Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Проблема сниженного овариального резерва в программах экстракорпорального оплодотворения (обзор литературы) 12
1.1 Факторы, определяющие овариальный резерв 13
1.2 Маркеры сниженного овариального резерва 15
1.3 Современные представления о процессе фолликулогенеза 17
1.4 Современные представления о тактике ведения пациенток со сниженным овариальным резервом в программах ВРТ 23
1.5 Оценка транскрипционного профиля в кумулюсных клетках как метод определения качества ооцитов и эмбрионов 28
Глава 2. Материалы и методы исследования 35
2.1 Материал исследования 35
2.1.1 Анализ уровня экспрессии мРНК генов в кумулюсных клетках 37
2.2 Методы исследования 39
2.2.1 Общеклинические методы исследования 39
2.2.2 Гормональное исследование 40
2.2.3 Ультразвуковое исследование органов малого таза 42
2.2.4 Протокол программы ЭКО/ICSI 43
2.2.5 Манипуляции в программе ЭКО/ICSI 45
2.2.6 Эмбриологический этап в программе ЭКО/ICSI 46
2.2.7 Специальные методы исследования 47
2.2.8 Перенос эмбрионов в полость матки 49
2.2.9 Диагностика наступления беременности 49
2.2.10 Статистический анализ полученных данных 50
Глава 3. Результаты собственных исследований 52
3.1 Клинико-анамнестическая и лабораторная характеристики женщин со сниженным овариальным резервом 52
3.1.1 Данные анамнеза о ранее перенесенных гинекологических заболеваниях и оперативных вмешательствах 53
3.1.2 Данные анамнеза об особенностях репродуктивной функции 54
3.1.3 Данные анамнеза об особенностях ранее проведенного лечения 56
3.1.4 Гормональные и УЗ-параметры обследуемых женщин 57
3.2 Особенности лечения в программе ЭКО/ICSI у женщин со снижением овариального резерва 59
3.2.1 Характеристики стимуляции суперовуляции 59
3.2.2 Гормональный профиль в протоколах стимуляции функции яичников 60
3.2.3 Характеристики оогенеза и раннего эмбриогенеза у пациенток в исследуемых группах 63
3.2.4 Характеристика исходов программы ЭКО/ICSI 66
3.3 Анализ уровня экспрессии мРНК генов в кумулюсных клетках 68
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 76
Выводы 85
Практические рекомендации 87
Список сокращений 88
Список литературы 91
Приложение 110
- Современные представления о тактике ведения пациенток со сниженным овариальным резервом в программах ВРТ
- Оценка транскрипционного профиля в кумулюсных клетках как метод определения качества ооцитов и эмбрионов
- Гормональный профиль в протоколах стимуляции функции яичников
- Анализ уровня экспрессии мРНК генов в кумулюсных клетках
Современные представления о тактике ведения пациенток со сниженным овариальным резервом в программах ВРТ
«Волновая теория» роста фолликулов в яичниках явилась основой для проведения стимуляции суперовуляции не только в фолликулярной фазе, но и в лютеиновой фазе цикла в программах ВРТ [143].
Первоначально протокол стимуляции функции яичников в лютеиновой фазе менструального цикла был предложен при экстренном сохранении генетического материала у пациенток с онкологическими заболеваниями [130, 139].
Известно, что наиболее распространенным видом неоплазии среди женщин до 50 лет является рак молочной железы. Так, в течение 2012 года во всем мире было диагностировано 1,67 миллиона новых случаев этого заболевания, что составило 25% всех случаев рака, по данным ВОЗ [73, 149]. Таким образом, пациентки с раком молочной железы составляют 50% женщин, проходящих лечение с целью сохранения собственного генетического материала [18].
Рак молочной железы является эстрогензависимым, а стимуляция функции яичников приводит к повышению концентрации эстрадиола в 10-15 раз по сравнению с таковой в естественном цикле. Чтобы избежать гиперэстрогенемию у данной категории пациенток, были разработаны протоколы гонадотропной стимуляции в сочетании с тамоксифеном или ингибитором ароматазы– летрозолом [142, 124, 177]. Концентрация Е2 в таких протоколах ЭКО/ICSI не превышает ее пика в естественном цикле, и составляет около 1101-1285 пмоль/л [105].
