Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 12
1.1 Мелатонин. Биосинтез и метаболизм. Рецепторы мелатонина 12
1.2 Биологические эффекты мелатонина 17
1.3 Наружный генитальный эндометриоз: современные представления о патогенезе 20
1.4 Медикаментозная терапия НГЭ 24
1.5 Новые направления в лечении НГЭ. Возможности применения мелатонина в терапии заболевания 27
Глава 2 Материалы исследования 30
Глава 3 Методы исследования 32
3.1 Общеклинические методы 32
3.2 Определение уровня гормонов 34
3.3 Исследование уровня сульфатной формы мелатонина в суточной моче 35
3.4 Эндоскопический метод исследования 36
3.5 Морфологическое исследование 39
3.5.1 Иммуногистохимическое исследование 39
3.5.2 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия 40
3.5.3 Цифровая микроскопия и морфометрия 41
3.6 Экспериментальная модель эндометриоза 41
3.7 Генетическое исследование 47
3.7.1 Полимеразная цепная реакция 47
3.7.2 Гидролиз ПЦР продукта ферментами рестрикции 49
3.7.3 Электрофорез и визуализация результатов 49
3.8 Статистические методы 50
Глава 4 Результаты исследования 52
4.1 Клиническая характеристика больных НГЭ 52
4.1.1 Результаты гормонального обследования 57
4.2 Результаты определения метаболита мелатонина в суточной моче 58
4.3 Результаты проведения пробы с мелатонином 59
4.4 Результаты иммуногистохимического исследования 61
4.5 Оценка влияния мелатонина на очаги эндометриоза в хирургически индуцированной модели у крыс 64
4.6 Результаты оценки эффективности влияния мелатонина на выраженность болевого синдрома, изменения психо-эмоционального фона и реализацию репродуктивной функциии у больных НГЭ 69
4.7 Результаты генетического исследования 72
Глава 5 Обсуждение результатов 80
Выводы 94
Практические рекомендации 97
Список сокращений 98
Список литературы 100
- Мелатонин. Биосинтез и метаболизм. Рецепторы мелатонина
- Экспериментальная модель эндометриоза
- Оценка влияния мелатонина на очаги эндометриоза в хирургически индуцированной модели у крыс
- Результаты генетического исследования
Мелатонин. Биосинтез и метаболизм. Рецепторы мелатонина
Мелатонин – гормон шишковидной железы, открытый в 1958 г. американским дерматологом Йельского университета Аароном Лернером, который занимался поисками эффективных косметических осветляющих средств для лечения пигментных дерматозов. В своей лаборатории Лернер привлек к работе известного американского биохимика Джулиуса Аксельрода и совместными усилиями группы биохимиков, дерматологов и эндокринологов, переработав десятки тысяч шишковидных желез крупного рогатого скота, получил несколько граммов вещества, оказывающего мощное осветляющее воздействие на кожу лягушек. Так был открыт новый гормон – мелатонин, название которому было дано в связи с вышеописанным свойством. Джулиус Аксельрод был удостоен в 1970 году Нобелевской премии.
Мелатонин – гормон индоламинового типа, синтезируемый секреторными клетками эпифиза, из серотонина под действием N – ацетилтрансферазы (NAT) и оксиндол-О-метилтрансферазы [4]. Серотонин в значительных концентрациях обнаруживается в шишковидной железе, синтезируется из незаменимой аминокислоты триптофана путем 5-гидроксилирования, а затем декарбоксилирования получившегося гидрокситриптофана. Серотонин в шишковидной железе ацетилируется, затем N-ацетил-серотонин впоследствии метилируется до образования мелатонина, с помощью фермента гидроксииндол-O-метилтрансфераза (HIOMT) [4]. Следует отметить, что именно оксиндол-О-метилтрансфераза является основным фактором, определяющим производство мелатонина и, по сути, его ограничивающим [33,53].
