской консультации МАУ ЦГКБ №24 (г. Екатеринбург), в работу лечебно-диагностического центра ООО «Медгород» (г. Москва). Теоретические положения и выводы диссертации используются в учебном процессе кафедры акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО УГМУ, г.Екатеринбург.
Публикации
Соискатель имеет 17 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 14 научных работ общим объемом 2,3 печатных листа, в том числе 6 публикаций в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертации, 6 публикаций в материалах всероссийских и региональных конференций, 1 статья в журнале, зарегистрированном в базе РИНЦ и 1 статья в научном журнале.
Объем и структура диссертационной работы
Факторы, ассоциированные с нарушением формирования и созревания плаценты
Важным этапом для формирования плаценты является полноценная децидуализация и имплантация плодного яйца. Децидуализация включает в себя секреторную трансформацию маточных желез, ремоделирование сосудов и приток специализированных иммунокомпетентных клеток в эндометрий [2, 6, 123]. Главным клеточным компонентом в децидуальной ткани являются стромальные и иммунные клетки (NK-клетки, макрофаги, Т-клетки и В-клетки) [187]. Децидуализированные стромальные клетки приобретают уникальную способность регулировать вторжение трофобласта, противостоять воспалительным и окислительным провокациям, и ослаблять материнские иммунные реакции [214]. Процесс изменений, происходящих в эндометрии в доимплантационную фазу, зависит от уровня прогестерона и рецептивности эндометрия [61, 130]. При снижении рецептивности эндометрия возникают множественные морфофункциональные изменения, нарушающие циклическую биотрансформацию слизистой оболочки матки, причиной которых может являться повреждения эндометрия инфекционным агентом, манипуляции и операции, связанные с травмой базального слоя эндометрия [53, 281]. Недостаточность синтеза прогестерона яичниками может быть в результате функциональных и органических причин: синдром гиперторможения яичников, синдром поликистозных яичников, заболевания щитовидной железы (гипо- и гипертиреоз), заболевания гипофиза (гипофизарный гипогонадизм, гиперпролактинемия), воспалительные заболевания придатков, кисты и кистомы яичников [58, 121]. В процессе имплантации продолжаются изменения в архитектонике и строении спиральных артерий, начавшиеся в предимплантационном периоде [31]. На 7-й день беременности при имплантации зародыша в стадии бластоцисты они постепенно выпрямляются, и некоторые артерии достигают поверхности эндометрия. Образуются надсосудистые эпителиальные островки. Имплантация плодного яйца происходит в зоне этих островков с находящимися под ними спиралевидными артериями. В период нидации параллельно с децидуализацией слизистой оболочки матки артерии начинают древовидно разрастаться и достигают плодного яйца [76, 78]. Это сложный, многоступенчатый процесс регулируется при помощи большого количества гуморальных факторов и разнообразных межмолекулярных и межклеточных взаимодействий и опосредуется некоторыми протеиназами, разрушающими внеклеточный матрикс: сериновые протеазы, металлопротеиназы, катепсины, урокиназный и тканевой активаторы плазминогена [79, 100]. Ряд исследований доказывает, что наряду с регуляцией фибринолиза, PAI-1 участвует в протеолитическом каскаде, вовлеченном в физиологические и патологические процессы инвазии и ремоделирования тканей. Чрезмерно высокий уровень PAI-1 связывают со снижением глубины инвазии трофобласта и нарушением имплантации [60, 107].
Существуют исследования, которые приводят к заключению, что не только децидуальная ткань и уровень стероидов в крови может осуществлять протеолитический и иммунологический контроль над инвазией бластоцисты, но и человеческая бластоциста может влиять на этот процесс. Так молекулы HLA-G, экспрессируемые на клетках трофобласта, соединяясь с различными рецепторами, регулируют активность клеток иммунной системы матери.