Наиболее широко применяемый протокол стимуляции функции яичников у пациенток с раком молочной железы заключается в пероральном применении 5 мг летрозола со 2-3 дня цикла, далее на третий день приема летрозола, добавляется рекомбинантный ФСГ (рФСГ) в дозе от 150 до 300 МЕ / сут. При концентрации Е2 в сыворотке крови выше 250 пг/мл или достижении фолликулами более, чем 13 мм в диаметре, вводится антагонист гонадотропин-рилизинг гормона (антГнРГ) для профилактики преждевременного пика лютеинизирующего гормона (ЛГ). Для финального созревания ооцитов вводится триггер овуляции – агонист гонадотропин-рилизинг гормона (аГнРГ). Замена триггера овуляции на аГнРГ ведет к лютеолизу желтых тел, что проявляется снижением уровня половых стероидных гормонов, не оказывая влияние на количество получаемых зрелых ооцитов и частоту оплодотворения [74, 123].
Von Wolff M. и соавторы в ходе проспективного контролируемого мультицентрового исследования провели стимуляцию функции яичников в фолликулярной (I) и лютеиновой фазах (II) менструального цикла у 40 пациенток с различными онкологическими заболеваниями: лимфома Ходжкина (n=18), неходжкинская лимфома (n=2), рак молочной железы (n=13), карцинома прямой кишки, астроцитома, саркома и васкулиты (n=7). В группе пациенток, начавших стимуляцию суперовуляции в фолликулярной фазе (n=28), применяли стандартные протоколы с аГнРГ и антГнРГ, а в группе пациенток, вступивших в протокол стимуляции в лютеиновой фазе цикла (n=12), применяли протоколы с антГнРГ. Длительность стимуляции в I группе составила в среднем 10,6 дней, во II группе - 11,4 дней. Суммарная доза ФСГ составляла в среднем 2255 МЕ и 2720 МЕ, соответственно. Среднее количество полученных зрелых ооцитов при стимуляции в фолликулярной фазе составило 13,1±11,5, а при стимуляции в лютеиновой фазе цикла - 10,0±8,5; доля зрелых ооцитов составила 83,7% и 80,4%, соответственно. Однако, частота оплодотворения оказалась выше во II группе (75,6%) по сравнению с I группой (61,0%) [182].
В 2011г. Snmezer M. и др. опубликовали серию случаев начала стимуляции функции яичников в различных фазах менструального цикла: на 11-й, 14-й и 17-й менструальные дни цикла с использованием летрозола 2,5 мг/сут и рекомбинантного ФСГ 150 - 300 МЕ/сут у пациенток в возрасте от 26 до 29 лет с раком молочной железы. В качестве триггера овуляции использовали 250 мкг рекомбинантного хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) или 10000 МЕ мочевого ХГЧ. Пик уровня эстрадиола составил 499 пг/мл, 988 пг/мл, 478 пг/мл, соответственно. Было получено от 9 до 17 ооцитов, оплодотворение производилось методом инъекции сперматозоида в цитоплазму ооцита (ICSI). Процент зрелых ооцитов составил от 58,8% до 77,7%, частота оплодотворения составила от 69,2% до 87,5%, криоконсервировано от 7 до 10 эмбрионов. Авторами сделали вывод, что стимуляция функции яичников может быть начата в любой день цикла и не оказывает негативного влияния на эмбриологический этап программы ЭКО/ICSI [139].