Мелатонин, циркулирующий в крови, метаболизируется в печени в результате двушаговой реакции [4,61]. Вначале он подвергается 6-гидроксилированию, а затем коньюгации с сульфатом или глюкуронидом. 6-гидроксимелатонинсульфат (6-сульфатоксимелатонин) и 6-гидоксимелатонин глюкуронид затем экскретируются с мочой [4,61]. У человека основным метаболитом мелатонина является 6-сульфатоксимелатонин. Уровень экскреции этого метаболита в плазме крови и моче отражает качественные и количественные аспекты секреции мелатонина. Данный фактор позволяет часто использовать как для анализа ритма эндогенного мелатонина, так и для исследования фармакокинетических свойств гормона, введенного, например, в форме таблеток или капсул [61]. Следует отметить, что при инъекции мелатонина или введении его перорально, содержание гормона эпифиза в крови быстро растет, а затем почти сразу снижается за счет поглощения его тканями [60]. Синтезируемый в сетчатке мелатонин инактивируется другим способом, отличным от варианта утилизации эпифизарного мелатонина [20]. Вначале мелатонин в сетчатке подвергается диацетилированию до 5-метокситриптамина, катализируемому арилациламидазой. Затем 5-метокситриптамин метаболизируется до образования 5-метоксииндолацетиловой кислоты или превращения в 5-метокситриптофол [68]. Поэтому мелатонин, синтезируемый и утилизируемый в сетчатке, не вносит вклад в характеристику уровня данного гормона в циркулирующей крови, определяемого по продуктам экскреции.
Вероятно, это связано с наличием многочисленных нейронных проводящих путей, связывающих ганглиозные клетки сетчатки и эпифиз. Информация от сетчатки глаза первично передается на нейроны супрахиазматического ядра гипоталамуса. Данная область мозга хорошо известна, как область-координатор биологических цирхоральных и циркадных реакций. Далее нервные волокна из гипоталамуса спускаются к спинному мозгу, а затем переключаются на нейронах верхнего шейного симпатического узла, от которого в составе постганглионарных нейронов поднимаются обратно к эпифизу. Таким образом, шишковидная железа является аналогичной мозговому слою надпочечников, в том смысле, что преобразовывает сигналы, поступающие со стороны симпатической нервной системы в гормональный ответ [53].
Известно, что существует эндогенный суточный ритм продукции мелатонина (пик выработки приходится около 2-4 часов ночи с последующим снижением), существенное влияние на которое оказывает воздействие света – подавление синтеза данного гормона тем больше, чем ярче свет. Свет – главный сигнал окружающей среды, регулирующий биосинтез мелатонина, и он воздействует на продукцию гормона двумя способами. Свет (как в видимой части спектра, так и в невидимой области, до УФ – излучения А-типа) подавляет активность N-ацетилтрансферазы и снижает содержание мелатонина и его секрецию до базального уровня в любое время суток [55]. Вспышки света регулируют осциллятор, генерирующий ритм продукции мелатонина, в зависимости от фазы либо усиливая, либо ослабляя продукцию [82]. Например, воздействие вспышки света ранней ночью вызывает снижение нарастающего уровня гормона (задержку фазы), тогда как вспышка света, примененная поздней ночью, обусловливая снижение уровня мелатонина, вызывает сдвиг фазы ритма вперед. Воздействие вспышки света днем не влияет на циркадианную ритмику образования мелатонина.
У человека уровень эпифизарного мелатонина плавно растет, начиная со времени наступления сумерек, и достигает максимума в середине ночи, а затем плавно снижается к рассвету до дневного уровня. Максимальный уровень мелатонина в плазме крови часто обнаруживается между 2:00 и 3:00 часами. Вечером постепенное увеличение концентрации уровня гормона эпифиза в крови приводит к возрастанию плотности рецепторов мелатонина МТ1 на поверхности нейронов СХЯ гипоталамуса [76].
