Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Роль внутриутробных инфекций в структуре неонатальной заболеваемости и смертности.
1.2. Внутриутробная инфекция: возбудители наиболее значимых перинатальных инфекций, их распространенность, особенности жизненного цикла и значимость в перинатологии .
1.3.Внутриутробная инфекция. Морфофункциональные из менения в системе «мать-плацента-плод».
1.4.Механизмы защиты плода от инфицирования. 33
1.5. Диагностика и прогнозирование внутриутробных инфекций. 44
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 53
2.1. Ретроспективный анализ распространенности носительства возбудителей перинатально значимых инфекций.
2.2.Оценка роли пренатального скрининга в прогнозе течения неонатального периода.
2.3. Основные группы проспективного исследования. 56
2.4. Методы получения образцов сыворотки, пуповинной сыворотки и околоплодных вод. 64
2.5. Методы исследования содержания иммунорегуляторных белков. 64
2.6. Методы статистического анализа. 65
ГЛАВА 3. Частота выявления носительства возбудителей перинатально значимых инфекций у беременных юга Кузбасса и оценка их значимости при внутриутробном инфицировании .
3.1. Частота выявления перинатально значимых инфекций у беременных женщин юга Кузбасса за период 2009-2013гг.
3.2 Оценка роли возбудителей пренатально значимых инфекций при внутриутробном инфицировании.
3.3. Структура носительства возбудителей скрытых перинатально значимых инфекций матерей с ВУИ новорожденных .
ГЛАВА 4. Клиническая характеристика групп обследованных 82
4.1. Характеристика состояния здоровья беременных групп наблюдения по анамнестическим данным.
4.2. Анализ течения беременности у беременных групп наблюдения.
4.3. Анализ течения родов и послеродового периода у беременных групп наблюдения .
4.4. Характеристика состояния здоровья новорожденных в группах сравнения.
ГЛАВА 5. Регуляторно-транспортные белки и белки беременности у беременных группы риска внутриутробных инфекций новорожденных
5.1. Содержание белков в венозной крови матери (38-40 нед). 113
5.1.1 Содержание белков семейства макроглобулинов, лактоферрина и 113
а1-антитрипсина в крови беременных при риске развития ВУИ новоро жденных.
5.1.2. Содержание трофобластического 1-гликопротеина и альфа-1- фетопротеина в крови рожениц, имеющих возбудителей перинатально значимых инфекций.
5.1.3 Коррелятивные взаимосвязи между изученными показателями. 127
5.2. Иммунорегуляторные белки и белки беременности в пуповинной сыворотке новорожденных от матерей с носительством возбудителей перинатально значимых инфекций.
5.3 Содержание уровней регуляторно-транспортных белков в около- плодных водах беременных с носительством возбудителей перинаталь-но значимых инфекций.
5.4.Изменения цитокинового профиля у носительниц IgG антител к Chlamydia trachomatis в оценке риска внутриутробных инфекций ново-рожденных и прогнозе инфекционных осложнений неонатального пе-риода.
ГЛАВА 6. Содержание а2-МГ, ЛФ и альбумина в крови и около- плодных водах рожениц при микст- носительстве возбудителей пе-ринатально значимых инфекций .
ГЛАВА 7. Создание прогностического алгоритма риска развития внутриутробных инфекций, осложненного инфекционным процес-сом раннего неонатального периода у новорожденных, от матерей с носительством возбудителей перинатально значимых инфекций.
7.1.Предикторы внутриутробной инфекции. 163
7.2. Построение модели прогностического алгоритма риска развития внутриутробных инфекций у новорожденных от матерей с носительст-вом возбудителей перинатально значимых инфекций.
7.3. Итоговое уравнение логистической регрессии при расчете риска развития внутриутробных инфекций, осложненного течения раннего неонатального периода у новорожденных от матерей с носительством возбудителей перинатально значимых инфекций.
7.4. Расчет экономической эффективности метода. 178
Глава 8. Обсуждение 182
Выводы 194
Практические рекомендации 197
Список сокращений 198
Список литературы
- Внутриутробная инфекция: возбудители наиболее значимых перинатальных инфекций, их распространенность, особенности жизненного цикла и значимость в перинатологии
- Методы получения образцов сыворотки, пуповинной сыворотки и околоплодных вод.
- Структура носительства возбудителей скрытых перинатально значимых инфекций матерей с ВУИ новорожденных
- Анализ течения родов и послеродового периода у беременных групп наблюдения
Введение к работе
Актуальность проблемы
Внутриутробные инфекции (ВУИ) являются значимой причиной репродуктивных потерь и заболеваемости новорожденных. Уровень внутриутробных инфекций в России продолжает неуклонно расти: на долю инфекционно-воспалительных заболеваний приходится 20–38% в структуре перинатальной патологии новорожденных со значительным количеством тяжелых, инвалиди-зирующих форм. Частота ранней неонатальной смертности достигает 27%, а мертворождаемость – 10,5–16%. (Стрижаков А.Н., Давыдов А.И., 2009; Голева О.П., Богза О.Г., 2013). Для антенатальной и интранатальной диагностики внутриутробной инфекции применяются комплексные подходы, включающие целый ряд диагностических процедур, однако они выявляют либо сам факт наличия патогена в активной или персистирующей форме у матери, либо косвенные признаки внутриутробного инфицирования, что не означает неизбежного развития инфекционного заболевания плода и новорожденного. В среднем, частота развития инфекционного процесса с манифестацией заболевания составляет около 12–14% от всех случаев внутриутробного инфицирования (Феофанова Ц.Ю., 2004; Заплатников А.Л. и соавт., 2005). Прямая антенатальная диагностика внутриутробной инфекции с использованием высоко технологичных инвазивных методов (кордоцентез, амниоцентез, биопсия хориона или плаценты) применяется крайне редко из-за большого числа противопоказаний и возможности осложнений беременности. Комплексные диагностические подходы, включающие, помимо клинических и ультразвуковых, иммунологические исследования, направленные на определение различных маркеров внутриутробных инфекций, в том числе, цитокинов (IL-1, TNF-, IL-18) у матери, часто учитывают показатели с большой индивидуальной вариабельностью, что также не позволяет с высокой долей вероятности прогнозировать внутриутробную инфекцию новорожденного при внутриутробном инфицировании (Мазепки-
на И.Н., 2013). В этой связи, вопросы антенатальной и интранатальной диагностики внутриутробных инфекций у новорожденных являются, по-прежнему, актуальной задачей в акушерстве (Островская О.В., 2009).
