Роль провоспалительного цитокина интерлейкина-1[B] в патогенезе гестоза Манис Софья Сергеевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Современные взгляды на проблему этиологии и патогенеза гестоза беременных 11

1.2. Особенности синтеза и рецепции интерлейкина при беременности 25

Глава 2. Материалы и методы исследования .

2.1. Дизайн исследования 37

2.2. Методы исследования 38

Глава 3. Клиническая характеристика обследованных женщин 45

3.1. Сравнительная характеристика обследованных женщин на наличие урогенитальных инфекций 65

Глава 4. Особенности синтеза, ітродукции и рецепции интерлейкина-1(3 на системном и локальном уровнях 67

4.1. Продукция и рецепция интерлейкина-1(3 в периферической крови женщин с гестозом различной степени тяжести в третьем триместре гестации _67

4.2. Продукция и рецепция интерлейкина-ір в децидуальной оболочке женщин с гестозом различной степени тяжести 72

4.3. Продукция и рецепция интерлейкина-1(3 в сосудистом русле ворсинчатого хориона женщин с гестозом различной степени тяжести 76

Глава 5. Патоморфологические особенности плацент в обследуемых группах 88

Глава 6. Обсуждение результатов исследования 101

Выводы 136

Практитческие рекомендации 138

Список литературы 139

• Современные взгляды на проблему этиологии и патогенеза гестоза беременных
• Особенности синтеза и рецепции интерлейкина при беременности
• Методы исследования
• Продукция и рецепция интерлейкина-1(3 в периферической крови женщин с гестозом различной степени тяжести в третьем триместре гестации

Введение к работе

Актуальность проблемы.

Гестоз в современных условиях по-прежнему является актуальной проблемой современного акушерства и относится к одному из самых грозных осложнений беременности, родов и послеродового периода, занимая ведущее место в структуре материнской и перинатальной патологии и смертности, а таюке инвалидизации новорожденных (30). Частота гестоза составляет от 8% до 42% и не имеет тенденции к снижению, несмотря на достижения в изучении этиологии, патогенеза и разработку новых методов прогнозирования развития гестоза и лечения этого осложнения беременности (57).

По современным представлениям, гестоз вылечить невозможно, а есть возможность лишь проведения терапии для предотвращения перехода его в более тяжелые формы. (11).

Несмотря на современные подходы к ранней диагностике и новым методам лечения гестозов, летальность при этой патологии занимает третье место и составляет 12,9%, после смерти от абортов - 24,2% и акушерских кровотечений - 18,2% (30). Несмотря на постоянное внимание к проблеме гестоза во всем мире, вопрос этиологии и патогенеза остается спорным. Существует около 40 теорий развития гестоза, который справедливо называют «болезнью теорий» (86). Ежегодно появляются все новые и новые теории развития гестоза. Все это говорит о том, что вопросы этиологии и патогенеза очень сложны, и, тем не менее, ни одна из существующих теорий не может полностью объяснить причины развития этого тяжелого осложнения беременности.

В последние годы все большее значение в развитии гестоза придается нарушением иммунной системы беременной (55, 68, 163). Именно адекватный иммунный ответ матери на антигены фетоплацентарного комплекса обеспечивает существование генетически чужеродных организмов во время беременности. При этом иммунные нарушения тесно согласуются с цитокин-

опосредованным оксидативным стрессом с последующей активацией эндотелия и перикисного окисления липидов с изменением баланса Thl/Th2 материнского ответа против эмбриональных антител (215). Многие процессы, обеспечивающие физиологическое течение беременности, регулируются цитокинами, синтезирующимися в периферической крови и в децидуальной оболочке плаценты. В связи с тем, что теория, рассматривающая гестоз как системную воспалительную реакцию, является сейчас ведущей (157, 159, 160), наибольший интерес представляет изучение характера синтеза и рецепции провоспалительных цитокинов на системном и локальном уровне у женщин с гестозом.

Уникальным провоспалительным цитокином, способным стимулировать активность многих типов лейкоцитов в ходе воспаления и иммунного ответа, является интерлейкин-1 (IL-1) (79), который опосредует множество физиологических процессов, включая иммунные ответы, провоспалительные реакции, метаболизм, гемопоэз (112). IL-1J3 чаще всего выявляется в секретируемой форме и обладает не только локальным, но и системным действием (24). Существует 2 типа рецепторов, через которые IL-ip осуществляет свое действие — RI — экспрессируются на Т-клетках и фибробластах; и RII- экспрессируется на преВ- и В-клетках и макрофагах. При связывании RII не происходит активации клетки (113). Таюке существует «рецепторный антагонист IL-1» (RaIL-І), который не только не оказывает IL-1 подобного действия, но, наоборот, отменяет большинство его эффектов. Сведения о синтезе и особенно рецепции важнейшего из провоспалительных цитокинов - IL-ip при гестозе достаточно разноречивы и малочисленны. Дальнейшее исследование синтеза и рецепции IL-ip может иметь значение для раскрытия некоторых сторон такой частой патологии, как гестоз, и более полно получить представление об участии провоспалительных цитокинов в патогенезе этой тяжелой акушерской патологии.