Снижение эксперессии локуса HLA-G клетками плаценты может приводить к иммуннологическому дисбалансу и нарушать процесс имплантации [70, 101, 200, 203]. Период плацентации начинается с формирования первичных ворсин хориона. Основные этапы формирования плаценты заканчиваются к 70м суткам гестации. С 8 по 13й день внутриутробного развития осуществляется формирование первичных ворсин хориона, к 14-19 дню формируются вторичные (мезенхимальные) ворсины. Питание зародыша в этот короткий отрезок времени осуществляется за счет лизированных тканей эндометрия – гистиотрофно. С 3-ей недели внутриутробного развития часть мезенхимных клеток стромы вторичных ворсин дифференцируется в клеточные элементы стенок кровеносных капилляров (аутохтонный ангиогенез). На 3й неделе пролиферирующий трофобластический эпителий быстро внедряется в эндометриальные капилляры, и материнская кровь свободно изливается в просвет лакун. Тип питания сменяется на гематотрофный. На сроке 17-19 дней происходит проникновение трофобласта до уровня спиральных сегментов эндометриальных артерий с их разрушением и вскрытием устанавливается маточно-плацентарное кровообращение. Ворсины превращаются в третичные к 21-му дню развития. Данный период отличается большим объемом деструктивных процессов в маточных железах. Этот период характеризуется как первая волна инвазии цитотрофобласта (6-8 недели). Дальнейшее развитие плаценты обусловлено формированием межворсинчатого пространства. В сроке 13-14 недель децидуальная пластинка включает много спиральных артерий с полной гестационной перестройкой. В хорошо развитой крупной ворсине к 13 неделе гестации содержится 10—15 сосудов. Мелкие терминальные ворсины содержат только капилляры (4—6), имеющие в незрелой плаценте преимущественно центральное расположение [28, 91, 75, 78].
Методы исследования
Используемые методы обследования включали: клинические, лабораторные, инструментальные. Все женщины были обследованы в первом во втором и третьем триместре согласно приказу Министерства здравоохранения Российской Федерации от «01» ноября 2012 г. № 572н «Порядок оказания медицинской помощи по профилю Акушерство и гинекология». Используемые методы включали: клинические, лабораторные, инструментальные. Для определения размеров плода, уточнения срока беременности, оценки состояния фетоплацентарного комплекса используется ультразвуковая диагностика при помощи аппарата "Aloka SSD - 630", «Aloka SSD – 680 с использованием конвексного датчика с частотой 3,5 Мгц”. Структура и степень зрелости плаценты оценивалась в соответствии с классификацией Grannum P.A. и др., 1979 года. Толщину плаценты измеряли в средней ее части, объем околоплодных вод определяли в зависимости от величины вертикального кармана. Дополнительный спектр обследования беременных женщин 1. Обследование женщин на носительство мутаций генов системы гемостаза: мутация в гене фибриногена бета, мутация в гене коагуляционного фактора II, мутация в гене активатора плазминогена, мутация в генах фолатного цикла (MTHFR 677, MTGFR 1298), мутация Лейдена. Обследование проводилось на базе Муниципального бюджетного учреждения Екатеринбургский консультативно-диагностический центр (Главный врач В.А. Серебренников). Исследование осуществлялось на автоматическом детектирующем амплификаторе ДТ-96 компании «ДНК-технологии» (Россия) методом ПЦР в реальном времени. 2. Обследование женщин в 21-22 недели беременности и 27-28 недель беременности: содержание у беременных фактора некроза опухоли - альфа, интерлейкина-10, трансформирующего фактора роста – бета, прогестерона.