Таким образом, существует необходимость разработки малоинвазивных методов антенатального и интранатального прогнозирования, позволяющих на этапе беременности и/или родов оценить не столько наличие возбудителя, сколько риск развития инфекционного заболевания плода и новорожденного, осложнений нео-натального периода. Перспективным представляется изучение факторов с относительно небольшой индивидуальной вариабельностью, ассоциированных с внутриутробной инфекцией, динамика которых отражает развитие инфекционно-воспалительных процессов фетоплацентарного комплекса и позволяет оценить повреждающее воздействие на плаценту и плод на различных стадиях гестации. К числу подобных факторов относится ряд полифункциональных белков, изменение содержания которых в организме беременной опосредовано, с одной стороны, функциональной активностью фетоплацентарного комплекса, а с другой – развитием компонентов воспалительной реакции в организме беременной. В их числе регуляторно-транспортные белки: альфа-2-макроглобулин (2-МГ), ассоциированный с беременностью альфа-2-гликопротеин (АБГ), а также лактоферрин (ЛФ), альфа-1-антитрипсин (1-АТ) и альбумин.
Необходимо учитывать, что для эффективной диагностики и прогноза внутриутробной инфекции необходимо как можно глубже изучить особенности патогенеза процессов, происходящих при инфицировании различными возбудителями, с позиций персонифицированной медицины и индивидуального определения риска внутриутробной инфекции.
Степень разработанности темы исследования
Универсальные высокоинформативные методы антенатальной и интрана-тальной диагностики внутриутробной инфекции фактически отсутствуют – применяются комплексные подходы, малоэффективные при отсутствии выраженных клинических проявлений инфекции у матери. При ВУИ, как правило, изучается патогенез микст-инфекции, без учета комплексного либо разнона-4
правленного влияния особенностей жизнедеятельности различных возбудителей на патогенез ВУИ (Кулаков В.И., Манухин И.Б., Савельева Г.М., 2006; Под-золкова Н.М., Скворцова М.Ю., Мельникова Н.И., Острейков И.Ф., 2009). Попытки изучения диагностической и прогностической роли регуляторно-транспортных белков предпринимались неоднократно, изучено содержание ЛФ (Крот И.Ф., 2008; Белкова Т.Н., Долгих Т.И., Тирская Ю.И., 2012) в крови беременных с активным инфекционным процессом у матери, однако изучения 2-МГ и 1-АТ в венозной, пуповинной крови или околоплодных водах беременных групп риска, как и комплексного изучения уровней различных белков в зависимости от типа возбудителя, особенно при малосимптомном или бессимптомном носительстве возбудителей инфекции при беременности, не проводилось.
Цель исследования: пренатальное прогнозирование внутриутробных инфекций и осложненного течения раннего неонатального периода на основе изучения уровней регуляторно-транспортных белков в крови и околоплодных водах матери, пуповинной сыворотки новорожденного.
Для достижения поставленной цели определены следующие задачи исследования:
-
Изучить частоту, структуру и динамику носительства возбудителей инфекций или антител к ним у беременных юга Кузбасса за 2009–2013 гг.
-
Выявить группы высокого риска по ВУИ среди беременных с носитель-ством возбудителей перинатально значимых инфекций на основании ретроспективного анализа историй развития новорожденных с ВУИ и историй родов.
-
Оценить значимость пренатального УЗ скрининга второго триместра беременности и возможность использования эхографических признаков в качестве предикторов ВУИ при носительстве возбудителей перинатально значимых инфекций.
-
Исследовать изменения содержания регуляторно-транспортных белков (ЛФ, а2-МГ, АБГ, а1-АТ, альбумина) и фетоплацентарных белков (РАРР-А, ТБГ и АФП) в сыворотке крови беременных при носительстве Staphylococcus
aureus, Candida albicans, наличии IgG к Herpes simplex 1,2, IgG к Chlamydia trachomatis и определить их значимость в прогнозе ВУИ.
-
Установить диагностическое значение содержания 2-МГ, 1-АТ и ЛФ в пуповинной крови новорожденных при ВУИ.
-
Определить пороговые значения концентрации 2-МГ, ЛФ и альбумина в околоплодных водах рожениц основных групп наблюдения (носительство Staphylococcus aureus, Candida albicans, наличие IgG к Herpes simplex 1,2, Chlamydia trachomatis) при риске ВУИ.
7. Изучить особенности изменений регуляторно-транспортных белков (2-
МГ, ЛФ, 1-АТ и альбумина) в крови и околоплодных водах рожениц при различ
ных вариантах mixt-носительства изученных возбудителей перинатально значи
мых инфекций или антител к ним (IgG к Herpes simplex 1,2, Chlamydia trachomatis,
носительство Staphylococcus aureus, Candida albicans), а также возможность ис
пользования полученных результатов в пренатальном прогнозе ВУИ.
8. Разработать патогенетически обоснованный комплексный алгоритм
прогноза ВУИ, течения неонатального периода новорожденных, родившихся от
матерей с носительством возбудителей перинатально значимых инфекций.
Научная новизна исследования
При изучении частоты и структуры носительства возбудителей перинатально значимых инфекций и антител к ним у беременных юга Кузбасса за 2009-2013гг. выявлено прогрессирующее увеличение числа беременных с наличием IgG к Chlamydia trachomatis и носительством Candida albicans.
Ретроспективный анализ носительства возбудителей перинатально значимых инфекций при беременности позволил выявить группы риска по развитию ВУИ – это беременные с наличием IgG к Herpes simplex 1,2, IgG к Chlamydia trachomatis, с носительством Candida albicans, Staphylococcus aureus и с mixt-носительством возбудителей.