Цель работы: установить новые звенья патогенеза гестоза на основании выявления особенностей баланса синтеза и рецепции IL-1J3 на системном и локальном уровне.

Задачи исследования:

1. Оценить особенности течения беременности, родов, состояния новорожденного, дать морфологическую характеристику последов у женщин с гестозом различной степени тяжести.

2. Дать характеристику синтеза и рецепции IL-1(3 в периферической крови беременных в третьем триместре гестации с гестозом различной степени тяжести.

3. Установить особенности синтеза и рецепции IL-1(3 в децидуальной оболочке беременных в третьем триместре гестации с гестозом различной степени тяжести.

4. Оценить характер синтеза и рецепции IL-1(3 на уровне ворсинчатого хориона беременных в третьем триместре гестации с гестозом различной степени тяжести.

Научная новизна:

5. Впервые выявлено усиление экспрессии мРНК IL-1(3 моноцитами при гестозе, повышение внутриклеточного синтеза IL-1J3 и усиление экспрессии рецепторов второго типа моноцитами и увеличение количества моноцитов, экспрессирующих RII, что является причиной развития системной воспалительной реакции.

6. На локальном уровне в децидуальной оболочке плаценты впервые выявлено повышение продукции IL-lf3 при тяжелом гестозе и усиление экспрессии мРНК IL-1|3 макрофагами и лимфоцитами, способствующих развитию локального воспаления и утяжелению гестоза.

7. Впервые доказано, что на уровне ворсичатого хориона включаются компенсаторные механизмы, направленные на защиту плода при гестозе, которые заключаются в снижении синтеза IL-1J3 моноцитами сосудистого

русла ворсинчатого хориона с одновременным ослаблением экспрессии моноцитами мРНК RII IL-ip и уровня моноцитов, экспрессирующих RH. Впервые установлено, что при гестозе усиливается экспрессия мРНК RI лимфоцитами сосудистого русла ворсинчатого хориона.

4. Установлена связь между повышением IL-1 (3 в сыворотке периферической крови и развитием перинатальных гипоксических поражений ЦНС у новорожденных, рожденных от матерей с гестозом.

5. Выявлена зависимость между степенью тяжести гестоза и наличием урогенитальной инфекции: по мере увеличения доли смешанной инфекции нарастает степень тяжести гестоза. Установлено, что одним из факторов, способствующих преждевременной отслойке нормально расположенной плаценты является наличие смешанной инфекции.

Практическая значимость:

В клиническую практику предложен новый способ прогнозирования перинатальных гипоксических поражений ЦНС у новорожденных, рожденных от матерей с гестозом, по определению в сыворотке периферической венозной крови IL-1(3 в третьем триместре гестации.

Положения, выносимые на защиту:

При гестозе на системном уровне повышается синтез и продукция IL-ip моноцитами с одновременным включением механизма подавления его синтеза, заключающемся в повышении содержания растворимой формы RII, Ra IL-1J3, усилении экспрессии мРНК RH IL-lp на их поверхности, что может быть обусловлено наличием уреаплазменной инфекции. На локальном уровне отмечается усиление экспрессии RI типа для IL-1{3 на лимфоцитах, что способствует развитию воспалительной реакциии. Одним из факторов утяжеления гестоза, является повышенный синтез IL-ip макрофагами децидуальной оболочки. На уровне трофобласта провоспалительная реакция выражена меньше за счет угнетения синтеза IL-1Р лимфоцитами.

Существует зависимость между степенью тяжести гестоза, наличием урогенитальной инфекции, частотой и характером воспаления в последах при патоморфологическом исследовании у женщин с гестозом.

Внедрение результатов в практику: по результатам исследования получена одна приоритетная справка на изобретение по способу прогнозирования перинатальных гипоксических поражений ЦНС у новорожденных.

Апробация работы: Основные положения диссертации доложены на VI Российском форуме «Мать и Дитя» (Москва, 2004); Республиканской конференции «Имуннология репродукции» (Иваново, 2005); подготовлена работа на VIII Российский форум «Мать и Дитя» (Москва, 2006).

Публикации: по теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем диссетрации: диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, три главы собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические рекомендации. Библиографический указатель включает 90 отечественных и 103 иностранных источника. Работа иллюстрирована 12 рисунками и 26 таблицами.

Современные взгляды на проблему этиологии и патогенеза гестоза беременных

Гестоз - это одна из актуальных проблем современного акушерства. Он занимает ведущее место в структуре материнской и перинатальной патологии и смертности (30). Частота гестоза составляет от 8% до 42% (56).

Несмотря на современные подходы к ранней диагностике и новым методам лечения гестозов, летальность женщин при этой патологии в настоящее время остается достаточно высокой. Гестозы традиционно занимают третье место и составляет 12,9%, после смерти от абортов - 24,2% и акушерских кровотечений - 18,2% (30). Гестозы приводят к увеличению частоты невынашивания беременности, гипоксии и гипотрофии плода, преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты, маточных кровотечений в родах и послеродовом периоде, увеличению частоты оперативных родоразрешений. (30).