Мелатонин также является центральным эндогенным синхронизатором биологических ритмов и оказывает свое влияние на органном, клеточном и субклеточном уровнях, путем связывания с собственными рецепторами, находящимися на органах-мишенях [70]. Секреция мелатонина происходит синхронизировано с циклом день/ночь, при этом пик концентрации приходится на ночное время суток. Продукция мелатонина напрямую зависит от освещенности. Так, в светлое время наблюдаются низкие концентрации мелатонина в плазме, которые увеличиваются до пиковых значений в темноте. У человека на ночные часы приходится 70% суточной продукции мелатонина. Пиковые уровни концентрации гормона в плазме крови у взрослых, составляют от 60 до 70 пг/мл ночью, а в дневные часы около 10 пг/мл [69].
Мелатонин обладает высокой растворимостью в липидах и воде, что облегчает проход через клеточные мембраны. После высвобождения в кровоток он легко проникает в различные жидкости, ткани и клеточные компартменты (слюна, моча, спинномозговая жидкость, фолликуллярная жидкость, сперма, амниотическая жидкость и молоко) [40].
В литературе представлены и другие внеэпифизарные источники синтеза мелатонина, такие как энтерохромафинные клетки желудочно-кишечного тракта, которые были открыты профессором Н.Т.Райхлином и И.М.Кветным. За ведущую роль в открытии внеэпифизарных источников синтеза мелатонина в 1981 году профессору И.М. Кветному была присуждена премия Ленинского комсомола, а в 1996 году – самая престижная профессиональная награда в области клеточной биологии – премия и серебряная медаль Пирса, Королевского микроскопического общества Великобритании.
Помимо шишковидной железы мелатонин также производят и депонируют ткани сетчатки, хрусталика, яичники, костный мозг, энтерохромаффинные клетки ЖКТ. Однако, плазменную концентрацию мелатонина создает именно эпифиз, а гормон, содержащийся в клетках других различных тканей и органов, реализует свое действие исключительно местно [53].
Эффекты мелатонина в организме опосредованы двумя путями, через специфические рецепторы мелатонина и нерецепторные пути. Мелатонин – гормон, имеющий как мембранные, так и ядерные рецепторы. Мембранные рецепторы мелатонина МТR1 (Melatonin Receptor1A) и МТR2 (Melatonin Receptor 1B) принадлежат к семейству рецепторов, связанных с гуанин-нуклеотид соединяющим регуляторным белком (G-белкам) [69]. Активация МТ1-рецептора приводит к ингибированию цАМФ, за счет увеличения внутриклеточного кальция [93]. Связывание с МТR2 рецептором приводит к ингибированию и цАМФ и цГМФ. МТR1 рецепторы связаны с репродуктивными и метаболическими функциями мелатонина, а МТR2-рецепторы участвуют в регуляции циркадных ритмов и высвобождении допамина в сетчатке, вазодилятации [93]. Мелатонин при активации МТR1 или МТR2 ингибирует аденилатциклазу, через ингибирование цАМФ и, как следствие, вызывает ингибирование протеинкиназы А, что, в конечном итоге, приводит к изменению транскрипции генов. По такому пути мелатонин регулирует антиоксидантную транскрипцию генов [41]. Активация МТR2 рецепторов вызывает активацию еще и других сигнальных путей, включающих фосфолипазу, митоген-активируемую протеинкиназу. Эти пути контролируют такие процессы как транскрипция генов, метаболизм, пролиферация, подвижность и апоптоз клеток [93].