Впервые при ВУИ изучены изменения концентраций регуляторно-транспортных белков в венозной крови беременных с носительством Candida albicans, Staphylococcus aureus, при наличии IgG к Chlamydia trachomatis, IgG к
Herpes simplex1,2. Выявлено значимое повышение уровня ЛФ во всех группах исследования, за исключением беременных с IgG антителами к Herpes simplex1,2, у которых отмечено снижение уровня ЛФ. У беременных с IgG к Chlamydia trachomatis установлено повышение концентрации 1-АТ, 2-МГ.
Впервые в пуповинной крови новорожденных с ВУИ при носительстве во время беременности Candida albicans выявлено значимое повышение уровня 2-МГ и 1-АТ; снижение уровня ЛФ во всех группах наблюдения, за исключением детей от матерей с IgG к Chlamydia trchomatis.
Впервые установлено, что в околоплодных водах рожениц с наличием IgG антител к Chlamydia trachomatis, IgG к Herpes simplex1,2 и носительством Candida albicans при ВУИ новорожденных значимо повышаются уровни 2-МГ и альбумина, а также снижаются концентрации ЛФ. Установлено, что при наличии высокоавидных IgG антител к Herpes simplex 1,2 наблюдается тотальный дефицит иммунорегуляторного ЛФ не только в сыворотке крови беременных, но и в околоплодных водах.
Впервые установлено, что mixt-носительство возбудителей инфекций может оказывать комплексное воздействие на уровни иммунорегуляторных белков крови беременных, нивелируя различия, характерные для моно-носительства возбудителей перинатально значимых инфекций и IgG к ним.
Сравнительный анализ концентраций белков семейства макроглобулинов и лактоферрина в сыворотке крови беременных и околоплодных водах рожениц при рождении здоровых детей, и детей с ВУИ, позволил высказать научную гипотезу о патогенетической роли данных белков в развитии внутриутробных инфекций: изменение содержания иммунорегуляторных ЛФ, 2-МГ и 1-АТ является наиболее вероятной причиной изменений связанных с ними провоспа-лительных факторов в т.ч. цитокинов. Кроме того, дефицит ЛФ в ОВ, обладающего антибактериальной и противовирусной активностью, с нарастанием концентраций регуляторно-транспортного 2-МГ за счет явлений экссудации, способствует распространению инфекции.
Впервые разработан алгоритм антенатального и интранатального персонифицированного прогнозирования риска внутриутробных инфекций новорожденных в неонатальном периоде жизни, основанный на математической модели уравнения логит-регрессии, с учетом изменений уровней регуляторно-транспортных белков, позволяющий с достаточно высокой вероятностью оценить риск развития внутриутробной инфекции и осложненного инфекционным процессом течения раннего неонатального периода у новорожденных от матерей с наличием IgG антител, носительством возбудителей скрытых перинатально значимых инфекций.
Практическая значимость исследования
Полученные результаты работы позволяют улучшить прогнозирование риска внутриутробных инфекций и осложненного течения раннего неонаталь-ного периода у новорожденных от матерей с наличием IgG антител, бессимптомным носительством возбудителей перинатально значимых инфекций, особенно при работе с «практически здоровыми» беременными, что позволяет понять причины аномального течения родового акта, дает возможность оптимизировать ведение беременности и родов, снизить лекарственную нагрузку на беременную, исключить стационарную помощь при признаках (по данным УЗИ) внутриутробного инфицирования, но без риска (по данным прогностического алгоритма) развития внутриутробной инфекции, своевременно оказать специализированную помощь новорожденным с высоким риском инфекционных осложнений в раннем неонатальном периоде и, таким образом, снизить уровень инвалидизации и смертности детей.
Установленные зависимости концентраций иммунорегуляторных и транспортных белков (2-МГ, ЛФ, альбумина) в околоплодных водах, от вида возбудителя, степени распространенности инфекционного процесса в фетопла-центарном комплексе, а также от исхода родов позволяют использовать данные белки в мониторинге беременных с внутриутробным инфицированием и риском внутриутробной инфекции новорожденных, в качестве значимых предикторов разработанной компьютерной программы. Использованный методический подход к разработке программы «Расчет риска инфекционной патоло-
гии раннего неонатального периода» позволяет оценивать индивидуальную вероятность развития внутриутробной инфекции новорожденных у каждой конкретной беременной и роженицы с точностью диагностики до 92,6%.
Методология и методы исследования
Объектом исследования в диссертационной работе являлись особенности изменений белкового профиля у беременных с наличием IgG антител, носитель-ством возбудителей перинатально значимых инфекций без клинических проявлений заболевания, относящихся к группе риска рождения детей с внутриутробной инфекцией, что формирует проблемное поле и поэтому подлежит изучению. Предметом исследования являлись изменения содержания регуляторно-транспортных белков в венозной крови беременных, в околоплодных водах рожениц и пуповинной крови новорожденных, позволяющие оценить риск рождения детей с ВУИ. Исследование проводилось в период 2009–2013 гг., в клиниках г. Новокузнецка Кемеровской области. При написании работы в методологическом плане применялась совокупность общенаучных и специальных методов. В числе общенаучных методов использовались теоретические методы: восхождение от абстрактного к конкретному, заключавшееся в выявлении наиболее распространенных форм носительства возбудителей скрытых инфекций за 5-летний период, затем выделение наиболее значимых возбудителей в плане риска рождения детей с ВУИ и последующим разделением по группам (бактерии, вирусы либо грибки, моно- либо mixt-носительство) и исходу родов (дети с ВУИ/без ВУИ) для выявления особенностей патогенеза внутриутробных инфекций (влияние носительства возбудителей инфекций или антител к ним на проницаемость плацентарного барьера, а также развитие бессимптомного воспаления, иммуно-дефицитного состояния) и общих факторов риска в прогнозе ВУИ новорожденных. Кроме того, применялся метод формализации, заключавшийся в разработке математической модели с учетом значимых клинических и лабораторных показателей для объективизации оценки риска ВУИ новорожденных при отсутствии клинических признаков инфекции у матерей во время вынашивания беременности. Из экспериментальных методов исследования использовались: метод
наблюдения (ретроспективное изучение распространенности носительства возбудителей инфекций и антител к ним за 5-летний период, анализ анамнеза и данных клинико-лабораторного обследования беременных, рожениц, а также исхода родов и состояния новорожденных групп высокого риска ВУИ), метод эксперимента (изучение сывороточного содержания регуляторно-транспортных белков в образцах венозной крови беременных, околоплодных вод рожениц и пуповинной крови новорожденных), метод сравнения (анализ лабораторных данных в зависимости от вида возбудителя или их сочетания у беременных групп высокого риска при рождении здоровых детей и детей с ВУИ, коррелятивный анализ результатов исследования). Из эмпирически-теоретических методов использовались методы аналогии, индукции и дедукции (сравнение полученных результатов с опубликованными данными других авторов, позволяющее выдвинуть ряд предположений по различиям в патогенезе ВУИ при наличии антител, носитель-стве различных возбудителей перинатально значимых инфекций без клинических признаков заболевания у беременных, а также по наличию общих тенденций и изменений, позволяющих сформировать обобщенные рекомендации по прогнозу ВУИ у новорожденных от матерей с наличием антител, носительством возбудителей скрытых инфекций и тактике ведения группы риска).