По официальным данным 13,1-15,7% беременных, состоящих на учете в женской консультации, страдают гестозом (80). Продолжающемуся увеличению частоты этого осложнения беременности способствует рост экстрагенитальной патологии в популяции женщин репродуктивного возраста (30). Гестоз в настоящее время развивается на фоне заболеваний, частота которых имеет тенденцию к увеличению: нарушение жирового обмена - 16,5%; почечная патология - 10,2%; гипертоническая болезнь - 8,1%; эндокринопатии - 7,2%; сочетанные экстрагенитальные заболевания - 10,9% (55). По данным Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, доля сочетанных форм гестоза составляет 67,2% (80). Для сочетанных гестозов характерно раннее клиническое проявление и более тяжелое течение, обычно с преобладанием симптомов заболевания, на фоне которого развился гестоз (26). Эффективным методом борьбы с тяжелыми гестозами как основной причиной материнской и перинатальной смертности является терапия фоновых экстрагенитальных заболеваний (33). Актуальность проблем этиологии, патогенеза, разработки эффективных принципов терапии, обусловлена также тяжелыми последствиями патологии не только в период беременности и родов, но и в отдаленный период наблюдения. У большинства женщин, перенесших это осложнение беременности, формируется хроническая патология почек, гипертоническая болезнь, эндокринные нарушения (30). «Чистые» формы гестозов хуже поддаются лечению, чаще требуют досрочного прерывния беременности и сопровождаются значительно большей частотой развития тяжелых акушерских осложнений (32).

Также несомненным фактором риска возникновения гестоза является психосоциальный стресс (80) . Особенно заметно увеличение частоты гестоза в районах с неблагоприятными социально-экономическими и климатическими условиями, где это осложнение беременности формируется почти у половины беременных женщин (75).

Моносимптомный гестоз в виде гипертензии развивается у 5,7% беременных, сочетание гипертензии и отеков у 12,8%; гипертензии и протеинурии у 32,9%. У 48,6% пациенток с гестозом выявляется классическая триада симптомов (80).

Гестозы являются основной причиной перинатальной заболеваемости и смертности, которая варьирует от 10 до 30%о. Перинатальная смертность при неосложненной беременности составляет 7,01%о; а при гестозе достигает 28,9%о (52, 56). У каждого пятого ребенка, родившегося от матери с гестозом, имеются нарушения физического и психоэмоционального развития (31).

По современным представлениям, гестоз беременных - это осложнение беременности, обусловленное несоответствием возможностей адаптивных систем организма матери и потребностей развивающегося плода. Гестоз проявляется синдромом полиорганной недостаточности, который развивается вследствие беременности, и, как правило, исчезает после родоразрешения. Основными признаками гестоза являются патологическое увеличение массы тела, гипертензивный синдром, нарушение функции почек с развитием нефротического синдрома (протеинурия, гипоальбуминемия, гиперхолестеринемия и отеки), поражение печени, изменение в ЦНС и периферической нервной системе (57).

Несмотря на постоянное внимание к проблеме гестоза во всем мире, вопрос этиологии и патогенеза остается спорным. Существует около 40 теорий развития гестоза, который справедливо называют «болезнью теорий» (86). Ежегодно появляются все новые и новые теории развития гестоза. Все это говорит о том, что вопросы этиологии и патогенеза очень сложны. На настоящий момент ни одна из существующих теорий не может полностью объяснить причины развития этого тяжелого осложнения беременности.

Некоторые теории развития гестоза имеют лишь историческое значение.

К таким теориям относится инфекционная, предложенная В.В.Строгановым в конце 19 века, которая заключается в том, что пр№ беременности происходит отравление организма женщины веществами, поступающими из плодного яйца, и есть сходство между патоморфологической картиной эклампсии и инфекционного заболевания (71). Впоследствии эта теория не была подтверждена, т.к. не был выявлен инфекционный агент, первично вызывающий гестоз. Но, связанные с инфекционной теорией проблемы интоксикации актуальны и сегодня (12).

Другие авторы считали, что причиной возникновения гестоза является постепенно нарастающее нарушение водного обмена, влекущее за собой изменения функции, как желез внутренней секреции, так и паренхиматозных органов (9). Вода и является, по мнению В.Цангемейстера, тем самым «ядовитым веществом», которое так долго искали для объяснения возникновения поздних токсикозов беременности.