Экспериментальная модель эндометриоза
Хирургически индуцированная модель эндометриоза выполнена в виварии ФГБНУ «НИИАГиР им. Д.О. Отта» (зав. виварием – Воронов А.А.) под руководством к.б.н., в.н.с., рук. лаб. фармакологии Петросян М.А. Исследование проводилось на половозрелых самках крыс линии Wistar, массой 200-250 г. Лабораторные животные были получены из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово». Все особи содержались в регламентированных условиях вивария ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта», при соблюдении всех правил содержания лабораторных животных (время и порядок проведения карантина, маркировка всех особей, постоянный санитарный контроль, стандартный рацион питания, свободный доступ к воде и пище, автоматический режим освещения «день-ночь»). Проведение эксперимента осуществлялось согласно основным морально-этическим принципам проведения биомедицинских экспериментов на животных, сформулированных в документе «Правила лабораторной практики в РФ» (Good Laboratory Practice), утвержденные Приказом Министерства здравоохранения и социального развития от 23.08.2010 г. N 708н. Для проведения хирургического моделирования эндометриоза отбирались самки с регулярным 4-5 дневным эстральным циклом. В течение двух недель ежедневно осуществляли мониторинг эстрального цикла путем ежедневного забора влагалищных мазков, и их микроскопической оценки. Все операции выполняли в стадию эструс, стандартизируя условия трансплантации фрагментов матки, находящихся в одинаковой стадии эстрального цикла. Операцию проводили под общей анестезией животных препаратом Zoletil-100 (Virbac S.A., Франция) в дозе 10 мг/кг массы тела животного. Затем, после фиксации животного выполняли подготовку места хирургического доступа к операции (освобождение брюшной части туловища от шерстного покрова и обработка кожи 70% раствором этанола) и накрывали стерильной салфеткой. Доступ в брюшную полость животных проводили путем лапаротомии (рисунок 5).
В нижней трети туловища выполняли вертикальный срединный разрез на коже около 2 см, а затем послойно на подкожной жировой клетчатке и брюшине, через который извлекали правый рог матки. Перевязка рога осуществлялась в области маточно-трубного перехода и на 1 см выше маточно-цервикального перехода. Фрагмент рога матки между лигатурами иссекали (около 0,5–1 см), вскрывали по стороне прикрепления брыжейки матки и рассекали на равные части размером 33 мм. Всем животным во время операции проводилась двусторонняя овариоэктомия. Затем проводили аутотрансплантацию двух фрагментов матки на париетальную брюшину передней брюшной стенки к месту бифуркации сосудов, справа и слева от срединного разреза, с использованием шовного материала VICRYL Plus Antibacterial/resorbeerbaar (3-0). Перед закрытием операционной раны проверяли гемостаз, в случае необходимости лигировали сосуды. Для ушивания брюшной раны накладывали сплошной шов. Для ушивания кожной раны накладывали прерывистый шов по Донати, с применением нитей VICRYL Plus Antibacterial/anresorbeerbaar (3-0).
С целью профилактики послеоперационных осложнений в день операции и в течение последующих двух дней все животные получали антибактериальную терапию и обезболивающие препараты. В послеоперационном периоде швы на коже ежедневно обрабатывали антисептиком до момента заживления раны. Со следующего дня после операции, дважды в неделю в течение всего периода эксперимента всем животным вводили внутримышечно этинилэстрадиол в дозе 50 мкг/кг (для создания эстрогеннасыщенного гормонального фона и оценки его влияния на формирование эндометриоидных гетеротопий). Через две недели после первой операции проводили второй этап – диагностическую лапароскопию, с целью четкой визуализации и оценки формирования эндометриоидных гетеротопий при многократном увеличении, фотодокументирования и измерения размеров имплантов (рисунок 6).
Затем животные случайным методом были разделены на следующие группы:
Основная группа: (11 животных) после лапароскопии в течение 3 недель ежедневно перорально (внутрижелудочно через зонд) получала исследуемый препарат (мелаксен, таблетки по 3 мг) с расчетом 0,3 мг на 200 г массы тела животного. Группа (8 крыс), получавшая препарат (жидкий мелатонин, 10 мг, США) с расчетом 10 мг на 200 г массы тела.
Контрольная группа (12 крыс) лечение не получала.
В группу сравнения были включены 10 животных, получавших терапию диеногестом (таблетки по 2 мг).
Через 3 недели от начала лечения животные выводились из эксперимента, выполнялась аутопсия (рисунок 7). Рисунок 7 - 3 этап экспериментальной модели эндометриоза - аутопсия
Затем проводили оценку и измерение эндометриоидных очагов, их удаление для проведения гистологического исследования.