Положения, выносимые на защиту:
1. Наиболее часто за 2009–2013 гг. у беременных юга Кузбасса выявлялось наличие G-антител к Herpes simplex 1,2 (807), Rubella (806) и Cytomegalovirus (628). Установлено увеличение числа беременных с наличием IgG к Chlamydia trachomatis: при частоте среди беременных в 207, темп изменения за пять лет +128,5%. Частота носительства во время беременности Candida albicans составила 211, темп изменений +36,6% и Staphylococcus aureus – 183, без динамики за 2009-2013гг. Наибольший риск развития ВУИ установлен у беременных с наличием IgG к Herpes simplex 1,2, с IgG к Chlamydia trachomatis, носительством Candida albicans, Staphylococcus aureus и с mixt-носительством возбудителей перинатально значимых инфекций.
-
Предикторами ВУИ являются: в венозной сыворотке крови беременных уровни ЛФ>4,5мг/л и альбумина <38г/л при наличии у беременных IgG к Chlamydia trachomatis, носительстве Staphylococcus aureus, Candida albicans и mixt- носительстве, дополнительными предикторами ВУИ – концентрации 1-АТ>3,4г/л и 2-МГ>2,8г/л при наличии у матери IgG к Chlamydia trachomatis, а также ЛФ<3,5мг/л при IgG антителах к Herpes simplex 1,2; в сыворотке пуповинной крови новорожденных концентрация ЛФ<2,5 мг/л за исключением детей от матерей с IgG к Chlamydia trchomatis, а также 2-МГ>3,0г/л и 1-АТ>3,6г/л при носительстве беременными Candida albicans; в околоплодных водах рожениц уровни ЛФ<5мг/л, 2-МГ>0,060г/л и альбумина>2,2 г/л, кроме рожениц с носительством Staphylococcus aureus, у которых содержание 2-МГ и альбумина неизменно.
-
Выявленные изменения изученных показателей и коррелятивных взаимосвязей подтверждают активное участие иммунорегуляторных белков в развитии внутриутробных инфекций и позволяют усовершенствовать прогнозирование течения раннего неонатального периода новорожденных, путем создания высокоэффективной компьютерной программы расчета риска ВУИ, течения неонатального периода.
Апробация работы
Основные результаты работы доложены на 18-й международной конференции «Внутриутробное детство – основа здоровья человека» 23–25 апреля 2014 г. в г. Кемерово; на 19-й международной конференции «Достижения и проблемы репродуктивной медицины» в г. Кемерово 2–3 апреля 2015 гг.; на 8-м общероссийском семинаре «Репродуктивный потенциал России: версии и кон-траверсии» 5–8 сентября 2015 г. в г. Сочи.
Диссертационная работа обсуждена на заседании апробационной комиссии ГБОУ ДПО «Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей» Минздрава России 26.06.2015, протокол № 5.
Публикации
Печатных работ по данной теме в журналах, сборниках и материалах российских и международных конференций – 19, в том числе в журналах из перечня ВАК Минобрнауки РФ – 13 работ.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования и вытекающие из них практические рекомендации внедрены в лечебную практику клинических родильных домов №1, №2, №3 МБЛПУ «Зональный перинатальный центр» г. Новокузнецка, а также в учебный процесс кафедры акушерства и гинекологии ГБОУ ДПО НГИУВ Минздрава России.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав, посвященных анализу данных, полученных в ходе работы, заключения с анализом результатов исследования, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 189 страницах машинописного текста, иллюстрирована 54 таблицами, 34 рисунками. Библиография включает 174 литературных источника, из них 121 отечественных и 53 зарубежных авторов.
Внутриутробная инфекция: возбудители наиболее значимых перинатальных инфекций, их распространенность, особенности жизненного цикла и значимость в перинатологии
В течение ХIX века наука об инфекциях развилась в традиционную научную отрасль, давшую начало важным открытиям и направлениям, в том числе в области акушерства и гинекологии (Ткаченко Р.А., Каминский В.В.,2014). Были раскрыты специфические проблемы в области бактериологии нормальной влагалищной флоры, микробиома человека, инфекций генитальной области и таких их последствий, как тяжелые дисфункции репродуктивной системы, акушерские инфекции и их последствия для матери и плода (ТкаченкоР.А., Каминский В.В.,2014).
Согласно литературным данным, 14,4-22,5% детей внутриутробно инфицируются различными микроорганизмами (Павлов О.Г., 2010). Инфекционный процесс у плода и новорожденного могут вызвать самые разнообразные возбудители: вирусы, бактерии, простейшие, грибы, условно-патогенная флора (Садова Н.В., и др., 2013). По данным современной литературы, преобладающими возбудителями антенатальных внутриутробных инфекций считаются мико-плазмы и вирусы (цитомегалия, вирус простого герпеса, гриппа и др.), а интра-натальных - хламидии и микробная инфекция (стрептококк, листерии, условно-патогенные микроорганизмы) (Шакина И.А., 2010;. Ахмедова Д.И., Даминов Т.О., Агзамова Ш.А., 2009). В 2012 г. Агзамова Ш.А, выявила, что частота ин-фицированности возбудителями TORCH инфекций у рожениц, по результатам ПЦР, составляет: для ЦМВ - 51,9%, ВПГ 1, 2 типов - 44,7%, Ch. trachomatis -13,6% и Ur. urealyticum - 6,8% и, соответственно, у новорожденных - 18,5%, 14,8%, 9,2% и 0,5%.