Также существует генетическая теория развития гестоза. Имеет место полигенная детерминированность гестоза, а также генетическая гетерогенность легкой и тяжелой форм данного осложнения беременности. Не вызывает сомнений участие определенных сочетаний генотипов матери и плода в развитии патологии. Исследователи выявили отчетливую взаимосвязь полиморфизма генов со степенью тяжести гестоза и наличием фоновых заболеваний. Неслучайная ассоциация с сочетанным и изолированным нетяжелым гестозом установлена для генов PLAT, PAL-1, TNFa. (46). Частота развития преэклампсии и эклампсии у сестер женщин, которые в прошлом перенесли эклампсию, составляет 58%, а у дочерей 48,9%; причем у первой дочери чаще, чем у второй (186). В других работах была доказана генетическая взаимосвязь между антигенами HLA матери и развитием гестоза. Установлено, что при гестозах чаще встречались антигены локуса А системы HLA: А1, A3, А9, А10 и антигены локуса В системы, HLA: В5, В7, В17, В27. Авторы считают, что при наличии данных антигенов системы HLA степень риска развития гестоза достаточно высока для прогнозирования гестоза (19). По данным Hayward и соавт. (1992) в развитии гестоза определенное значение имеет мутация генов, расположенных на 1, 9, 18 хромосомах, например, мутация гена, расположенного на 1 хромосоме и ответственного за регуляцию синтеза ангиотензина, может вызвать значительное усиление синтеза этого вазоактивного агента. Но, несмотря на кажущуюся очевидность генетической зависимости, полностью объяснить развитие гестоза только с точки зрения генетической теории не возможно, так как механизмы генетического контроля точно не установлены (125).

Существует кортико-висцеральная теория развития гестоза. Последователи этой теории считают, что ведущая роль в патогенезе заболевания лежит на ЦНС, и нарушение функции ЦНС ведет к нарушению нейроэндокринных механизмов адаптации, что, в свою очередь, ведет к изменению сосудистого тонуса, гемодинамическим расстройствам и в дальнейшем - к развитию хронического ДВС-синдрома (30).

Особенности синтеза и рецепции интерлейкина при беременности

Важнейшую роль в обеспечении репродуктивного процесса играют цитокины - гликозилированные пептиды средней молекулярной массы, выполняющие роль посредников межклеточных взаимодействий, регуляторов гемопоэза, являющихся эффекторами некоторых реакций иммунитета, посредниками между иммунной и другими системами организма (24, 89).

Основные функции цитокинов в репродукции можно определить как регуляция имплантации, роста плаценты и плода, продукции плацентарных гормонов и специфических белков, апоптоза клеток, усиленного надзора за микрофлорой репродуктивного тракта, подготовка к родам и развязывание родовой деятельности (85). Причем, на протяжении беременности значимость тех или иных факторов изменяется, что обусловлено особенностями этапов формирования плаценты и изменением популяционного состава клеток-продуцентов цитокинов в динамике гестационного процесса (85). Способностью к продукции цитокинов обладают большинство клеток периферической крови, а также эндотелиоциты, эпителиоциты, фибробласты (74) и, что особенно важно для репродуктивного процесса, клетки трофобласта и децидуальной оболочки (85,110,114,118,131,134,190).

Важнейшими свойствами цитокинов являются: избыточность, полифункциональность, плейотропность, синергизм, каскадность и антагонизм (85). Одни и те же цитокины могут вырабатываться различными типами клеток и не только клетками иммунной системы. С помощью технологии направленного удаления соответствующих генов ("knockout") было показано, что функции цитокинов часто дублируются, и выпадение функции конкретных цитокинов в большинстве случаев хорошо компенсируется (90). В связи с этим, уровень цитокинов в сыворотке крови не является абсолютным критерием оценки активности иммунного ответа. Эндокринное влияние цитокинов проявляется в основном лишь при генерализованных процессах, в то время как большая часть ответов проходит местно. Следует отметить, что эндокринным действием обладают лишь немногие из цитокинов - IL-1Р, IL-6, IFNy, TNFa (85).

Цитокины принимают непосредственное участие в подготовке эндометрия матки к имплантации, в формировании тканей эмбриона и модуляции активности трофобласта, в установлении взаимосвязей между организмами матери и плода, в регуляции всех этапов гестационного процесса. Как показал анализ данных, приводимых различными авторами, в момент имплантации, инвазии трофобласта, децидуализации клеток эндотелия и формирования полноценной плаценты большинство цитокинов выполняют не совсем обычные функции (93). Так, в этот момент не имеет смысла подразделять их на провоспалительные и противовоспалительные факторы, хемоаттрактанты и факторы роста, так как и те и другие, скорее всего можно было бы охарактеризовать как регуляторные цитокины, стимулирующие или блокирующие локальную пролиферативную, адгезивную, протеолитическую и т.д. активность клеток в отдельных участках маточно-плацентарного комплекса (68). По сравнению с другими тканями организма эндометрий матки обладает уникальными свойствами. В отличие от большинства клеток взрослого организма он способен восстанавливаться после каждого эндометриального цикла (104). Эндометрий человека включает железистый эпителий, строму и большое количество клеток костно-мозгового происхождения (лейкоциты), которые, как предполагается, очень важны для функционирования этой ткани (104). Кроме того, эндометрий является местом синтеза множества цитокинов, которые могут регулировать функцию лейкоцитов (180).Эндометрий /децидуальная оболочка способны имплантировать бластоцисту, обладает иммунологической толерантностью, регулирует инвазию трофобласта.