Далее опыт стимуляции функции яичников в лютеиновой фазе менструального цикла у онкологических пациенток был перенесен на когорту пациенток с бесплодием. Так, в 2014 г. Kuang Y. и др. в рамках проспективного когортного исследования изучили возможность стимуляции функции яичников в лютеиновой фазе с помощью препаратом человеческого менопаузального гормона (ЧМГ) и летрозолом. В исследовании участвовали 242 пациентки в возрастном промежутке от 20 лет до 38 лет, проходивших лечение в программе ВРТ. В протоколе стимуляции суперовуляции применяли препарат ЧМГ в дозе 225 МЕ и летрозол 2,5 мг ежедневно после спонтанной овуляции. Введение летрозола прекращали при достижении фолликулами 12 мм в диаметре. В качестве триггера овуляции вводили 0,2 мг аГнРГ. У всех 242 женщин, включенных в исследование, успешно были получены ооциты. Среднее количество полученных ооцитов составило 13,1; у 227 женщин были получены эмбрионы высокого качества с последующей криоконсервацией (в среднем 4,8 эмбриона на один цикл). При проведении программы переноса размороженных эмбрионов частота имплантации cоставляла 40,37% (174/431), частота наступления клинической беременности – 55,46% (127/229), и прогрессирующая беременноcть составила 48,91% (112/229), частота родов живым плодом - 29,7% (68/229) [110].
Wang N. и др. исследовали эффективность стимуляции в лютеиновой фазе менструального цикла у пациенток с нормальным овариальным резервом. Для этого 2740 женщин были рандомизированы на следующие группы в зависимости от времени начала стимуляции: 1 - стимуляция функции яичников проводилась в протоколе с антГнРГ в лютеиновой фазе (n=708), 2 - стимуляция функции яичников проводилась по мягкому протоколу в фолликулярной фазе (n=745), 3 стимуляция функции яичников проводилась в протоколе с антГнРГ в фолликулярной фазе менструального цикла (n=1287). Количество зрелых ооцитов и эмбрионов высокого качества было значительно выше в I группе (10,9±7,6 и 4,6±4,3, соответственно) при cравнении со второй группой (3,7±3,0 и 1,8±1,8, соответственно, р 0,001), и с третьей группой (9,1±5,5 и 3,7±3,1, соответственно) (р 0,001). Однако суммарная доза использованных гонадотропинов оказалась выше в группе пациенток, стимулированных в лютеиновой фазе. Не выявлено существенных различий в частоте имплантации (35,5% и 34,8%, соответственно, р 0,05), частоте наступления беременности (46,2% и 43,7%, р 0,05), родов живым плодом и прогрессирующей беременности (44,4% и 41,7%, р 0,05) в результате переноса размороженных эмбрионов в группе пациенток, стимулированных в лютеиновой фазе и группе пациенток, стимулированных в фолликулярной фазе по мягкому протоколу, соответственно. Однако в группе женщин, стимулированных в лютеиновой фазе цикла, частота имплантации была выше по сравнению с группами пациенток, стимулированными в фолликулярной фазе (35,5% и 31,8%, соответственно, р=0,012). Частота наступления беременности (46,2% и 41,9%, р=0,041), родов живым плодом (44,4% и 39,2%, р=0,012) также оказалась выше по сравнению с группой стимуляции суперовуляции в протоколе с антГнРГ в фолликулярной фазе менструального цикла. По неонатальным исходам в трех группах статистической разницы не обнаружено. Авторами сделан вывод, что стимуляция в лютеиновой фазе менструального цикла также эффективна при лечении пациенток с нормальным овариальным резервом [183].
«Волновая теория» развития фолликулов в яичниках также явилась основой для проведения протоколов стимуляции суперовуляции в лютеиновой фазе менструального цикла у женщин со сниженным овариальным резервом [53]. Опираясь на данную теорию, Kansal K. и др. в ходе пилотного исследования сравнили результаты стимуляции суперовуляции в фолликулярной и лютеиновой фазах менструального цикла у 18 женщин (возраст 20-42 лет) с бедным ответом (наличие менее, чем 5 фолликулов в день введения триггера овуляции или получение менее 5 ооцитов в результате трансвагинальной пункции яичников). Проводилась стимуляция суперовуляции по стандартному протоколу с антГнРГ в фолликулярной фазе (п=9) и в середине лютеиновой фазы предыдущего менструального цикла (п=9). В результате статистически значимых различий по количеству полученных ооцитов, сывороточному уровню эстрадиола, частоте наступления клинической беременности и частоте родов живым плодом выявлено не было [138].