Площадь сформировавшейся гетеротопии рассчитывалась по формуле площади эллипса: S=AXBXTT (1) где S - площадь гетеротопии (мм2), А и В - зафиксированные продольный и поперечный размеры гетеротопии (мм). Значение числа округляли до 3,14. Гистологическое исследование проводилось по стандартной методике. Операционно-биопсийный материал фиксировали 10% нейтральным формалином (рН 7,2), обезвоживали в спиртах по нарастающей концентрации от 70 до 96 с помощью автоматической станции Leica TP1020 (Leica, Германия) и заливали в парафин согласно стандартной гистологической схеме. Из полученных блоков готовили срезы толщиной 3 мкм. Для обзорной окраски использовался гематоксилин и эозин. При световой микроскопии оценивали формирование эндометриоидных кист, выстилку кист, присутствие гемосидерофагов, гистологические признаки воспаления. Исследование проводили на микроскопе Olympus CX31 (Olympus, Япония) 100, 400.
Оценка влияния мелатонина на очаги эндометриоза в хирургически индуцированной модели у крыс
У 42 прооперированных животных после первой операции и создания эстроген-насыщенного состояния сформировались 80 эндометриоидных гетеротопий (рисунок 18).
Во всех образцах эндометриоидных очагов после лечения определялась поперечно-полосатая мускулатура с шовным материалом в разной стадии резорбции, а также гигантоклеточное воспаление и экссудативное воспаление.
В контрольной группе в исследованных образцах отмечено присутствие поперечно-полосатых мышц с шовным материалом, выявлены сформированные эндометриоидные гетеротопии в виде «кист», выстланные эндометриодноподобным эпителием. В 50% случаев присутствовали гемосидерофаги, в 35% случаев выявлена гиперваскуляризация эндометриоидной гетеротопии. В 15% случаев определялась экссудативная инфильтрация и плазмоцитарная инфильтрация.
В группе с применением мелатонина 3 мг после первой операции у 11 крыс сформировались 22 гетеротопии (рисунок 19). Площадь гетеротопий варьировала от 18,84 до 78,5 мм2 (средняя площадь гетеротопии – 56,16±19,42 мм2). После применения мелатонина 3 мг площадь 18 (81,8%) из 22 гетеротопий достоверно уменьшилась. В 8 (44,4%) гетеротопиях зафиксирована полная резорбция очагов эндометриоза (рисунок 20), в 10 (55,6%) эндометриоидных очагах наблюдался достоверный регресс. Площадь 2 (9%) эндометриоидных гетеротопий не имела тенденции к уменьшению, в 2 (9%) эндометриоидных гетеротопиях отмечено незначительное увеличение размеров. После выведения из эксперимента животных, получавших лечение мелатонином 3 мг, среднее значение площади гетеротопии составило 33,31±16,07 мм2.
В группе, получавшей мелатонин в дозе 10 мг, после первой операции у 8 крыс сформировались 16 гетеротопий (рисунок 21). Площадь гетеротопий варьировала от 17,8 до 76,2 мм2 (средняя площадь гетеротопии – 46,34±20,32 мм2). После применения мелатонина 10 мг площадь 15 (93,7%) из 16 гетеротопий достоверно уменьшилась. В 9 (62,5%) гетеротопиях зафиксирована полная резорбция очагов эндометриоза (рисунок 22), в 10 (55,6%) эндометриоидных очагах наблюдался достоверный регресс, ни случаев увеличения роста имплантов, ни случаев без динамики зафиксировано не было. После выведения из эксперимента животных, получавших лечение мелатонином 10 мг, среднее значение площади гетеротопии составило 28,4±12,1 мм2.
В контрольной группе у 12 животных были сформированы 23 гетеротопии (рисунок 23). Площадь гетеротопий, зафиксированная во время проведения лапароскопии, варьировала от 12,12 до 86,35 мм2 и в среднем составила – 46,46±6,00 мм2. После окончания эксперимента у 10 (86,9%) животных из группы контроля (20 очагов эндометриоза) отмечался достоверный рост гетеротопий – площадь находилась в диапазоне от 22,56 до 94,20 мм2 и в среднем составила 55,12±11,66 мм2 (рисунок 24). В одном случае (4,3%) размеры очага остались без изменений, в 2 (8,7%) очагах эндометриоза зафиксирован регресс ранее сформировавшейся гетеротопий.
