Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Современные представления о процессе имплантации эмбриона и маркерах рецептивностиэндометрия (обзор литературы) 10
1.1. Перспективы повышения эффективности программы ЭКО 10
1.2. Процесс имплантации эмбриона 122
1.3. Регуляция процессов имплантации 166
1.4. Использование гормональных лекарственных средств и их влияние на рецептивность эндометрия в программе ЭКО 22
1.5. Методы оценки рецептивности эндометрия в циклах ЭКО 28
ГЛАВА 2 Материал и методы исследования 32
2.1. Характеристика клинических групп 32
2.2. Методы обследования
2.2.1. Общеклинические методы исследования 41
2.2.2. Лабораторные и инструментальные методы исследования 42
2.2.3. Морфологическое исследование функционального слоя эндометрия 45
2.2.4. Иммуногистохимическое исследование эндометрия 46
2.3. Статистическая обработка данных 47
ГЛАВА 3 Результаты собственных исследований 48
3.1. Клиническо-анамнестическая характеристика пациенток 48
3.2. Результаты оценки морфофункционального состояния и имплантационного потенциала эндометрия пациенток
3.2.1. Морфологическая характеристика эндометрия 53
3.2.2. Иммуногистохимическое исследование LIF, LIF-R и эзрина в эндометрии
3.2.3. Исследование концентрации LIF и LIF-R в цервикальной слизи 66
3.2.4. Исследование концентрации LIF и LIF-R в цервикальной слизи в зависимости от используемого препарата прогестерона
3.2.5. Исследование концентрации LIF и LIF-R в цервикальной слизи в программе ЭКО в зависимости от протокола стимуляции суперовуляции 75
3.2.6. Ультразвуковое исследование органов малого таза 78
3.2.7. Оценка параметров овариального резерва 82
3.2.8. Оценка параметров фолликуло-, оо-, эмбриогенеза 82
3.3. Результаты оценки рецептивности эндометрия в зависимости от выраженности ответа яичников на стимуляции суперовуляции 83
3.4. Оценка функционального состояния эндометрия в зависимости от ведения посттрансферного периода 84
3.5. Исходы программы ЭКО 86
ГЛАВА 4 Обсуждение полученных результатов 93
Вывыды 105
Практические рекомендации 107
Список сокращений 108
Список литературы
- Регуляция процессов имплантации
- Морфологическое исследование функционального слоя эндометрия
- Результаты оценки морфофункционального состояния и имплантационного потенциала эндометрия пациенток
- Исследование концентрации LIF и LIF-R в цервикальной слизи в программе ЭКО в зависимости от протокола стимуляции суперовуляции
Регуляция процессов имплантации
Имплантация эмбриона — прикрепление и инвазия человеческого эмбриона в материнский эндометрий — сложный, многоступенчатый процесс.
Для успешной имплантации созревание эндометрия, в том числе образование пиноподий и готовность эмбриона, должны быть точно синхронизированы во времени и в пространстве [47].
В настоящее время известно, что имплантации предшествует множество процессов, развивающихся в эндометрии в секреторной фазе цикла. В связи с этими представлениями изменение эндометрия в ходе имплантации делится на три фазы [102, 124].
В I фазу эндометрий находится под влиянием эстрогенов и прогестерона и характеризуется изменениями в покровных и железистых эпителиальных клетках. результатом чего является подготовка к аппозиции и адгезии бластоцисты. Гормональные эффекты при этом зависят от присутствия ядерных рецепторов к стероидным гормонам. Нарастание концентрации рецепторов наблюдается в направлении от функционального слоя к базальному, что коррелирует с установлением максимальной рецептивности матки, необходимой для имплантации [13, 52]. Функциональный слой эндометрия высокочувствителен к половым стероидным гормонам, его превращения осуществляются на протяжении нескольких последовательных стадий соответственно яичниковому циклу [15, 64, 103, 174]. Эстрогены одновременно с пролиферацией клеток эпителия стимулируют в течение фазы пролиферации развитие секреторного аппарата клетки и синтез рецепторов к эстрогенам и прогестерону, подготавливая эндометрий для дальнейшей полноценной функции в фазе секреции [161].