В 2014г. в результате пилотного исследования Kuang У. с коллегами введено понятие «двойная» стимуляция, подразумевающее стимуляцию в фолликулярной и в лютеиновой фазах одного менструального цикла. В рамках исследования «двойную» стимуляцию функции яичников проводили у 38 женщин (средний возраст=36 лет) со снижением овариального резерва в программе ЭКО/ICSI. По завершению стимуляции суперовуляции в фолликулярной фазе цикла проводилась первая трансвагинальная пункция яичников (ТВП), затем начинали протокол стимуляции функции яичников путем введения гонадотропинов и летрозола. Для финального созревания ооцитов вводился препарат аГнРГ. В результате было получено статистически значимо большее число ооцитов (1,7 ± 1,0 и 3,5 ± 3,2). Кроме того, количество зрелых ооцитов (МII) составило 1,4 ± 1,0 и 2,7 ± 2,7 (р=0,008), соответственно. В результате «двойной» стимуляции функции яичников было получено 167 ооцитов у 26 из 38 пациенток (68,4%), у 21 женщины была произведена криоконсервация от 1 до 6 эмбрионов, пригодных для последующего переноса в криопротоколе, в результате чего наступило 13 клинических беременностей. Результаты данного исследования доказали, что двойная стимуляция является эффективным подходом для лечения бесплодия у пациентов с бедным ответом на стимуляцию функции яичников [55].
Оценка транскрипционного профиля в кумулюсных клетках как метод определения качества ооцитов и эмбрионов
Влияние стимуляции функции яичников в лютеиновой фазе цикла на качество получаемых ооцитов и эмбрионов в программах ЭКО/ICSI является актуальной проблемой современной репродуктологии.
В рутинной практике оценка качества эмбрионов в основном проводится согласно морфологическим критериям, таким как скорость, своевременность и равномерность деления клеток, форма бластомеров, степень их фрагментации и другим [145]. Тем не менее, точность данного метода отбора эмбрионов недостаточно высокая, и в последние годы появляется все больше исследований, демонстрирующих недостаточную информативность оценки качества эмбрионов по морфологическим критериям [5,168].
В поисках новых малоинвазивных методик прогноза качества ооцитов и эмбрионов в программе ВРТ, ученые остановили свое внимание на дополнительных методах исследования, основанных на определении качества по уровню транскрипционной активности в кумулюсных клетках. Проведены исследования, свидетельствующие о том, что кумулюсные клетки могут быть использованы для определения качества ооцитов, анализа развития эмбриона и эффективности протокола стимуляции функции яичников [12,72,86]. Известно, что кумулюсные клетки, окружающие и питающие ооцит, образуются в процессе фолликулогенеза из низкодифференцированных предшественников - клеток гранулезы на этапе формирования полости внутри фолликула [119,127]. Кумулюсные клетки тесно связаны с ооцитом посредством специальных щелевых контактов, которые позволяют реализовывать метаболический обмен и транспортировку сигнальных молекул [36,118]. Таким образом, кумулюсные клетки: 1) координируют созревание ооцитов с ростом фолликулов; 2) оказывают влияние на ядерное и цитоплазматическое созревание ооцита; 3) обеспечивают энергией для возобновления мейотического созревания ооцита; 4) стимулируют гликолиз, аминокислотный транспорт и биосинтез стеролов [2,127].
По данным проведенных исследований показана корреляция уровня экспрессии мРНК потенциально значимых генов в кумулюсных клетках маркерами качества ооцитов, развития эмбрионов на предимплантационном этапе, и частотой наступления беременности [46,47,85,86,121]. В настоящее время среди генов, непосредственно участвующих в процессах фолликулогенеза и эмбриогенеза известны такие, как гиалуронан-синтаза-2 (HAS2), кальмодулин-2(CALM2), простагландин-синтетаза 2 (cyclooxygenase-2) (PTGS2 (COX2)), инозитол 1,4,5-трифосфат 3-киназа-А (ITPKA), гремлин-1 (GREM1), временный рецептор потенциал-зависимых катионных каналов, седьмой в подсемействе М (TRPM7), кластер дифференцировки-166 (CD166), синдекан-4 (SDC4), версикан (VCAN), супрессор цитокиновой сигнализации (SPSB2), р53-индуцируемый опухолевый белок 3 (TP53I3) [46,121].