Высокая частота инфекций перинатального периода напрямую связана с увеличением количества инфицированных женщин репродуктивного возраста: на сегодняшний день количество серопозитивных по цитомегаловирусной инфекции составляет от 60 до 90%, в зависимости от региона и социально-экономических условий жизни (Ткаченко Р.А., Каминский В.В., 2014) По дан-17
ным литературы, практически все население земли (до 90% детей и подростков в возрасте до 15 лет) инфицировано герпетической инфекцией или является ви-русоносителями (Ткаченко Р.А., Каминский В.В., 2014; Гетиа Т.Б., 2010; Островская О.В., и совт., 2013)
В последние годы особую значимость для беременных и новорожденных приобретают такие «новые» антропозоонозные инфекции, как листериоз, хла-мидиоз и др., относящиеся к классу сапронозов. Хламидийная инфекция у молодых женщин в развитых странах является наиболее распространенной среди заболеваний, передающихся половым путем (Howie S.E., et. al., 2011). По данным ВОЗ, ежегодно регистрируется 90 миллионов больных, инфицированных хламидиями (Taylor B.D. 2011, Torre E., 2009). Хламидиоз обнаруживается в 1,5 раза чаще, чем гонорея, и в 7,4 раза чаще, чем сифилис (Ткаченко Р.А., Каминский В.В.2014). Частота инфицирования беременных женщин хламидиями колеблется в пределах 10-40%, при осложненном гинекологическом анамнезе -49-63% (Кулаков В.И., Манухин И.Б., Савельева Г.М., 2009).
Следует подчеркнуть возросшую роль условно-патогенной микрофлоры, особенно грамотрицательных бактерий и облигатно анаэробных бактерий, что обусловлено широким применением антибиотиков, подавляющих аэробную флору (Taylor B.D., 2011). По мере адаптации микробов к применяемым антибиотикам, меняется антигенная структура циркулирующих штаммов, возникают принципиально новые формы микробов, продуцируются дефектные частицы вирусов с неполным набором белков и ферментов, возникают мутантные штаммы (Абаев Ю.К., 2007; Добрецова Т.А.,Маклецова С.А.,2014). При этом нарушается естественный микробиоценоз человека, повышается агрессивность таких микробов как кишечная палочка, микоплазмы, стрептококки, грибы рода кандида и др. (Абаев Ю.К., 2007). У плода нет защиты против этих микроорганизмов, поэтому создаются предпосылки для развития генерализованного инфекционного процесса, который в неонатальном периоде может проявиться в виде сепсиса, пневмонии, менингита (Сергеева В.А., 2004; Островская О.В.,2009). Среди частых возбудителей остаются стафилококки, представленные, в основном, тремя видами: S. aureus, S. Epidermidis (около половины всех высевов стафилококков), а также S.warnerii. Существенно изменилась их антибио-тикочувствительность: практически все выделяемые штаммы устойчивы к полусинтетическим пенициллинам (nature.web.ru).
При анализе этиологической структуры при внутриутробных инфекциях выявлено возрастание частоты кандидозной инфекции. Характерной чертой этой группы микробов, как и хламидий, является их способность к длительному внутриклеточному паразитированию, преимущественно в клетках гистиоци-тарно-макрофагальной системы организма хозяина, что создает реальную угрозу раннего формирования хронического или персистирующего процесса в организме ребенка (Урывчиков Г.В., 2002). Не случайно, отличительной чертой кандидоза и хламидиоза у новорожденных является не тяжесть состояния, обусловленная инфекционным токсикозом, а прогрессивность поражения органов и систем, малосимптомность течения, толерантность к рутинным методам терапии. Тяжесть этих инфекций нередко определяется частотой осложнений, а не непосредственной угрозой развития летального исхода (Бочарова И.И., 2008).
В целом, резко выросла роль заболеваний, передаваемых половым путем (свыше 20 различных возбудителей). Некоторые из них, такие как хламидии, герпес, грибы рода Candida постепенно вытесняют возбудителей классических бактериальных болезней (сифилис, гонорея, трихомониаз и др.) как в плане значимости, так и в плане частоты случаев. Этих возбудителей, считающихся вторым поколением микроорганизмов, передаваемых половым путем, зачастую трудно идентифицировать, а вызываемые ими инфекции труднее лечить. Необходимо отметить, что подавляющее число внутриутробных инфекций относятся к оппортунистическим, клинические проявления которых становятся возможными только на фоне нарушения иммунного ответа. Поэтому риск развития внутриутробных инфекций у новорожденных связан не столько с острыми инфекционными заболеваниями у женщин во время беременности, сколько с наличием у них хронической патологии (герпес-инфекция, хламидиоз и др.) и различных осложнений беременности (Agrawal T., 2008). Важно отметить, что особенностью этиологической структуры заболеваний в акушерстве и перина-тологии в настоящее время являются различные ассоциации микроорганизмов: вирусно-бактериальные, вирусно-вирусные, бактериально-бактериальные. (Шакина И. А.,2010). В структуре антенатальной смертности вследствие внутриутробной инфекции 27,2% приходится на вирусную инфекцию, 26,3% - на смешанную и 17,5% - на бактериальную (Стрижаков А.Н., Давыдов А.И,. 2009). Вирус простого герпеса (ВПГ) также представляет большую опасность для нормального развития плода: по тератогенной активности из всех вирусов его превосходит только вирус краснухи. Благодаря сложной стратегии противоборства и ускользания от иммунной системы хозяина, ВПГ может длительно находиться в организме: он способен депонироваться в латентном состоянии в нейронах, индуцировать явления иммуносупрессии, являясь слабым индуктором интерферона, а также способствовать образованию внутриядерных включений и гигантских клеток, оказывая выраженное цитопатическое действие (Пирогова З.И., Рябчук Ф.Н., 2011). Вирус может сохраняться в нервных клетках регионарных ганглиев чувствительных нервов в виде вирионов пожизненно (Никульшина Л. Г., Воротынцева Н. С., Никульшин А.