Для II фазы характерна модуляция гормональных стероидных эффектов эмбриональными факторами. Начало секреции бластоцистой хорионического гонадотропина (ХГ) и других белков ранней беременности вызывает дополнительные изменения в клетках эндометрия. Железистый эпителий отвечает на действие эмбриональных регуляторных факторов модификацией главного секреторного продукта — гликоделина, обладающего иммунным протекторным эффектом в отношении наступающей беременности [89, 132].
В III фазу происходит инвазия трофобласта, и перестройка стромального компонента эндометрия, гладкомышечных клеток и эндотелия кровеносных сосудов. В этой фазе заканчивается трансформация фибробластов в децидуальные клетки, которые начинают экспрессировать весь комплекс ростовых факторов, свойственных ранней беременности [4, 39, 43].
Морфологическим маркером рецептивности эндометрия являются
пиноподии эпителиальных клеток эндометрия [143] — особые выпячивания мембраны на апикальных полюсах клеток поверхностного эпителия, образующиеся под действием прогестерона [14].
Известно, что оплодотворенная яйцеклетка попадает в полость матки на стадии морулы на 4-й день после овуляции, на 5-й день морула развивается в бластоцисты [113]. Эндометрий восприимчив к имплантирующийся бластоцисты только в пределах строго ограниченного во времени «окна имплантации» [5]. У человека начало этого периода приходится на 5–7-й день после овуляции (оплодотворения) [113] и ограничивается появлением в эндометрии трансмембранного гликопротеина муцина (Мuс 1) [74]. Во время фаз аппозиции и адгезии на наружной мембране бластоцисты образуются многочисленные микровыпячивания, в результате чего она входит в тесный контакт с эпителием эндометрия. Электроотрицательный заряд на поверхности эпителиальных клеток способствует сближению бластоцисты с поверхностью эндометрия. Последующая стадия инвазии трофобласта завершает процесс имплантации и характеризуется глубоким проникновением бластоцисты в эндометрий. Синцитиотрофобласт эмбриона вторгается между эпителиальными клетками и прорастает в сторону базального слоя погрузившейся в толщу эндометрия бластоцистой, происходит полное смыкание покровного эпителия [5, 48].
Основными регуляторами морфологических изменений функционального слоя эндометрия в течение менструального цикла и в периимплантационном периоде считаются синтезируемые в яичниках стероиды. Только подготовленный циклическим стероидным воздействием эндометрий готов к приему бластоцисты и восприятию ее гуморальных сигналов [76, 94, 133].
Считается, что в отличие от эффектов прогестерона эстрогены влияют на имплантацию опосредованно [147]. Е2 выступает в качестве пермиссивного агента, тогда как прямым действием обладают локальные, регулируемые им факторы — цитокины, молекулы адгезии, факторы роста [112, 164, 168, 176].
Установлено, что для полноценной пролиферации эндометрия в течение фолликулярной фазы нормального менструального цикла необходима концентрация Е2 в маточном кровотоке в пределах 200–400 нг/мл при одновременном содержании прогестерона не более 4 нг/мл [78, 180]. Нормальная имплантация возможна при концентрации Е2 50–100 пг/мл в сыворотке крови. Таким образом, не всегда уровень Е2 в периферической крови может быть прогностическим фактором в отношении успеха имплантации [130].
Есть мнение, что решающую роль в имплантации играет не столько абсолютное содержание стероидных гормонов, действующих на ткани-мишени органов репродуктивной системы, и морфологическая структура эндометрия, сколько его рецептивность, т.е. количество функционально полноценных рецепторов ткани эндометрия к соответствующим стероидным гормонам [16, 20]. Эстрогеновые, прогестероновые и глюкокортикостероидные рецепторы могут конкурировать за одни и те же общие транскрипционные факторы [37].
Факторы роста и цитокины представлены несколькими семействами пептидов и белков, которые вовлечены в паракринную, интракринную и аутокринную регуляцию клеточных реакций за счет связывания со специфическими рецепторами клеточной поверхности [23, 33]. В разные фазы менструального цикла экспрессируются семейства различных факторов роста, для которых показана выраженная циклическая зависимость, свидетельствующая о том, что они опосредуют влияние эстрогена и прогестерона в эндометрии [5, 24].