Обследование проводилось в МАУ ЦГКБ № 24 (Главный врач И.А.Мокшина). Исследование осуществлялось на автоматическом иммунохимическом анализаторе IMMULITE 2000 XPi (Siemens Healthcare Diagnostics, США – Германия) методом хемилюминесценции. Для исследования использовали наборы реагентов для иммуноферментного определения концентрации фактора некроза опухолей-альфа в биологических жидкостях человека и культуральных средах Вектор Бест A-8756 альфа-ФНО. Диапазон измерения 0-250 пг/мл. Чувствительность набора - 2 пг/мл. Для определения концентрации интерлейкина-10 использовались наборы реагентов для иммуноферментного анализа Вектор Бест A-8774 ИЛ-10 Чувствительность: 1 пг/мл. Диапазон измерений: 0-500 пг/мл. Набор реагентов для количественного определения трансформирующего фактора роста – бета (BMS249) имел диапазон измерения 9 2000 пг/мл, чувствительность 9 пг/мл. ТФР определялся наборами Bio-Rad Laboratories. Диапазон измерения: 9-2000 пг/мл. Чувствительность: 9 пг/мл. Набор реагентов для иммуноферментного определения концентрации прогестерона в сыворотке крови Вектор Бест D-3978 Чувствительность: 0,4 нмоль/л. 3. В сроке гестации 21-22 недели и 27-28 недель всем пациенткам проводилось исследование состояние системы гемостаза, которое оценивалось по следующим показателям: количество тромбоцитов, МНО, АЧТВ, фибриноген, РФМК, D-димер, антитромбин III, протеин С. Обследование проводилось в МАУ ЦГКБ № 24 (Главный врач И.А.Мокшина). Исследование осуществлялось на автоматическом коагулометре CA-1500 с принадлежностями - Sysmex Corporation (Япония) клоттинговым и хромогенным методами. 4. Микробиологическое исследование отделяемого женских половых органов на аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы и чувствительность к антибиотикам. Полимеразная цепная реакция Chlamidia trachomatis. Обследование на бактериально-вирусную инфекцию методом ПЦР и система “Фемофлор”, как количественный метод для выявления условно патогенной флоры и инфекций, передаваемых половым путем, с определением чувствительности к антибиотикам. Также использовалась серодиагностика с определением в крови антител TORH - комплекса классов IgG и IgM. Обследование проводилось в лабораториях в составе Компании KDL (Главный врач М.И. Заворотнов). Исследование проводилось на автоматическом детектирующем амплификаторе ДТ-384 компании «ДНК-технологии» (Россия) методом ПЦР в реальном времени (набор реагентов «Фемофлор»).
Для исследования был произведен забор периферической венозной крови в объеме 5 мл закрытой вакуумной системой, построенной из 3 компонентов: вакуумная пробирка, крышка, иглодержатель.
Каждый добровольное согласие на участие в исследовании. Морфологическое исследование включало макро- и микроскопическую оценку состояния плаценты. Плаценты от матерей с установленными диагнозом преждевременной отслойки сразу после родов подвергались макроскопической оценке. Для более точного макроскопического описания плаценты были проведены параллельные разрезы через каждые 2 см. через всю толщу плаценты. Для микроскопического патоморфологического исследования брали 6 кусочков: из центральных зон плаценты через всю толщу, из периферических зон с прилегающими оболочками, а также из участка, непосредственно отслоившегося во время беременности, в том числе со стороны хориальной пластины и со стороны базальной пластины. Размер вырезанных кусочков составлял 1,5-2 см2. Затем раз перед проведением процедуры все пациентки подписывали информированное помещались в 10% раствор формалина на сутки.
Структура генетически-обусловленных тромбофилий у женщин с преждевременной отслойкой плаценты
Доминирующими являлись мутация гена MTHFR С677Т 47,8% (57/117) vs 44% (22/50), мутация гена MTHFR С1298Т 50,5% (59/117) vs 38% (19/50) и полиморфизм гена PAI-1 59,8% (70/117) vs 38% (19/50).
Полученные нами данные о роли наследственных тромбофилий согласуются с данными некоторых исследователей [144, 154, 165]. Однако большинство отечественных ученых указывают на более весомый вклад со стороны генетически-обусловленных повреждений в системе гемостаза [16, 45, 64, 74]. В связи с этим нами было определено количество женщин с одной мутацией – в основной группе таких женщин не было, vs 32% (16/50) в группе контроля, с двумя мутациями – 31,6% (37/117) женщин, vs 26% (13/50) соответственно в исследуемых группах р=0,16, с тремя мутациями и более – 68,4% (80/117) в основной группе, тогда как в группе контроля таких женщин было 42% (21/50) р=0,035. Итак, в основной группе достоверно чаще встречалось сочетание генетически обусловленных мутаций в системе гемостаза в количестве 3 и более.
Для определения степени зависимости достоверно преобладающих клинико-анамнестических факторов и изменений в генах системы гемостаза и цикла обмена фолатов с преждевременной отслойкой плаценты были определены коэффициенты детерминации (таблица 9).