А. 2014). При первичном герпесе риск внутриутробного инфицирования составляет 30-50%, при рецидивирующем герпесе — 3-7%. На ранних сроках беременности вирус простого герпеса становится причиной самопроизвольного аборта в 30% случаев, в третьем триместре в 50% случаев преждевременные роды. У 40% выживших новорожденных внутриматочное инфицирование ведет к развитию латентного носительства с появлением дисфункциональных расстройств в более позднем возрасте, при этом от матерей с бессимптомными или нетипичными формами заболевания больные дети рождаются в 70% случаев. По исходам герпесвирус-ную инфекцию следует отнести к патологии, определяющей как качество жизни ребенка, так и прогноз его жизнедеятельности (Валеева Г.Р., 2011). При генерализованной форме происходит диссеминация и трансмиссия вируса во все органы: ЦНС, надпочечники, лёгкие и др., что приводит к развитию острой нейроинфекции, вирусного пневмонита или геморрагической пневмонии, кровоизлияниям, нарушениям функций печени Начальные симптомы могут появиться в течение 24 часов после рождения, хотя диагноз может быть поставлен только на 2-й неделе жизни (Кудашов Н.И. 2009), при этом кожные поражения в виде везикул у 1/3 больных могут не быть, температурная реакция не характерна (Чандра В.Ш 1994). При отсутствии специфической терапии, генерализованная герпетическая инфекция или тяжёлая нейроинфекция у новорождённых может привести в 80 % случаях к смерти, а при выживании у 50 % младенцев могут быть тяжёлые последствия: гемипарезы, судороги и др. (Володин Н.Н., Дементьева Г.М. Никонов А.П. и др., 2001; Чугунова Л. А., 2010). Проспективные наблюдения показали, что, у 5–15% детей с внутриутробной герпетической инфекцией, в более поздние сроки диагностируются различного рода отклонения: тяжелая энцефалопатия, гидроцефалия, микроцефалия, дефекты слуха, зрения, врожденные пороки сердца, отставание в умственном развитии, нарушения поведения, гемморагический синдром, слепота, глухота, эпилепсия, ге-патоспленомегалия (Дроздова С.Г. и соавт., 2002; Никульшина Л. Г., Воротын-цева Н. С., Никульшин А.А. 2014).
Методы получения образцов сыворотки, пуповинной сыворотки и околоплодных вод.
Для проведения лабораторных исследований получены образцы венозной крови (в сроках беременности 38-40 недель) из локтевой вены в объеме 5,0 мл, которые затем центрифугировались при 1500 об/мин. Отделенная таким образом сыворотка крови использовалась для проведения анализов. Для увеличения сопоставимости результатов анализы проводились одномоментно – сначала образцы замораживали и хранили при 20С, а затем размораживали и проводили исследования.
Образцы пуповинной крови получены в естественных родах после отделения ребенка от пуповины. Полученные образцы также центрифугировали и замораживали вплоть до полного сбора коллекции.
Получение образцов околоплодных вод осуществлялось во время родов при самопроизвольном излитии. В случае попадания проводной крови материал исключался из коллекции. Образцы разводились равным объемом фосфатно-солевого буферного раствора, содержащего 0,1% Тритона Х-100, центрифугировались при 3000 об/мин, надосадок замораживался и хранился вплоть до проведения одномоментного исследования. Полученный результат лабораторного исследования умножали на 2.
Исследования проводились на базе НИЛ иммунологии (заведующий лабораторией – профессор, д.б.н. Зорин Н.А.) ГБОУ ДПО НГИУВ (ректор – профессор, д.м.н. Колбаско А.В.).
Концентрации а2-МГ и а1-АТ в сыворотке крови рожениц и пуповинной крови новорожденных, а также АБГ в сыворотке крови рожениц, определялись методом количественного низковольтного ракетного иммуноэлектрофореза (с увеличением длины канавки и расстояния между канавками для предотвращения смешивания образцов) с использованием моноспецифических поликло-нальных кроличьих антисывороток против данных белков с применением блоков питания и камеры для горизонтального электрофореза (Ирбис, Белоруссия). Использовались сконструированные de novo на базе НИЛ иммунологии НГИУВа под руководством проф. Н.А. Зорина исследовательские тест-системы, проверенные на чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов при помощи соответствующих методов и сертифицированных калибраторов.
Для определения а2-МГ в околоплодных водах использовался метод твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с применением исследовательских тест-систем, произведенных на базе НИЛ иммунологии НГИУВа.
Уровни альбумина в сыворотке крови и пуповинной сыворотке определяли колориметрическим методом с использованием реагента «бромкрезоловый зеленый» (тест-системы Spinreact, Испания) на проточном биохимическом анализаторе (Awareness, США), а в околоплодных водах – модифицированным методом ракетного иммуноэлектрофореза с использованием моноспецифических поликлональных кроличьих антисывороток.
Содержание АФП, ТБГ, РАРР-А, лактоферрина в сыворотке крови рожениц, а также содержание лактоферрина и АФП в пуповинной сыворотке плода определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих тест-систем (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск).
Измерение и обработка всех результатов ИФА проводились при помощи оборудования BioRad (Microplate Reader, model 3550).
Для статистического анализа полученных количественных результатов исследования применяли лицензионную версию сертифицированной РС программы для биостатистики InStat 2.0 (Instat Biostatistics, Intuitive Software for Science (GraphPad, США). В зависимости от ее результатов, парное межгруппо-65 вое сравнение показателей проводилось с применением параметрического (по критерию Стьюдента) либо непараметрического вариантов t-статистики. Соответственно, корреляционный анализ проводился по критерию Пирсона (Pearson) или Спирмана (Spearman).