Морфологическое исследование функционального слоя эндометрия
Забор цервикальной слизи производили на ЛГ+3, ЛГ+5, ЛГ+7, ЛГ+9, при помощи урогенитального велюр-зонда фирмы Copan (Италия) после предварительного очищения влагалищной части шейки матки сухим стерильным ватным тампоном. Определение концентрации LIF и LIF-R в образцах ЦС проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием тест-систем фирмы Bender Medsystems (США) в лаборатории клинической иммунологии ФГБУ «НЦ АГиП им. акад. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России (руководитель лаборатории — академик РАМН, профессор Г.Т. Сухих). Учет результатов осуществляли на планшетном спектрофотометре Expertplus, ASYSHITECH.
Биопсию эндометрия проводили из области дна матки под ультразвуковым контролем на 6–8-й день после овуляции с помощью аспирационной кюретки Pipellede Cornier (Laboratoire C.C.D., Франция). Материалы биоптатов фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине в течение 24 часов. После обработки образцов по стандартной общепринятой методике их заключали в парафин. Срезы толщиной 4 мкм готовили на роторных микротомах и окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование гистологических препаратов проводили в световом микроскопе при увеличении 50 и 400. Гистологические заключения формулировали в лаборатории патоморфологии ФГБУ «НЦ АГиП им. акад. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России (руководитель лаборатории — доктор медицинских наук, профессор Е.А. Коган) в соответствии с современными стандартами, изложенными в общепринятых фундаментальных руководствах (Кондриков, 2008; Mazur, 2005; Kurman, 2011). Также проводили оценку процента клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий в световом микроскопе при увеличении 400 в пяти полях зрения.
ИГХ проводили в 1-м патологоанатомическом отделении ФГБУ «НЦАГ и П им. акад. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России (руководитель — доктор медицинских наук, профессор Е.А. Коган) на депарафинированных срезах толщиной 3–4 мкм, покрытых APES-слоем. Для визуализации реакций применяли универсальный пероксидазный набор LSAB+kit (DAKO, США).
Для выявления экспрессии LIF и LIF-R использовали первичные антитела к LIF (моноклональные мышиные антитела, 1:100, clone: 9824, R&D Systems) и LIF-R (поликлональные кроличьи антитела, 1:100, Abcam). Для выявления экспрессии эзрина использовали антитела к эзрину (поликлональные кроличьи антитела, 1:100, Cell Signaling Technology).
Результаты иммуногистохимической реакции оценивали
полуколичественным методом в баллах по общепринятой методике: отсутствие иммуноокрашенных клеток (–) — 0 баллов; менее 5% иммуноокрашенных клеток (±) — 0,5 балла; менее 20% иммуноокрашенных клеток (+) — 2 балла; от 20 до 40% окрашенных клеток (++) — 4 балла; более 40% окрашенных клеток (+++) — 6 баллов. 2.3. Статистическая обработка данных
Статистическая обработка данных выполнена на персональном компьютере с помощью программ Microsoft Excel и Statistica for Windows v.7.0, Stat Soft Inc. (США). Нами была сформирована база данных, содержащая сведения об анамнезе пациенток, клинические, лабораторные, инструментальные исследования. Для количественных показателей были рассчитаны средние значения (М), стандартное отклонение (), 95%-ный доверительный интервал, медиана (Me), интерквартильный размах (Q1-Q3), для качественных показателей — частоты (%). Количественные данные проверялись на нормальное распределение с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Для проверки гипотезы о равенстве средних в выборках использовали метод дисперсионного анализа ANOVA (для нескольких групп) и t-критерий Стьюдента для двух независимых выборок, а для небольших выборок использовали методы Краскела -Уоллиса (для нескольких групп) или критерия Манна — Уитни (для двух групп).
Качественные показатели оценивались с помощью метода 2 с поправкой Йетса на непрерывность и точный критерий Фишера для малых выборок.