Мы видим наибольшую степень зависимости преждевременной отслойки плаценты с инфекциями урогенитального тракта, в том числе хроническим эндометритом, ХВН, артериальной гипертензией, носительством мутаций генов системы гемостаза, бесплодием и рубцом на матке. В отличие от сведений литературных источников мы не получили статистически достоверной связи преждевременной отслойки плаценты с курением, привычным невынашиванием и фактом преждевременной отслойки плаценты в анамнезе. Тогда как в нашем исследовании определяется положительна связь гиперандрогении с данным осложнением беременности.
С целью выявить тенденции, определяющие реализацию преждевременной отслойки плаценты в различные сроки гестации, нами была произведена стратификация основной группы на три подгруппы. Первая подгруппа (n=21) – женщины с диагнозом преждевременной отслойки плаценты в сроке 22-27 неделя гестации. Вторая подгруппа (n=32) - женщины с диагнозом преждевременная отслойка плаценты в сроке 27-36 недель гестации. Третья подгруппа (n=64) - женщины с диагнозом преждевременная отслойка плаценты в сроке 37-41 неделя гестации. В данных подгруппах нами были рассмотрены статистически достоверные позиции представляющие факторы риска отслойки плаценты. Корреляция особенностей акушерско-гинекологического анамнеза с различными сроками гестации представлена в таблице 10. Доброкачественные образования яичников 0,0014 (р=0,32) 0,0037 (р=0,14) 0,087 (р=0,74) Полученные результаты демонстрируют неодинаковое влияние факторов на сроки реализации преждевременной отслойки плаценты. Среди пациенток с отслойкой плаценты в 22-27 недель преобладает хронический эндометрит, вторичное бесплодие, привычное невынашивание, гиперандрогения и пороки развития матки. У женщин с отслойкой плаценты в 28-36 недель чаще встречается носительство мутаций генов гемостаза, артериальная гипертензия, рубец на матке и первичное бесплодие. Для беременных с отслойкой плаценты в доношенном сроке более характерно наличие хронической венозной недостаточности.
Итогом проведения ретроспективного исследования является формирование классификационной модели, позволяющей прогнозировать развитие преждевременной отслойки плаценты на основе данных анамнеза пациентов. Для построения классификационной модели исходная выборка была разделена на обучающую и контрольную группы. В обучающую группу, используемую для построения классификационной модели, были включены 35 пациенток без преждевременной отслойки плаценты и 98 пациенток с наступившей преждевременной отслойкой плаценты.
Для проверки практической применимости классификационной модели была сформирована контрольная группа включившая 15 пациенток без ПОП и 19 пациентов с наступившей ПОП. Классификационная модель, выражается следующей формулой (1): F = exp(eta)/(1+exp(eta)) (1) Где: exp - число Эйлера (= 2.7182818284590452...) eta = 252,9268 - 37,0678 х Х1 - 33,6488 х Х2 - 55.0206 х Х3 – 45,0206 х Х4 98,3303 х Х5 – 91,2707 х Х6 - 24,4365 х Х7 - 53,8659 х Х8 x1 – артериальная гипертензия, x2 – хронический эндометрит, x3 – рубец на матке, x4 – гиперандрогения, x5 – хроническая венозная недостаточность, х6 – инфекции урогенитального тракта, х7 – бесплодие, х8 – более трех мутаций системы гемостаза. Для построенной модели выбран порог отсечения = 0,45, при котором обеспечивается максимальный процент правильно классифицированных наблюдений, использовавшихся для построения модели (91,45%). Для прогнозирования наличия кровотечения необходимо подставить значения признаков в классификационную функцию. Если полученное значение функции превышает порог отсечения 0,45, то прогнозируется наличие кровотечения, если значение функции не превышает порог отсечения, то прогнозируется отсутствие кровотечения. Модель показала следующие характеристики качества классификации: чувствительность – 87%, специфичность - 69%. Резюме Полученные результаты не противоречат данным отечественных и зарубежных исследователей. Выявленные прогностически-значимые клинико анамнестические факторы укладываются в рамки лидирующих теорий возникновения преждевременной отслойки плаценты. Так согласно полученным данным, одним из условий для развития патологических состояний предшествующих преждевременной отслойке плаценты в большинстве случаев является носительство мутаций фолатного цикла и в генах гемостаза, достоверно преобладающим из которых явилась мутация гена ингибитора активатора плазминогена-1. Вследствие мутаций в генах фолатного цикла нарушается метаболический путь превращения гомоцистеина и его содержание в плазме крови увеличивается. Гипергомоцистеинемия приводит к повреждению эндотелия сосудов, что способствует повышенному тромбообразованию [36, 177]. Роль мутации гена ингибитора активатора плазминогена-1 определяется дисбалансом маточно– плацентарного фибринолитического контроля. Кроме того, мутация гена PAI–1 играет важную роль в снижении степени инвазии трофобласта на ранних сроках беременности [60, 65].