Уникальные функции децидуальной оболочки могут определяться этими мононуклеарными фагоцитами. Продуцируемые ими цитокины и простагландины необходимы, как посредники межклеточных взаимодействий (97), а разнообразные факторы роста определяют пролиферативную активность клеток и модификацию тканевых структур (178). Уникальным провоспалительным цитокином, способным стимулировать активность многих ТИПОВІ лейкоцитов в ходе воспаления и иммунного ответа, является интерлейкин-1 (IL-1) (79), который опосредует множество физиологических процессов, включая иммунные ответы, провоспалительные реакции, метаболизм, гемопоэз (118).

В настоящее время под названием IL-1 объединены два полипептида с молекулярной массой около 18 кД, обозначенные IL-la и EL-lp. IL-la представляет собой мембранную форму цитокина и лишь в незначительном количестве выбрасывается в межклеточное пространство; тогда как IL-ip чаще всего выявляется-в секретируемойг форме и обладает не только локальным, но и системным действием (24). Оба цитокина кодируются разными генами, но имеют гомологию в аминокислотной! последовательности 26%, обладают практически одинаковым спектром биологической активности и конкурируют за связывание с одними и теми же рецепторами. Кроме того, открыт третий белок со сходной структурой, имеющий примерно такую же гомологию с IL-la и IL-lp, как последние между собой, и обладающий способностью специфически связываться с рецепторами IL-1 без проявления биологической активности. Конкурируя с IL-1 за один и тот же рецептор, он блокирует биологическую активность IL-1 и, из-за наличия подобных свойств, получил название «рецепторный антагонист EL-1» (RaIL-І), но RaIL-1 не только не оказывает IL-1 подобного действия, но, наоборот, отменяет большинство его эффектов; Он рассматривается как перспективный противовоспалительный фактор локального действия. Представлены данные о гормональном котроле и эндометриальном происхождении IL-la и IL-lp и молекулы IL-1 -рецепторного антагониста (RaIL-І) в эндометриальной жидкости маточной полости в фазе аппозиции (96, 170).

IL-1 продуцируется главным образом антигенпрезентирующими клетками, к которым в первую очередь относятся моноциты и тканевые макрофаги. Моноциты являются одной из важнейших популяций лейкоцитов, определяющих инициацию адаптивных иммунных реакций благодаря способности к антигенной презентации и секреции провоспалительных цитокинов. Помимо этого моноциты, мигрируя в ткани, трансформируются в макрофаги и дендритные клетки. Также его образуют В-лимфоциты, клетки Лангерганса, глиальные эндотелиальные и синовиальные клетки, фибробласты, эпителий кожи и тимуса, а в культуре EL-1 могут образовывать и некоторые клоны Т- клеток. Условием выработки IL-1 моноцитами и макрофагами является их активация бактериальными и иными продуктами, а также вследствие адгезии и фагоцитоза (85).

Спектр клеток мишеней для IL-1 - активированные Т- и В- клетки, макрофаги, естественные киллеры, клетки эндотелия, мышц, хряща, базофилы, плазмоциты, кроветворные клетки. Действие цитокинов на клетки-мишени опосредовано специфическими рецепторами на внешней стороне плазматической мембраны (171). Взаимодействие цитокин-рецептор через ряд промежуточных этапов приводит к активации транскрипции определенных генов. В покоящемся состоянии лимфоциты и моноциты-макрофаги содержат на своей мембране небольшое число рецепторных молекул, как правило, недостаточное для развития полноценной реакции на цитокины (170). И лишь при активации клеток в результате усиления экспрессии генов число рецепторов на поверхности клеток увеличивается до необходимого уровня, а в составе некоторых рецепторов появляются дополнительные полипептидные цепи, обеспечивающие необходимое сродство к цитокину. IL-1 и его рецепторы с высокой аффинностью были идентифицированы на фетально-материнской границе раздела, что послужило основанием считать белки семейства IL-1 репродуктивной паракринной ауторегулирующей системой, выполняющей неиммунные функции в раннем гестационном периоде (171).

Методы исследования

Клинические, в том числе общепринятые лабораторные методы.

Ультразвуковое исследование беременных женщин проводилось на приборе ультразвуковой диагностики SSD-2000 фирмы «Алока Ко. ЛТД» (№ 94/167 - 1996., Япония). Расширенная фетометрия, эхографическая оценка плаценты и околоплодных вод проводилась по общепринятым стандартам.

Кардиотокография проводилась на аппарате Sonicaid Oxford с компьютерным анализом по критериям Dawes/Redman.

Иммунологические методы исследования.

Материалом для иммунологического исследования явилась периферическая кровь из локтевой вены беременных женщин в третьем триместре гестации, децидуальная ткань и ткань ворсинчатого хориона плаценты.

Венозную кровь брали в утренние часы (7-8 часов), натощак. Взятый биологический материал для проведения иммунологических исследований в течение часа доставлялся в лабораторию клинической иммунологии и генетики ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства имени В.Н.Городкова» Росздрава, зав. лабораторией д.м.н., проф. Сотникова Н.Ю. Часть взятого иммунологического материала (сыворотка венозной крови для проведения иммуноферментного анализа) хранилась в стерильных флаконах при температуре -20С до проведения исследования.