Критерием значимости статистических различий принимали 95%-ный уровень значимости (р 0,05).
Нами была произведена оценка зависимостей между изучаемыми показателями с помощью корреляционного анализа. Для этого вычисляли коэффициент корреляции Пирсона (r) или Спирмена (R) и последующим установлением его значимости по критерию t. Показатель корреляции менее 0,3 считали незначимым; если коэффициент был равен 0,3–0,7 — корреляционная связь считалась умеренной; от 0,7 и выше — сильной [19].
Результаты оценки морфофункционального состояния и имплантационного потенциала эндометрия пациенток
Концентрация LIF-R в ЦС у женщин в основной группе была также достоверно ниже, чем в контрольной, на 5-й (113,0±37,4 и 156,0±18,7 пг/мл, р 0,05), 7-й (174,2±42,4 и 210,0±6,7 пг/мл, р 0,05) и на 9-й (52,0±10,6 и 98,1±25,3 пг/мл, р 0,05) день после пика ЛГ. На 3-й день после пика ЛГ в основной группе концентрация LIF-R была ниже, чем в контрольной, но различия оказались недостоверными (74,0±47,6 и 108,0±7,4 пг/мл, р 0,05).
Далее мы провели оценку взаимосвязи между экспрессией LIF и LIF-R в ЦС и биоптате эндометрия у пациенток в исследуемых группах.
При оценке взаимосвязи уровня экспрессии LIF в ЦС с уровнем экспрессии LIF в биоптате эндометрия в основной группе была выявлена прямая умеренная корреляционная связь (коэффициент корреляции r=0,67) (рис. 14). Рис. 14. Корреляция уровня экспрессии LIF в цервикальной слизи с уровнем экспрессии LIF в биоптате в «окно имплантации» (ЛГ+7) в основной группе
При оценке корреляционной связи уровня экспрессии LIF в ЦС с уровнем экспрессии LIF в биоптате эндометрия в «окно имплантации» (ЛГ+7) в контрольной группе была отмечена также прямая умеренная корреляционная связь (коэффициент корреляции r=0,63) (рис. 15).
Корреляция уровня экспрессии LIF в цервикальной слизи с уровнем экспрессии LIF в биоптате в «окно имплантации» в контрольной группе При оценке корреляционной связи уровня экспрессии LIF-R в ЦС с уровнем экспрессии LIF-R в биоптате в «окно имплантации» (ЛГ+7) в основной группе была отмечена прямая умеренная корреляционная связь (коэффициент корреляции r=0,66) (рис. 16).
Корреляция уровня экспрессии LIF-R в цервикальной слизи с уровнем экспрессии LIF-R в биоптате в «окно имплантации» (ЛГ+7) в основной группе
При изучении взаимосвязи уровня экспрессии LIF-R в ЦС с уровнем экспрессии LIF-R в биоптате эндометрия в «окно имплантации» (ЛГ+7) в контрольной группе была отмечена прямая умеренная корреляционная связь (коэффициент корреляции r=0,62) (рис. 17).
Корреляция уровня экспрессии LIF-R в цервикальной слизи с уровнем экспрессии LIF-R в биоптате в «окно имплантации» (ЛГ+7) в контрольной группе
При оценке взаимосвязи уровня экспрессии LIF с уровнем экспрессии LIF-R в биоптате в «окно имплантации» (ЛГ+7) в основной группе была отмечена прямая умеренная корреляционная связь (коэффициент корреляции r=0,59) (рис. 18). Корреляция уровня экспрессии LIF с уровнем экспрессии LIF-R в биоптате эндометрия в «окно имплантации» (ЛГ+7) в основной группе
При оценке взаимосвязи уровня концентрации LIF с уровнем концентрации LIF-R в цервикальной слизи в основной группе была отмечена прямая умеренная корреляционная связь (коэффициент корреляции r=0,61) (рис. 19). Рис. 19. Корреляция уровня концентрации LIF с уровнем концентрации LIF-R в биоптате в «окно имплантации» (ЛГ+7) в основной и контрольной группе
Исследование концентрации LIF и LIF-R в цервикальной слизи в зависимости от используемого препарата прогестерона
Результаты первого этапа исследования показали снижение рецептивности эндометрия у женщин с бесплодием и повторными неудачами ВРТ.