Параметры, приводимые в работе: M – среднее, m – ошибка средней, n – объем анализируемой выборки, r- коэффициент корреляции, p – достигнутый уровень значимости. либо при помощи непараметрического теста, Минимальное значение уровня значимости – 0,05.
Сравнение распространенности TORCH-инфекций за ряд лет проведено с помощью критерия 2. Критический уровень значимости различий p=0,05.
Нормальность распределения проверялась с помощью критерия Колмогорова-Смирнова (DKS). Для сравнения признаков, распределение которых отлично от нормального, применялся критерий Манна-Уитни (U). Для построения модели применялась логистическая регрессия, статистическая значимость влияния отдельных переменных оценивалась с помощью критерия Вальда. Для построенной модели рассчитывались следующие показатели качества: показатель согласия модели и реальных данных Хосмера-Лемешова (Hosmer and Le-meshow Goodness-of-Fit Test), показатель AUC (площадь под ROC кривой), коэффициент конкордации, коэффициент связи D-Зоммера. Для оценки качества модели были построены ROC кривые на обучающем и тестовом множествах. Минимально допустимый объем выборки рассчитывался на основе коэффициент детерминации. Оптимальная точка разбиения определялась с помощью J-статистики Юдена.
Структура носительства возбудителей скрытых перинатально значимых инфекций матерей с ВУИ новорожденных
За период 2009-2013гг на территории юга Кузбасса зарегистрировано 64324 родов (2010г - 16003, 2011г - 15373, 2012г - 16633, 2013г - 16315), из них 37809 (47,3%) женщин прошли обследование по пренатальному скринингу и скринингу Torch-инфекций в ЦОЗСиР МБЛПУ «Зональный перинатальный центр» (2009г – 7680, 2010г - 7310, 2011г – 7914, 2012 – 7505, 2013г - 7400).
По результатам пренатального скрининга 240 (1,7%) беременных имели патологию кариотипа плода, в том числе синдром Дауна - 21 (1,5%), синдром Эдвардса – 18 (1,3%), синдром Патау - 9 (0,7%), все беременности прерваны.
По результатам ультразвукового исследования у 34035 (52,9% от числа родивших) беременных были выявлены эхографические признаки внутриутробного инфицирования (ВУИ): варикозное расширение сосудов плаценты (37,5%), многоводие (81,8%), гиперэхогенные включения в структуре плаценты (56,1%), отек плаценты (50,0%), преждевременное созревание плаценты с ее истончением (28,6%), ЗВУР (47,3%), несоответствие толщины плаценты сроку гестации (21,6%), повышение тонуса миометрия (29,3%), кальциноз плаценты (14,3%), кисты плаценты (6,8%).
Из 37809 обследованных беременных методом ИФА, у 14254 (37,7%) женщин проведено молекулярно-биологическое обследование (исследование ДНК/РНК возбудителя, ПЦР позитивность- 94,2%).
Выявлено: У 35228 (94%) беременных имелись IgG антитела к Herpes simplex-1,2. Обследованы методом ПЦР 9254 (26,3%) женщины. ПЦР позитивны 100%. У 18565 (52,7%) обнаружены признаки внутриутробного инфицирования (многоводие -74,4%; отек плаценты -57,8%; кисты плаценты -5.5%). Отсутствие признаков внутриутробного инфицирования - у 16663 женщин (47,3%)
У 9070 (24%) беременных выявлены IgG антитела к Chlamydia trachomatis. Обследованы методом ПЦР 4294 (47,3%) женщины. ПЦР позитивны 86,6%. Признаки внутриутробного инфицирования при УЗИ (многоводие -74,4%; гиперэхогенные включения в структуре плаценты -66,1 %, ЗВУР -47,8 %, преждевременное созревание плаценты с ее истончением -38,1 %), имели 3691 беременных (40,7 %). Отсутствие признаков внутриутробного инфицирования - у 5379 (59,3%) беременных женщин.
Носительство Staphylococcus aureus выявлено у 7961 (21%) беременных, из них с признаками внутриутробного инфицирования - 1862 (23,4 %), в т.ч. выявлено варикозное расширение сосудов плаценты (67,5 %), многоводие (91,8 %), несоответствие толщины плаценты сроку гестации (31,4 %). ЗВУР -41,3 %. Отсутствие признаков внутриутробного инфицирования - у 6099 (76,6 %) беременных женщин данной группы.
Носительство Candida albicans обнаружено у 9201 (24,3%), методом ПЦР обследовано 1990(21,6%) беременных. ПЦР позитивны 96,6%. Выявлены признаки внутриутробного инфицирования (преждевременное созревание плаценты с ее истончением - 48,6 %, ЗВУР -67,7 %, многоводие -72,8 %) у 2723 женщин (29,6%). Отсутствие признаков внутриутробного инфицирования зафиксировано у 6478 (70,4%) беременных женщин.
Наличие IgG антител к Rubella выявлено у 3531(9,3%), с признаками внутриутробного инфицирования (многоводие- 44,4%) было 692 (19,6%) беременных женщин. Отсутствие признаков внутриутробного инфицирования - у 2839 (80,4 %) беременных женщин.
У 27430 (72,5%) беременных выявлено наличие IgG антител к Cytomega-lovirus. Обследованы методом ПЦР 8907 (32,5%) женщин. ПЦР позитивны 92,4%. Признаки внутриутробного инфицирования (многоводие- 44,4%) были у 4772 (17,4%), отсутствие признаков внутриутробного инфицирования зафиксировано у 22658 (82,6%) беременных женщин; Наличие IgG антител к Toxoplasma gondii обнаружено у 11910 (31,5%) беременных женщин, с признаками внутриутробного инфицирования (преждевременное созревание плаценты с ее истончением - 18,2 %; многоводие- 14,4%) было 524 беременных (4,4%), отсутствие признаков внутриутробного инфицирования - у 11386 (95,6 %) женщин.
У 8230 беременных женщин выявлено наличие IgG антител к Ureaplasma urealiticum. Обследованы ПЦР 6190 (75,2%) женщин. ПЦР позитивны 95,4%. Признаки внутриутробного инфицирования - у 510 (6,2%), отсутствие признаков внутриутробного инфицирования - у 7720 (93,8%) беременных женщин.