-Получение сыворотки периферической крови

Для исследования сывороточного содержания цитокина (IL-13), его рецептора и рецепторного антагониста, а также уровня AT против различных урогенитальных инфекций кровь в количестве 3 мл отбирали в сухую центрифужную пробирку, оставляли на 10-15 мин до полного свертывания, сгусток крови осторожно обводили по стенке пробирки длинной иглой и центрифугировали при 1500 об/мин 10 мин. Отделившуюся от сгустка сыворотку аликвотами по 200 мкл разливали в пробирки типа Эппендорф и хранили до проведения исследования в холодильнике при -20С. При необходимости хранения сыворотки более 1 месяца пробирки помещали в холодильник при -80С.

-Выделение мононуклеарных клеток

Для исследований методом проточной цитометрии и RT-PCR кровь забирали в центрифужные пробирки, содержащие 2,7% раствор ЭДТА из расчета 3 мл крови на 1 мл раствора ЭДТА. Выделение лимфоцитов и моноцитов из периферической крови осуществляли традиционным методом скоростного центрифугирования при 1500 об/мин в градиентах плотности фиколл-урографина (d-1,078).

Мононуклеарные клетки из децидуальной оболочки и из сосудов ворсинчатого хориона выделяли безферментативным методом (109), путем механического измельчения ткани гомогенизатором. Плаценту после родов помещали в охлажденный до 4С физиологический раствор и в течение 15-20 минут поставляли в лабораторию. Затем плаценту со стороны децидуальной оболочки тщательно отмывали от крови и срезали децидуальную ткань небольшими пластинками площадью 1-2 см . Кусочки ткани отмывали от крови и клеток трофобласта в большом объеме физиологического раствора при постоянном перемешивании на магнитной мешалке ММ2А (Laboratorni pristroje, Чехословакия) в течение 10-15 мин. Затем отмытые кусочки децидуальной ткани помещали в небольшие фарфоровые ступки и гомогенезировали ручным гомогенизатором DIAX 100 (Heidolph, Германия) до получения кашицеобразной массы. Полученную массу заливали 100 мл Среды 199 и перемешивали в течение 15 мин на магнитной мешалке. По радиусу плаценты вырезали сектор трофобласта объемом 2см -2,5см и гомогенезировали его ручным гомогенизатором DIAX 100 (Heidolph, Германия) до получения гомогенной массы. Полученную массу заливали 100 мл Среды 199 и перемешивали в течение 15 мин на магнитной мешалке. Полученные взвеси, содержащие клетки лейкоцитарного инфильтрата децидуальной оболочки и клетки, выделенные из сосудистого русла ворсинчатого хориона, фильтровали через 8 слоев плотной марли, клетки осаждали 5 мин центрифугированием при 1500 об/мин. Все выделенные клетки ресуспендировали в 6 мл Среды 199, наслаивали на градиент плотности фиколл-урографина (d-1,114) и центрифугировали при 1500 об/мин 30 минут. Жизнеспособность мононуклеарных клеток, определяемая по окрашиванию трипановым синим, составляла не менее 95%.

Разделение мононуклеарных клеток на фракции лимфоцитов и моноцитов/макрофагов производили методом адгезии монослоя моноцитов/макрофагов на пластике (22). С этой целью суспензию клеток в концентрации 2x10 кл/мл разливали по 1 мл в стерильные пластиковые чашки Петри диаметром 3 см, которые помещали в термостат на 1ч при 37С. При этом каждые 15 мин чашки Петри вынимали и 4-5 раз покачивали, добиваясь равномерного распределения клеток на пластике и создания оптимальных условий для адгезии моноцитов/макрофагов. После завершения инкубации, не прилипшие клетки, представленные на 98-100% фракцией лимфоцитов, смывали физиологическим раствором в центрифужные пробирки. Прилипшие к пластику клетки, представленные на 93-96% моноцитами/макрофагами, осторожно соскребали мягкими пластиковыми лопаточками и смывали физиологическим раствором в центрифужные пробирки. Пробирки с лимфоцитами и моноцитами/макрофагами центрифугировали при 1500 об/мин 5 мин. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляли.

Для проведения исследований в RT-PCR клетки лизировали в растворе, содержащем гуанидин тиоцианат, цитрат натрия, саркозил и 2-меркаптоэтанол, и хранили замороженными при -20С.