С целью повышения имплантационного потенциала эндометрия перед вступлением в программу ЭКО на втором этапе исследования в основной группе все пациентки с бесплодием принимали препараты прогестерона (дидрогестерона, микронизированного прогестерона и масляного раствора прогестерона) во вторую фазу менструального цикла в течение 3 месяцев. У этих пациенток на 3-м месяце приема препаратов гестагенов оценивали концентрацию LIF и LIF-R в ЦС. Результаты сравнительной оценки концентрации LIF в ЦС в зависимости от используемого препарата прогестерона представлены в таблице 10. Таблица 10 Концентрации LIF в ЦС у женщин с повторными неудачами имплантации в анамнезе после использования различных препаратов прогестерона (M±SD) LIF вЦС,пг/мл Группы
Как видно из данных, представленных в таблице 10, сравнительная оценка динамики изменения концентрации LIF в ЦС в зависимости от используемого препарата прогестерона показала, что максимальная концентрация LIF у пациенток, использующих различные препараты прогестерона, и в группе контроля отмечена на 7-й день после пика ЛГ в моче (в «окно имплантации»), при этом достоверных отличий в зависимости от используемого гестагена между группами не было обнаружено. На фоне приема препаратов прогестерона уровень LIF был достоверно выше по сравнению с исходным на 7-й и 9-й день после пика ЛГ (р 0,05), при этом достоверных отличий по сравнению с контрольной группой не выявлено, р 0,05.
Таким образом, после приема различных препаратов прогестерона в течение 3 месяцев в рамках подготовки к ЭКО отмечено повышение уровней LIF, сопоставимых с аналогичным показателем в контрольной группе, что свидетельствовало об улучшении имплантационных свойств эндометрия.
Исследование концентрации LIF и LIF-R в цервикальной слизи в программе ЭКО в зависимости от протокола стимуляции суперовуляции
Важнейшим и принципиальным этапом в лечении бесплодия стала разработка и внедрение в клиническую практику методов ЭКО, что сделало возможным реализацию функции деторождения практически при всех формах женского бесплодия, в том числе и при тех, которые ранее считались бесперспективными [8]. Тем не менее, эффективность программы ЭКО все еще остается низкой.
Известно, что нарушение рецептивности эндометрия может быть причиной неудач имплантации в программе ЭКО.
Успешная имплантация предполагает наличие синхронного взаимодействия бластоцисты и эндометрия. Готовность эндометрия к имплантации, или его рецептивность, развивается у фертильных женщин лишь в окно имплантации — среднюю фазу секреции менструального цикла. Нарушение рецептивности эндометрия характерно для женщин с бесплодием и считается одной из наиболее частых причин повторных неудач ВРТ при условии переноса эмбрионов хорошего качества. Оценку рецептивности эндометрия в рутинной практике принято проводить только инвазивным способом при иммуногистохимическом исследовании ткани секреторного эндометрия на этапе обследования пациентки. Необходимость поиска быстрого, точного и неинвазивного метода оценки рецептивности эндометрия не вызывает сомнений [68]. Предпринимаются попытки исследования паракринных регуляторов имплантации в ЦС для оценки рецептивности эндометрия [11]. В соответствии с целью исследования и поставленными задачами нами было обследовано 80 пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия, имеющих неудачные программы ЭКО в анамнезе, и 20 здоровых фертильных женщин, имеющих здоровых детей, для исследования рецептивности эндометрия.
Средний возраст обследованных женщин составил 29,5±3,7 года. Длительность бесплодия колебалась от 1,5 до 16 лет и в среднем составила 4,7±2,9 года. Первичное бесплодие выявлено у 29 (36,3%) пациенток, вторичное — у 51 (63,7%) пациентки.