Площадь их до лечения составила от 19,62 до 38,46 мм2, среднее значение площади гетеротопии было 29,14±7,65 мм2. После применения диеногеста площадь 17 (85%) из 20 гетеротопий достоверно уменьшилась. В 10 (58,8%) очагах эндометриоза отмечена полная резорбция гетеротопий (рисунок 26), в 7 (41,2%) гетеротопиях наблюдался достоверный регресс очагов, в 2 (10%) сформировавшихся гетеротопиях размеры очагов не изменились, в одном очаге (5%) эндометриоза отмечено увеличение размеров (рисунок 27).
Следует отметить, что все животные, получавшие лечение, находились в удовлетворительном состоянии до окончания эксперимента и хорошо переносили исследуемые препараты.
В первую группу вошли 73 больные НГЭ, получавшие комбинированное лечение мелатонином и аГнРГ; во вторую группу – 77 пациенток, применявшие диеногест 2 мг в сочетании с мелатонином. Также были сформированы две группы сравнения, в которую вошли пациентки с НГЭ, болевым синдромом и бесплодием, получающие только стандартную гормономодулирующую терапию. 59 пациенток из первой группы сравнения получали монотерапию аГнРГ, 55 больных НГЭ из второй группы сравнения – диеногест 2 мг.
Отдельную группу составили 12 больных, получавшие монотерапию мелатонином 6 мг, у которых имелись противопоказания для назначения стандартной гормональной терапии.
На фоне проводимой комбинированной терапии НГЭ с применением мелатонина не отмечено ни одного случая рецидива заболевания. На основании оценки по визуально-аналоговой шкале (ВАШ) у больных, получавших комбинированную терапию с мелатонином, отмечено выраженное уменьшение болевого синдрома в сравнении со стандартной гормонотерапией.
Результаты генетического исследования
В нашей работе проведено исследование полиморфизма генов ариламин-N-ацетилтрансферазы 2 (NAT2), глутатион-S-трансферазы классов М и Т (GSTM1, GSTТ1) и цитохрома P450 1B1 (CYP1B1). Образцы ДНК были получены из лимфоцитов периферической крови 59 пациенток с наружным генитальным эндометриозом (НГЭ) I-IV стадий по классификации R-AFS, подтвержденным лапароскопически и гистологически, которые получали терапию мелатонином 6 мг от 2 до 6 месяцев. У 64% (n=38) пациенток была хорошая переносимость мелатонина, а у 36% (n=21) женщин отмечалась плохая переносимость препарата и побочные эффекты (сонливость, частые просыпания по ночам, головные боли, бессонница), в связи с которыми прием препарата пришлось отменить.
Гомозиготное состояние по аллелю N гена NAT2 в группе пациенток с НГЭ встречалось с частотой (6,78%) (таблица 5).
Больные с НГЭ, гомо- и гетерозиготные (генотипы S1/N, S2/N, S3/N) по аллелю N, относящиеся к категории «быстрых» ацетиляторов, встречались с частотой (42,37%). Частота аллеля дикого типа (N) в группе больных наружным генитальным эндометриозом составила 24,58%.
При разделении пациенток с наружным генитальным эндометриозом по стадиям заболевания достоверных различий между подгруппами в частотах генотипов и аллелей по гену NAT2 выявлено не было (таблица 6), однако, можно предположить, что это связано с небольшой выборкой пациенток.