Известно, что ген HAS2 (гиалуронан-синтаза-2) кодирует фермент, который необходим для процесса синтеза гиалуроновой кислоты кумулюсными клетками, которая в свою очередь является главным компонентом внеклеточного матрикса, связывающего вместе ооцит и кумулюсные клетки [45,100,186]. Гиалуроновая кислота имеет важное значение в процессах овуляции, оплодотворения и эмбриогенеза [52,71,89]. HAS2 участвует в стимуляции клеточной пролиферации, инициирует передачу внутриклеточной информации, а также участвует в процессе ангиогенеза и обладает иммунностимулирующим действием [108, 93, 48].
Ген COX2, также известный как простагландин-синтетаза 2 (PTGS2), играет важную роль в процессах овуляции, оплодотворения, имплантации и родах [20,120,157]. Экспрессия мРНК PTGS2 координируется ооцит-секретируемым паракринным фактором роста и дифференцировки – 9 (GDF9 – growth differentiation factor), и одновременно с HAS2 он участвует в передаче внутриклеточной информации и становлении внеклеточного матрикса [46,86,159].
Данные исследования McKenzie и др. показали повышение уровня экспреccии мРНК генов HAS2 и PTGS2 в кумулюсных клетках ооцитов, при оплодотворении которых развилиcь эмбрионы хорошего качества на 3-и сутки культивирования по сравнению с эмбрионами плохого качества [86].
Ген гремлин (GREM1) кодирует белок-антагонист костного морфогенетического белка, и является GDF9-зависимым геном [77, 78]. Установлено, что гремлин регулирует функцию кумулюсных клеток под контролем ооцит-секретируемых факторов (GDF9 и BMP15) посредством селективного ингибирования экспрессии костного морфогенетического белка [47, 77]. Тем самым, являясь селективным ингибитором BMP15 (bone morphogenetic protein 15), гремлин предотвращает преждевременную лютеинизацию клеток гранулезы [77].
В 2011 году Wathlet S. c соавторами провели анализ транскрипционнго профиля кумулюсных клеток в протоколах ЭКО/ИКСИ [46]. Первую группу составляли пациентки, которым проводился протокол с антГнРГ рекомбинантным фолликулостимулирующим гормоном (рФСГ), во вторую группу были включены пациентки, проходивших лечение в протоколе с аГнРГ и ЧМГ [46]. Была выявлена положительная корреляция уровня экспрессии мРНК генов ITPKA, CALM2 и TRPM7 с показателями морфологической оценки качества полученных эмбрионов на 3-и и на 5-е сутки развития. Также с использованием данного уровня в комплексе с уровнями экспрессии мРНК генов VCAN, PTGS2, ALCAM и GREM1 была создана прогностическая модель развития эмбрионов в протоколах стимуляции суперовуляции с антГнРГ и аГнРГ. В обеих группах исследования значимым для предикции особенностей развития и качества эмбрионов был отмечен уровень экспрессии мРНК генов TRPM7 и ITPKA, при прогнозировании наступления клинической беременности – уровень экспрессии мРНК гена VCAN. Чувствительность и специфичность модели cоставили более 70% и более 90%, соответственно [46].
ALCAM (молекула клеточной адгезии активированных лейкоцитов) или CD166 (кластер дифференцировки-166), является мембранным белком, участвующим в регуляции клеточной сигнализации и в связывании клеток между собой и с внеклеточным матриксом [16,17]. Данный белок экспрессируется в кумулюсных и гранулезных клетках в период овуляции [71], а также в эпителиальных клетках эндометрия и бластоцистах [84]. Известно, что ALCAM участвует в процессе миграции лейкоцитов в очаг воспаления и повреждения тканей [94,185]. Полагается, что процессы овуляции фолликула и имплантации эмбриона приводят к активации процессов, схожих с ответом на воспалительную реакцию, что сопровождается проницаемости сосудов эндометрия в области имплантации эмбриона [45,131,162,183]. Данные зарубежной литературы показывают, что ALCAM с помощью связывания с Т-лимфоцитами посредством рецептора CD6 участвует в активации иммунного ответа [31,84]. Следует отметить, что в результате исследования Francisco и др. было обнаружено значительное повышение уровня экспрессии мРНК гена ALCAM в клетках эндометрия у женщин с бесплодием при проведении контролируемой индукции овуляции (КИО) по сравнению с женщинами, не проходившими КИО [37]. Так, предполагается, что КИО может непосредственно влиять на иммунный ответ в эндометрии.