У всех обследованных женщин с бесплодием в прошлом проводились различные виды лечения, направленные на достижение беременности. На перенесенные гинекологические операции в анамнезе указывали большинство обследованных пациенток. Из них 73 (91,3%) перенесли от 1 до 3 лапароскопических вмешательств. Тубэктомия произведена у 41 (51,3%) пациентки, сальпингоовариолизис — у 12 (15%), фимбриолизис — у 15 (18,8%), цистэктомия — у 9 (11,3%) пациенток. Всем обследованным пациенткам с бесплодием ранее было проведено более двух попыток ЭКО.
На первом этапе у 80 пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием и у 20 здоровых фертильных женщин для исследования рецептивности эндометрия определяли концентрации LIF и LIF-R в ЦС и сопоставления с их иммуногистохимической экспрессией в пайпель-биоптате эндометрия в окно имплантации.
Для исследования рецептивности эндометрия в естественном овуляторном цикле определяли экспрессию LIF и LIF-R в ЦС на 3, 5, 7, 9-й дни после пика ЛГ в моче (ЛГ+3, ЛГ+5, ЛГ+7, ЛГ+9), а также проводили ультразвуковое исследование эндометрия.
При иммуноферментном анализе экспрессии LIF в ЦС на 3-й день после пика ЛГ в моче (4,9±3,4 пг/мл) и на 7-й день (27,2±9,6 пг/мл) в естественном менструальном цикле экспрессия данного маркера была достоверно ниже у бесплодных женщин по сравнению с фертильными (7,3±2,8 и 32,2±7,3 пг/мл, р 0,05), что отражает нарушение имплантационных свойств эндометрия.
Эти данные соответствуют результатам исследования L. Aghajanova и соавт. (2003) и подтверждают высокую диагностическую ценность оценки экспрессии LIF в слизистой тела матке в определении имплантационного потенциала эндометрия [30].
При исследовании экспрессии LIF-R в естественном менструальном цикле на 5-й день (113,0±37,5 пг/мл), 7-й день (174,2±42,4 пг/мл) и 9-й день (52±10,6 пг/мл) после пика ЛГ у бесплодных женщин концентрация достоверно ниже (р 0,05) по сравнению с фертильными женщинами (156±27,5; 210±6,7и 98,1±41,3 пг/мл), что также отражает нарушение имплантационных свойств эндометрия.
Полученные результаты коррелируют с результатами группы исследователей, которые в 2013 г. изучали экспрессию LIF, LIF-R в эндометрии у бесплодных и фертильных женщин. Показатели экспрессии LIF и LIF-R у бесплодных женщин были значительно ниже показателей группы контроля [184]. В работе М.А. Tawfeek и соавт. в 2012 г. исследовали 25 бесплодных женщин и 10 фертильных (контрольная группа), наблюдалось снижение экспрессии LIF-R в эндометрии у бесплодных женщин и доказана информативность использования LIF-R в качестве молекулярного маркера рецептивности эндометрия [36].
В результате морфологического исследования эндометрия также выявлено снижение рецептивности у пациенток с бесплодием и повторными неудачами ВРТ, что проявлялось обнаружением у 45% пациенток основной группы эндометрия ранней стадии секреции, а также низким процентом зрелых пиноподий на поверхностном эпителии слизистой тела матки. В основной группе эндометрий соответствовал средней стадии секреции лишь у 40% женщин, а у подавляющего большинства фертильных женщин — в 80% случаев. Количество зрелых пиноподий в поверхностном эпителии эндометрия ( 20%) у большинства пациенток с бесплодием встречалось намного реже, чем в контрольной группе, где у подавляющего большинства женщин зрелые пиноподии выявлялись более чем на 40% поверхностного эпителия эндометрия. В исследовании, проведенном G. Nikas и соавт. (2002), было показано снижение количества зрелых пиноподий у пациенток с бесплодием неясного генеза с нарушением имплантации эндометрия в анамнезе [132].
Распределение LIF в клетках функционального слоя эндометрия у пациенток с безуспешными попытками ЭКО в анамнезе характеризуется отсутствием усиления экспрессии LIF от глубокого гистологического слоя к более поверхностному. В группе фертильных женщин такая тенденция отчетливо прослеживалась.