У пациенток с плохой переносимостью мелатонина частота аллеля дикого типа (N) была достоверно выше (38,1%), чем у пациенток с хорошей переносимостью препарата (17,1%) (таблица 7). Гомо- и гетерозиготы по аллелю N (фенотип быстрого ацетилирования; генотипы N/N, S1/N, S2/N, S3/N) встречались достоверно чаще в группе пациенток с плохой переносимостью препаратапо сравнению с группой женщин, у которых не было побочных эффектов и переносимость была хорошая (61,9% и 31,6% соответственно, p=0,024) (рисунок 30). Согласно рассчитанному коэффициенту соотношения шансов, носительство аллеля дикого типа (N) в 3,5 раза увеличивает риск плохой переносимости мелатонина (OR=3,521, CI=1,154-10,742).
Частота генотипов GSTM10/0 и GSTM1+ у больных эндометриозом составила 53,1% и 46,9% соответственно.
При сравнении частоты делеции гена GSTM1 между пациентками с хорошей и плохой переносимостью мелатонина частоты генотипов GSTM10/0 и GSTM1+ составили соответственно: 44,73% и 55,26% – при хорошей переносимости, 66,7% и 33,3% – при плохой переносимости препарата, однако также достоверно не отличались (таблица 8).
Цитохром P450 1B1 (CYP1B1) является членом семейства генов цитохрома P450 и кодирует один из основных ферментов, участвующих в гидроксилировании эстрогенов и антиоксидантной защите (фермент 1 фазы детоксикации). Данный фермент вовлечен в процесс деградации мелатонина. Существуют несколько полиморфных вариантов гена CYP1B1, одним из которых является полиморфизм 4326 C/G (L432V,rs1056836), связанный с более высокой каталитической активностью по сравнению с аллелем дикого типа.
Распределение частот генотипов и аллелей гена CYP1B1достоверно не отличались в подгруппах с различной переносимостью мелатонина. Отмечено, что полиморфный аллель G, связанный с повышенной каталитической активностью, при плохой переносимости препарата встречался несколько чаще, чем при хорошей (47,6% и 38,2% соответственно) (таблица 10).
Далее были проанализированы частоты некоторых сочетанных генотипов NAT2 и CYP1B1 характерные для различного уровня накопления мелатонина в организме (рисунок 31). Для максимального накопления мелатонина наиболее характерен генотип соответствующий фенотипу «быстрого» ацетилирования по NAT2 (накопление эндогенного мелатонина)+низкая каталитическая активность CYP1B1) (замедление деградации как эндогенного так и экзогеннного мелатонина), а для минимального – характерен генотип соответствующий фенотипу «медленного» ацетилирования по NAT2 (накопление эндогенного мелатонина)+ высокая каталитическая активность CYP1B1) (замедление деградации как эндогенного так и экзогенного мелатонина). Показано достоверное повышение частоты генотипа N/N(NAT2)+C/C(CYP1B1) соответствующего фенотипу быстрого накопления мелатонина у пациентов с плохой переносимостью препарата (14% и 0% соответственно, p=0,04). Согласно рассчитанному коэффициенту соотношения шансов, носительство сочетанного генотипа N/N(NAT2)+C/C(CYP1B1) в 14 раз увеличивает риск плохой переносимости мелатонина (OR=14,568CI=1,002-100,742).
Таким образом, при исследовании полиморфизма генов NAT2, GSTM1, GSTТ1, СYР1В1 было выявлено, что наличие аллеля дикого типа (N) гена NAT2 и генотипа GSTM10/0 у больных НГЭ ассоциировано с плохой переносимостью мелатонина.
Также при анализе частот сочетанных генотипов NAT2 и CYP1B1 было обнаружено, что фенотип «быстрого» ацетилирования по NAT2(N/N) в сочетании с низкой каталитической активностью CYP1B1(C/C) встречался чаще у пациенток с плохой переносимостью мелатонина по сравнению с группой пациенток, которые хорошо переносили терапию. Можно предположить, что плохая переносимость препарата у индивидуумов имеющих сочетанный генотип N/N(NAT2)+C/C(CYP1B1) обусловлена достаточным уровнем синтеза эндогенного мелатонина и недостаточно быстрой инактивацией как эндогенного, так и экзогенного мелатонина.