Ген версикан (VCAN) кодирует белок, относящийся к семейству протеогликанов, и является одним из основных компонентов внеклеточного матрикса [24]. Этот белок участвует в процессах адгезии и пролиферации клеток, а также в процессах дифференцировки и миграции клеток, ангиогенеза, апоптоза, и выполняет чрезвычайно важную роль в формировании структуры тканей и стабилизации белков внеклеточного матрикса [33,158,171]. Wathlet S. и др. по данным своего исследования выявили ассоциацию уровня экспрессии мРНК VCAN с качественными характеристиками ооцитов в программе ЭКО/ICSI [46]. Отмечалось значимое снижение уровня экспрессии мРНК VCAN в клетках кумулюса зрелых ооцитов, находившихся в стадии MII (метафаза второго мейотического деления) [46]. Тем временем по результатам работы Gebhardt и др. отмечено значимое повышение уровня экcпреccии мРНК гена VCAN клетках кумулюса ооцитов, перенос эмбрионов от которых в результате привел к наступлению клинической беременности и живорождению, однако исследователи не выявили корреляцию с качеством эмбрионов согласно критериям морфологической оценки [85]. Однако, данные исследования Wathlet S. и др. показали отсутствие значимой разницы по уровню экспрессии мРНК VCAN у женщин с наcтупившей беременностью и у женщин с отсутствием наступления беременности [46]. Аналогичные данные были представлены в исследовании Burnik-Papler и др., которыми также не было выявлено корреляции показателем наступления клинической беременности и уровнем экспрессии мРНК VCAN в клетках кумулюса [151].
Ген синдекан-4 (риудокан) (SDC4) кодирует белок, являющийся трансмембранным гепарансульфатным протеогликаном, который функционирует в качестве рецептора для передачи внутриклеточной информации. Известно, что SDC4 играет немаловажную роль в воспалительной реакции и в процессе ангиогенеза [153], а также ингибирует апоптоз клеток, опосредованный фактором некроза опухоли [152].
По данным литературы известно, что синдекан-4 может выполнять несколько биологических функций, включая пролиферацию клеток и повышение антикоагуляционной активности; он также вовлечен в процесс созревания фолликулов и участвует в процессе овуляции [144].
Гормональный профиль в протоколах стимуляции функции яичников
Характеристика протоколов стимуляции функции яичников в программе ЭКО/ИКСИ представлена в таблице 10. При анализе лечебных циклов не выявлено статистически значимых различий в продолжительности стимуляции суперовуляции, стартовой и суммарной дозе гонадотропина.
Так стартовая доза гонадотропина составила 252,4±71,8 МЕ у женщин I группы, 248,7±95,7 МЕ и 249,6±87,4 МЕ - во Па и Пб подгруппах; суммарная доза гонадотропинов - 2185,7±634,7 МЕ, 2230,5±515,2 МЕ и 2260,3±425,3 МЕ, соответственно, (р 0,05). Длительность стимуляции суперовуляции не зависела от фазы менструального цикла и составила у пациенток I группы 9,8±1,7 дней, у пациенток Па и Пб подгрупп (в протоколе «двойной» стимуляции) - 9,6±1,3 дней при стимуляции в фолликулярной фазе цикла и 9,9±1,6 дней (при стимуляции в лютеиновой фазе цикла), (р 0,05).
В таблице 11 представлены данные гормонального профиля в протоколах стимуляции суперовуляции.
Данные таблицы 11 показывают, что в день начала стимуляции и суперовуляции и день ТВП пациентки I группы, а также Па и Пб подгрупп не имели значимых различий в уровне ФСГ (10,07±3,73 МЕ/л, 8,85±2,82 МЕ/л и 9,48±4,28 МЕ/л), (14,48±3,7 МЕ/л, 15,05±4,4 МЕ/л и 15,05±4,4 МЕ/л), соответственно, (р 0,05).