Таким образом, при скрининговом обследовании беременных на носи-тельство возбудителей перинатально значимых инфекций, TORCH-комплекса и ультразвуковой скрининг состояния плода выявлено, что наибольшее количество женщин это беременные с IgG антителами к Herpes simplex-1,2 (до 94%), и с IgG антителами к Cytomegalovirus (до 72,5%), причем признаки внутриутробного инфицирования во время беременности значительно чаще развиваются при наличии IgG антител к Herpes simplex-1,2, (более половины беременных) и составляют 52,7%. При наличии IgG антител к Cytomegalovirus этот процент был на уровне 17,4. Несмотря на меньшее количество беременных с IgG антителами к Chlamydia trachomatis (24%), признаки внутриутробного инфицирования выявлены в 40,7% случаев. Носительство Candida albicans и Staphylococcus aureus также сопряжено с внутриутробным инфицированием и достигает 29,6% в первом случае и 23,4% во втором. Обращает на себя внимание разнообразие клинических проявлений внутриутробного инфицирования, но наиболее значимыми являются многоводие (до 81,8%) и ЗВУР (до 67,3%). ПЦР верификация возбудителей проведена у 37,7% беременных от всех обследованных методом ИФА на наличие антител к возбудителям Torch-инфекций, позитивность составила в среднем 94,2%.
Анализ течения родов и послеродового периода у беременных групп наблюдения
Концентрации а2-МГ более 3,5 г/л обнаруживались в 12 % в контрольной группе, при рождении здоровых детей у женщин с IgG антителами к Chlamydia trachomatis, носительстве Staphylococcus aureus и Candida albicans, с высоко-авидными IgG антителами к Herpes simplex1,2 – в 15 %, 15%, 14% и 13% соответственно. Уровни менее 1,7 г/л отмечены у 12 % в контрольной группе, у 12 % при наличии IgG антител к Chlamydia trachomatis, 27 % при носительстве Candida albicans и ни одном из случаев при наличии у беременной IgG антител к Herpes simplex 1,2, носительстве Staphylococcus aureus.
При рождении детей с признаками ВУИ высокие уровни а2-МГ выявлены в 30% при наличии при наличии IgG к Chlamydia trachomatis, 11% - при носи-тельстве Staphylococcus aureus, 16%- с наличием высокоавидных IgG к Herpes simplex1,2 и в 10% при носительстве Candida albicans. Сниженные уровни а2-МГ наблюдались в 2 % случаев при Chlamydia trachomatis, 9 % - при Candida al-bicans, 10% при Staphylococcus aureus и 4 % при Herpes simplex.
Несколько иные тенденции были выявлены при изучении содержания ассоциированного с беременностью альфа-2-гликопротеина (АБГ) в сыворотке крови беременных групп наблюдения (рисунок 15). Полученные значения при рождении здорового ребенка в основных группах демонстрировали явную тенденцию к снижению уровней АБГ по сравнению с физиологически протекающей беременностью контрольной группы. Напротив, при рождении ребенка с признаками ВУИ, уровни данного белка были выше, и, в некоторых группах носительниц, были даже немного выше нормы хотя, вследствие высокой индивидуальной вариабельности показателя, данные изменения не всегда были статистически значимы. ±0,017РВ=0,0363 рk – значимость отличий от контрольной группы, остальные р – различия между подгруппами беременных женщин-носительниц одного возбудителя или антител и разделенных согласно ретроспективному анализу исхода родов (см. сокращения после р), В-носительницы, родившие детей с признаками ВУИ
Очевидно, что белок зоны беременности АБГ, обладающий мощными иммуносупрессивными свойствами играет значительную роль в патогенезе ВУИ и его дефицит ассоциирован с хорошим прогнозом в раннем постнаталь-ном периоде. Однако высокая индивидуальная вариабельность данного показателя не позволяет рекомендовать его в качестве самостоятельного прогностического критерия что, впрочем, не отменяет его прогностической ценности виде компонента общего прогностического алгоритма.
При анализе индивидуальных показателей, уровни АБГ ниже 0,140 г/л выявлялись в 19% случаев в контрольной группе. При рождении здорового ребенка от от матерей основных групп наблюдения сниженные концентрации АБГ в сыворотке крови наблюдались в 40% случаев при наличии у матери IgG антител к Chlamydia trachomatis в титре 1:5-1:40, в 29% при носительстве Staphylococcus aureus,в 27% при носительстве Candida albicans и в 43% при наличии высокоавидных IgG антител к Herpes simplex1,2.
В случае рождения детей с признаками ВУИ подобное пониженное содержание отмечено в 32% случаев при IgG к Chlamydia trachomatis, 25% при носительстве Staphylococcus aureus, в 27% при носительстве Candida albicans и в 29% при IgG антител к Herpes simplex1,2.
Наконец, изучение сывороточного содержания еще одного резервного представителя белков семейства макроглобулинов ассоциированного с беременностью протеина плазмы А (РАРР-А), позволяющего, помимо прочего, оценить состояние плаценты, продемонстрировало, что данный белок отличается наибольшей индивидуальной вариабельностью показателей.
Тем не менее, обращает на себя внимание определенная тенденция по снижению сывороточного содержания РАРР-А в подгруппах, родивших ребенка с признаками ВУИ. Попытка объединить данные, чтобы получить достоверные различия, подтвердила наличие подобной тенденции (рис.16).
Более того, при исключении из объединенной группы женщин, родивших детей с признаками ВУИ, подгруппы с носительством Staphylococcus aureus, среднее содержание РАРР-А в крови беременных с наличием IgG антител
Chlamydia trachomatis, Herpes simplex1,2 и носительстве Candida albicans оказалось еще ниже (126280±9334 Е/л), и достоверно отличалось от уровней данного белка при физиологически протекающей беременности (р=0,0125). Следовательно, при развитии внутриутробной инфекции наблюдается дефицит РАРР-А в циркуляции. Однако индивидуальная вариабельность все же слишком высока, чтобы использовать его в прогностических целях. В качестве индивидуального маркера риска ВУИ.