Иммуногистохимическое исследование плацент
Фундамент для начальных сдвигов в гомеостазе и ослаблению резистентности к внешним воздействиям создает сочетанное влияние экстрагенитальной патологии и отягощенного акушерско-гинекологического анамнеза. В связи с чем, первым этапом работы являлся многофакторный анализ соматической, акушерско-гинекологической патологии и носительства мутаций генов гемостаза у пациенток с преждевременной отслойкой плаценты.
В результате выявлена наиболее диагностически–значимая группа факторов, формирующая преморбидный фон пациенток с последующей преждевременной отслойкой плаценты. К ним относятся: инфекции урогенитального тракта (R=0,68), хроническая венозная недостаточность (R=0,61), рубец на матке (R=0,57), артериальная гипертензия (R=0,54), хронический эндометрит(R=0,54), носительство более трех мутаций генов гемостаза (R=0,54), бесплодие (R=0,53) и гиперандрогения (R=0,51). Полученные результаты согласуются с данными отечественных и зарубежных ученых. Однако коэффициент детерминации для гиперандрогении у пациенток, беременность которых осложнилась преждевременной отслойкой плаценты выше, чем в других ассоциативных исследованиях, посвященных данной проблеме. В доступной изучению литературе сведения о влиянии андрогенов на особенности течения поздних сроков беременности единичны, тогда как, по данным Радзинского В.Е, формирующиеся патологические изменения маточно-плацентарной области в условиях эндокринопатий, диагностируются лишь во II-III триместрах, когда становится декомпенсированными, а лечение не эффективным [163]. Синдром гиперандрогении представляет собой достаточно обширную группу эндокринных заболеваний, которые возникают в силу весьма разнообразных патогенетических механизмов, но объединенных отдаленными гормонально-метаболическими последствиями, ведущими к множественным дефектам в регуляции углеводного, жирового, пуринового и других видов обмена веществ [34, 137]. В связи с этим полученные результаты патогенетически обоснованы и представляют научный интерес.
Итогом проведения ретроспективного исследования является формирование классификационной модели, позволяющей прогнозировать развитие преждевременной отслойки плаценты на основе данных анамнеза пациентов. Для внедрения полученного результата в рутинную работу акушера-гинеколога амбулаторного звена был создан программный продукт, примененный в отношении 4504 пациенток. Согласно полученным результатам по совокупности анамнестических данных 11,3% (509/4504) женщин представляют собой группу риска по развитию преждевременной отслойки плаценты, из которых в 19,2% (98/509) произошла преждевременная отслойка плаценты, что значительно превышает популяционный уровень. Компьютерная программа на основе данных анамнеза пациенток позволила прогнозировать развитие преждевременной отслойки плаценты на этапе прегравидарной подготовки или при постановке женщин на учет по беременности, что доказывает практическую применимость прогностического правила. При анализе соматического, генеративного анамнеза женщин и их тромбофилического статуса было отмечено, что различные факторы оказывают неодинаковое влияние на сроки реализации преждевременной отслойки плаценты во время беременности. Учитывая выявленные особенности, в дальнейшем исследование выполнялось с определением подгрупп, по периодам гестации, в которые произошла отслойка плаценты.