Концентрация ЛГ на протяжении всей стимуляции суперовуляции не имела межгрупповых различий и соответствовала нормативным значениям (р 0,05).
Анализ уровня Еі в сыворотке крови, соответствующий дню начала стимуляции суперовуляции, выявил его статистически значимое повышение у пациенток Пб подгруппы (в протоколе «двойной» стимуляции в лютеиновой фазе цикла) по сравнению с аналогичными значениями у женщин I группы в стандартном протоколе стимуляции и у пациенток Па подгруппы в протоколе «двойной» стимуляции в фолликулярной фазе цикла (р 0,001).
Независимо от проводимого протокола и фазы менструального цикла отмечено постепенное возрастание уровня сывороточного Е2, сопровождающего рост фолликулов, который на день ТВП у пациенток I группы составил 1600,54±858,53 МЕ/л, у женщин Па подгруппы - 1362,92±770,45 МЕ/л, у женщин Пб подгруппы - 1234,96±952,79 МЕ/л и не имел значимых различий(р 0,05).
Уровень прогестерона был значимо выше (16,7±13,27 нмоль/л, (p 0,001)) у пациенток Пб подгруппы по сравнению с аналогичными значениями гормона у женщин I группы и Па подгруппы, не только в день начала стимуляции суперовуляции, но и на 6-й день лечения (10,66±13,4 нмоль/л, (p 0,001), что объясняется продолжающейся гормональной активностью желтых тел. Однако, в день введения триггера овуляции концентрация прогестерона у женщин обследуемых групп выравнивалась до сопоставимых значений, что вероятно связано с угасанием активности желтых тел к этому периоду времени. Независимо от фазы проведения стимуляции функции яичников концентрация прогестерона в сыворотке крови имела сопоставимые значения у женщин обследуемых групп, составляя 3,49±3,62 нмоль/л в I группе, 3,83±4,9 нмоль/л и 5,65±4,58 нмоль/л во Па и Пб подгруппах (р 0,05). Таким образом, сравнительный анализ гормональных параметров стимуляции суперовуляции в стандартном протоколе с антГнРГ и протоколе двойной стимуляции не выявил значимых различий в динамике концентраций ФСГ и ЛГ, но продемонстрировал, что стимуляция функции яичников в лютеиновой фазе менструального цикла сопровождается статистически значимым повышением уровня Е2 и прогестерона по сравнению с аналогичными параметрами стимуляции суперовуляции в фолликулярной фазе менструального цикла. Однако в день ТВП в лютеиновой фазе менструального цикла уровень этих стероидных гормонов не имел значимых различий у женщин всех обследуемых групп.
Анализ уровня экспрессии мРНК генов в кумулюсных клетках
Для выполнения сравнительного анализа уровня экспрессии мРНК генов в кумулюсных клетках из общей выборки случайным образом было отобрано 40 пациенток, которые были разделены на две группы с учетом фазы менструального цикла, во время которой проводилась программа ЭКО/ICSI: I группа (п=17) -стимуляция суперовуляции проводилась в фолликулярной фазе, II группа (п=23) -индукция функции яичников проводилась в лютеиновой фазе менструального цикла в рамках двойной стимуляции суперовуляции.
Отобранные пациентки были сопоставимы по возрасту и ИМТ. Так, средний возраст женщин в I группе исследования составил 35,32±4,3 лет, во II группе -35,11±3,2 лет, ИМТ - 21,4±2,2, и 21,2±3,1, соответственно.
Все пациентки имели одинаковую продолжительность стимуляции суперовуляции, которая составила 9,6±1,3 дней в I группе, 9,7±1,4 дней - во II группе. По суммарной дозе гонадотропина группы также были сопоставимы: 2153,4±534,1 ME в I группе и 2189,72±604,3 ME - во II группе исследования.
Среднее число ооцитов на день ТВП в группах статистически значимо не различалось и составило 3,6±1,9 в группе стимуляции в фолликулярной фазе, 4,2±2,0 в группе стимуляции в лютеиновой фазе менструального цикла. Количество бластоцист составило 1,6±1,4 и 1,9±1,8, соответственно.
Все кумулюсные клетки были разделены на 2 группы в зависимости от фазы проведенной стимуляции функции яичников.