- Получение экстрактов децидуальной ткани и ворсинчатого хориона

Экстракты децидуальной ткани получали следующим образом: децидуальную ткань срезали небольшими пластинами площадью до 3 см и отмывали от крови и от клеток трофобласта физиологическим раствором, перемешивая на магнитной мешалке в течение 15 минут. Кусочки децидуальной ткани подсушивали на фильтровальной бумаге, взвешивали и гомогенизировали с использованием гомогенизатора до однородной массы. Для получения экстрактов ворсинчатого хориона вырезали сектор плаценты объемом 2см , кусочки взвешивали и гомогенизировали до однородной массы. К полученным гомогенатам добавляли PBS в объеме равном изначальному весу ткани (на 1 г ткани - 1 мл PBS). Взвесь помещали в пластиковые пробирки Falcon и подвергали замораживанию при -20С в течение суток. Гомогенат размораживали, фильтровали через 8 слоев плотной марли и ультрацентрифугировали 30 мин при 4000 об/мин при температуре +4С. Надосадочную жидкость разливали мелкими аликвотами и замораживали при -20С до проведения иммуноферментного анализа.

- Проточная цитофлюориметрия

Исследования методом проточной цитометрии производили в общей фракции мононуклеарных клеток (153). Поверхностную экспрессию CD121a и CD 12lb молекул и внутриклеточную экспрессию IL-ip определяли с помощью моноклональных антител (мАТ) методом двухцветной проточной цитофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, США). Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. При проведении проточной цитофлюориметрии клетки использовали в конечной концентрации 1 х 106 кл/мл. В работе использовали Анти-IL-ip мАТ (С ALT AG Laboratories, США), анти-CD121a и CD121b мАТ (BD Pharmingen, США).

-Определение содержания цитокинов и сывороточных протеинов методом ИФА

Продукция и рецепция интерлейкина-1(3 в периферической крови женщин с гестозом различной степени тяжести в третьем триместре гестации

Проведенные нами исследования характера инфицирования в группах женщин с гестозом различной степени тяжести показали, что во всех сравниваемых группах повышалась частота выявления маркеров урогенитальных инфекций. Это позволяет предположить, что гестоз развивается на фоне усиления иммунного ответа материнского организма на АГ вирусов и бактерий, что может приводить к изменению продукции и рецепции одного из самых важных провоспалительных цитокинов - IL-lp\

Нами проводилось исследование содержания IL-lp, рецепторного антагониста IL-ip и растворимой формы IL-1J3 рецепторов второго типа в сыворотке периферической крови беременных женщин с гестозом различной степени тяжести (таблица 4.1.1 .)

Результаты сравнительного анализа данных показали, что в целом для основной группы женщин с гестозом было характерно достоверное повышение содержания IL-lp в сыворотке периферической крови по сравнению с показателями контрольной группы - 129,96+21,62 и 42,02±7,67 соответственно (р 0,001). Независимо от степени тяжести гестоза во всех трех подгруппах достоверно повышалось содержание IL-Ір в сыворотке периферической крови по сравнению с показателями группы контроля. Так, в группе женщин с легким течением гестоза содержание IL-ip составило 116,5±29,74; в группе с гестозом средней степени тяжести - 149,39±48,75 (р 0,05 в обоих случаях); и в группе тяжелого гестоза - 127,4±30,5 (р 0,02). Достоверные различия в содержании IL-ip в сыворотке периферической крови в зависимости от степени тяжести гестоза между подгруппами отсутствуют (р 0,05 во всех случаях). Содержание рецепторного антагониста IL-1(3 в сыворотке периферической крови в основной группе женщин с гестозом было достоверно выше по сравнению с группой контроля - 423,76±48,73 и 295,29±37,46 соответственно (р 0,05). Уровень содержания рецепторного антагониста во всех подгруппах женщин с гестозом не имел достоверных различий по сравнению с показателями контрольной группы (р 0,05). Однако нами была отмечена выраженная тенденция к росту содержания IL-lRa с увеличением степени тяжести гестоза (р 0,05).

В основной группе женщин с гестозом достоверно выше было содержание в сыворотке периферической крови растворимой формы IL-ip рецептора второго типа по сравнению с показателями контрольной группы - 10,97±0,78 и 8,16±0,99 соответственно (р 0,05). Причем, необходимо отметить, что в 3 подгруппе этот показатель был выше по сравнению с контролем — 12,17±1,58. (р 0,05). Подгруппы основной группы достоверно не различались между собой (р 0,05), но необходимо отметить, тенденцию к повышению этого показателя с утяжелением гестоза.

Полученные результаты послужили основой для заявки на изобретение, на которую получена приоритетная справка №2006108979 от 21.03.2006. Уровень интерлейкина-1(3 в периферической крови может служить прогностическим критерием развития перинатального гипоксического поражения центральной нервной системы у новорожденного и при его значении 40 пкг/л, прогнозируют эту патологию с точностью 78,4%, чувствительностью 77,8%, специфичностью 80%.

Было проведено исследование содержания мРНК IL-1 (3 и рецепторов второго типа IL-1(3 моноцитами периферической крови женщин с гестозом различной степени тяжести методом полуколичественной R.T-PCR в реальном масштабе времени (рис.4.1Л., рис.4.1.2).