У женщин с преждевременной отслойкой плаценты в 22-27 недель анамнез достоверно чаще отягощен хроническим эндометритом (r=73), хроническими инфекциями нижнего отдела урогенитального тракта (r=0,61), вторичным бесплодием (r=0,57), привычным невынашиванием (r=0,29), гиперандрогенией (r=15). Также у этой группы пациенток чаще наблюдались пороки развития матки (r=0,23). Комплексная оценка особенностей течения беременности данных пациенток устанавливает, что период гестации преимущественно осложнялся вагинитом и цервицитом (r=0,42) и сопровождался развитием угрожающего выкидыша (r=0,39) с формированием ретроплацентарной гематомы (r=0,41) в сроки беременности до 22 недель. Ультразвуковыми маркерами нарастающего неблагополучия течения беременности явились маловодие (r=0,41) и сниженная толщина плаценты (r=0,42). Принимая во внимание полученные ассоциации, можно предположить о превалирующей роли инфекционного фактора в патогенезе отслойки плаценты в сроки гестации 22-27 недель. Действительно, по данным ряда исследователей, у женщин, имеющих в анамнезе привычное невынашивание или преждевременные роды бактериально вирусная персистенция регистрируется в 60-86,7% случаев. Хронические воспалительные процессы у этих пациенток (хронический эндометрит и хронические инфекции нижнего отдела урогенитального тракта) могут служить источником гематогенного инфицирования [25, 122]. Так согласно полученным результатам при микроскопическом исследовании плацент после отслойки в 22 27 недель, мы видим высокую степень лейкоцитарной (1,7±0,08 баллов, vs 0,26±0,04 в группе сравнения) и лимфоцитарной инфильтрации (2,3±0,06 балла, vs 1,1±0,08 в группах соответственно) базальной оболочки (базальный децидуит) и ворсин плаценты (интервиллузит), что соответствует определенной последовательности патологических процессов при гематогенном инфицировании [28]. Острые формы урогенитальной инфекции у беременных, как правило, осложняются восходящим инфицированием [127, 272]. Это удостоверено преобладающим числом хорионамнионита у данной группы пациенток (66,6%, vs 22,2% на доношенном сроке, тогда как в других подгруппах он не регистрировался). Следовательно, у беременных с отслойкой плаценты в 22-27 недель имеют место различные пути инфицирования последа. Ответом на действие инфекционного раздражителя является альтеративный процесс, приводящий к структурным изменениям в последе, развиваются реакции в микроциркуляторном русле с формированием экссудативной формы воспалительной реакции, нарастает гипоксия [23, 153]. Развивающиеся патологические процессы приводят к десквамационно-дистрофическим изменениям плаценты, что подтверждено уменьшением массы (155±16,3, vs 180±13, 5 в группе сравнения) и толщины плаценты (1,3±0,17, vs 2,1±0,21 в группе сравнения) у этих пациенток. Верификацией активации иммунопатологических процессов на локальном уровне является динамика клеточных параметров в плацентах после преждевременной отслойки в 22-27 недель. Мы видим повышение экспрессии CD20+ и CD56+ наряду с сохранением нормального соотношения CD4+/CD8+, что свидетельствует о тимуснезависимом иммунологическом ответе. То есть можно предположить об активации иммунной реакции в ответ на бактериальную инфекцию. Усиление клеточных функций связано с синтезом медиаторов воспаления и группы провоспалительных цитокинов. Повышенная концентрация ФНО-альфа (29,5 пг/мл, vs 18,1 пг/мл и 22,6 пг/мл в группе женщин с ПОП в 27-36 недель и 37-41 неделя соответственно) на ряду с повышением противоспалительных цитокинов ИЛ-10 (27,6 пг/мл, vs 24,2 пг/мл и 24,9 пг/мл во второй и третьей подгруппах соответственно) и ТФР бета (83,1 пг/мл, 60,9 пг/мл и 71,8 пг/мл в группах соответственно) свидетельствует о провоспалительном статусе этих пациенток. Кроме того, достоверно низкий уровень протеина С при отсутствии изменений других показателей коагуляционного гемостаза и фибринолитической системы также может являться маркером активно развивающегося воспалительного процесса [24].