I группа - ооциты, полученные в протоколе в фолликулярной фазе (70 образцов), II группа - ооциты, полученные в протоколе в лютеиновой фазе «двойной» стимуляции (90 образцов), из исследования выбыло 4 образца второй группы, в связи неудовлетворительным качеством РНК.
В рамках исследования с целью выявления взаимосвязи уровня экспрессии мРНК генов и показателей качества эмбрионов независимо от фазы проведения программы ЭКО/ICSI, полученные кумулюсные клетки были разделены на 3 группы согласно морфологическим критериям оценки качества эмбрионов: 1 группа – кумулюсные клетки от эмбрионов отличного качества (n=42), 2 группа – кумулюсные клетки от эмбрионов хорошего качества (n=43), 3 группа – кумулюсные клетки от эмбрионов удовлетворительного качества (n=17). Из данного этапа исследования были исключены 58 образцов, из которых 16 – кумулюсные клетки незрелых ооцитов, 23 – кумулюсные клетки неоплодотворившихся ооцитов, и 19 – кумулюсные клетки остановившихся в развитии эмбрионов.
Данные проведенного анализа образцов представлены в таблице 14. Выявлено статистически значимое повышение уровня экcпреccии мРНК генов VCAN, SDC4, и TP53I3 в клетках кумулюса во 2 группе исследования (р=0,003, p=0,005 и p 0,001, соответственно). Полученные данные демонстрируют отсутствие негативного влияния протокола стимуляции функции яичников в лютеиновой фазе менструального цикла у женщин со сниженным овариальным резервом на потенциал развития ооцитов.
Согласно представленным данным, в кумулюсных клетках эмбрионов хорошего качества было выявлено статистически значимое повышение уровня экспрессии мРНК генов HAS2 в 1,8 раза, VCAN в 2 раза и PTGS2 в 2,9 раз (р=0,001), и снижение уровня мРНК гена ITPKA в 1,9 раза (р=0,020).
С целью выявления молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с качеством эмбрионов согласно морфологическим критериям оценки на 3-и и 5-е cутки культивирования, методом логистической регрессии нами была поcтроена модель, иcходом в которой являлаcь переменная, характеризующая получение эмбрионов хорошего качества, предикторами – уровни экспрессии мРНК генов HAS2, PTGS2, VCAN.
Уравнение дискриминирующей (классифицирующей) функции имело вид: z = 1,786 ln[HAS2] +0,925 ln[PTGS2]+1,55 ln[VCAN] – 1,351 (формула 3), где [HAS2], [PTGS2], [VCAN] – нормированные уровни экспрессии соответствующих генов относительно референсных генов B2M, GUSB, TBP, рассчитанные с помощью метода сравнения пороговых циклов (Ср).
Наибольший вклад в уравнение дискриминирующей функции внес ген VCAN. Данный маркер может быть использован в качестве независимого маркера для оценки качества эмбрионов у женщин со снижением овариального резерва. При уровне отсечки положительного результата 2,46 о.е. чувствительность и специфичность метода составили 90,5% и 70,6%, соответственно, значение площади под ROC-кривой AUC=0,845±0,064, (p=3,7 10-5), что незначительно уступало критерию интегральной оценки (рисунок 9).
При анализе частоты наступления клинической беременности в случаях переноса эмбрионов хорошего качества статистических различий между обследуемыми группами выявлено не было (p=0,08). В группе стимуляции суперовуляции в фолликулярной фазе беременность наступила в 23,8% (5 пациенток), в группе стимуляции в лютеиновой фазе в 33,3% случаев переноса эмбрионов (7 пациенток).
Таким образом, результаты данного этапа исследования позволяют заключить, что стимуляция суперовуляции в лютеиновой фазе менструального цикла не оказывает отрицательное влияние на потенциал развития ооцитов и качество эмбрионов, что подтверждается высоким уровнем экспрессии мРНК генов.
Наряду с этим уровни экспрессии мРНК генов VCAN, HAS2 и PTGS2 могут быть использованы как предикторы эмбрионов хорошего качества в программах ЭКО/ICSI у женщин со сниженными параметрами овариального резерва.