Как видно из представленного рисунка, моноциты периферической крови женщин основной группы с гестозом имели повышенный по сравнению с показателями контрольной группы уровень мРНК ГЬ-1(3 - 286,41±47,94 (р 0,001). Причем, в группе женщин, чья беременность осложнилась гестозом средней степени тяжести, этот показатель был выше по сравнению с контрольной группой - 340,52+97,03 (р 0,02). В группе женщин с легким гестозом уровень мРНК IL-lp составил 235,69±69,90; а в группе женщин с тяжелым гестозом -268,66±76,83 (р 0,05 по сравнению с группой контроля в обоих случаях). Между собой подгруппы женщин основной группы не имели достоверных различий (р 0,05).

При исследовании экспрессии мРНК рецепторов второго типа IL-lp моноцитами периферической крови женщин с гестозом различной степени тяжести (рис.4.1.2.) было выявлено, что в основной группе женщин достоверно повышался уровень мРНК IL-1(3 RII по сравнению с контрольной группой (р 0,01).

Следует отметить, что уровень мРНК был выше в 1 подгруппе женщин по сравнению с группой контроля (р 0,02). Необходимо отметить, что во 2 подгруппе этот показатель был достоверно ниже по сравнению с 1 подгруппой (р 0,05).

Исследование, проведенное методом проточной цитофлюорометрии (таблица 4.1.2.) показало, что в основной группе достоверно возрастал уровень периферических моноцитов, внутриклеточно синтезирующих IL-ір по сравнению с показателями контрольной группы - 51,19+1,5 и 40,96+1,7 соответственно (р 0,001). Независимо от степени тяжести гестоза во всех трех подгруппах наблюдалось достоверное повышение уровня периферических моноцитов, внутриклеточно синтезирующих IL-ip, по сравнению с показателями контрольной группы: так, в группе с легким гестозом - 48,93+2,52 (р 0,02); в группе с гестозом средней степени тяжести — 54,35±2,23 (р 0,001); и с тяжелым гестозом - 51,75+2,76 (р 0,01). Между собой все три подгруппы не имели достоверных различий в уровне периферических моноцитов, внутриклеточно синтезирующих IL-ip (р 0,05 во всех случаях). Одновременно в основной группе женщин с гестозом усиливалась экспрессия моноцитами IL-1J3 рецепторов второго типа (CD121b) по сравнению с показателями группы женщин с физиологическим течением беременности 31,77+1,2 и 25,73+1,07 соответственно (р 0,001). Экспрессия моноцитами IL-1(3 рецепторов второго типа (CD121b) в группе женщин с гестозом средней степени тяжести достоверно усиливалась по сравнению с группой контроля - 34,48±1,76 и 25,73±1,07 соответственно (р 0,001), и по сравнению с группой женщин, чья беременность была осложнена легким гестозом - 34,48±1,76 и 29,21±1,68 соответственно (р 0,05). В группе женщин, чья беременность была осложнена тяжелым гестозом, также достоверно усиливалась экспрессия моноцитами CD121b по сравнению с группой контроля - 33,01±2,8 и 25,73±1,07 соответственно (р 0,05); но содержание CD121b моноцитов при тяжелом гестозе достоверно не отличалось от такового у женщин с гестозом средней и легкой степени тяжести (р 0,05).

Также нами было проведено исследование содержания мРНК рецепторов первого и второго типа IL-lp лимфоцитами периферической крови женщин с гестозом различной степени тяжести методом полуколичественной RT-PCR в реальном времени (рис.4.1.З., рис.4.1.4).

Экспрессия мРНК рецепторов первого типа IL-1(3 лимфоцитами периферической крови (рис.4.1.3.) не имела достоверных различий между основной и контрольной группами (р 0,05).

Похожие диссертации на Роль провоспалительного цитокина интерлейкина-1[B] в патогенезе гестоза

Роль индукторов апоптоза TGF [B] 1 в развитии бесплодия, ассоциированного с наружным генитальным эндометриозом и трубно-перитонеальным факторомКирсанов Алексей Николаевич

Предикторы эпителиальных опухолей яичников, их роль в патогенезе, диагностике, тактике выбора объема оперативного лечения и прогнозеДигаева, Марет Ахмедовна

Роль хемокинов в патогенезе преждевременных родовТаланова Ия Евгеньевна

Роль цитокинов в патогенезе и диагностике гиперпластических процессов и рака эндометрияАхметова Елена Сергеевна

ПОВТОРНЫЕ ПОТЕРИ БЕРЕМЕННОСТИ:РОЛЬ ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОМЕТРИТА (ПАТОГЕНЕЗ И ДИАГНОСТИКА)Стрижова, Татьяна Владимировна

Роль естественных киллеров в патогенезе быстрого роста миомы матки, влияние агонистов гонадотропных рилизинг-гормонов на их содержание и функциональное состояниеЛицова, Анастасия Олеговна

Место и роль иммунной системы в патогенезе позднего гестоза и воздействие на нее с целью терапииЛипко, Оксана Петровна

Роль ароматазы p450 в патогенезе синдрома поликистозных яичниковСавина, Валентина Андреевна

Роль ароматазы р450 в патогенезе синдрома поликистозных яичниковСавина, Валентина Андреевна

Клиническая роль молекул адгезии в патогенезе и диагностике наружного генитального эндометриозаАнтонова, Светлана Олеговна