Дифференцировочные антигены и субпопуляционная организация лимфоцитов человека Филатов, Александр Васильевич

Введение к работе

Актуальность проблемы. Цель и задачи исследования.

Научная новизна. Научно-практическое значение.

Основные положения, выносимые на защиту.

Апробация диссертации. Публикации 1

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Получение гибридом. Выделение МКАТ.
Определение поверхностных маркеро*.
Определение молекулярных масс антигенов.
Функциональные тесты 6

РЕЗУЛЬТАТЫ .-ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Методы.кластеризации ыоноклоналъных антител к дифференцироЁочным антигенам лимфоцитов человека 6

2. Характеристика кластеризованных ЖАТ 9

2.3. Характеристика некластеризованных МКАТ 14

2. 4. Изучение влияния МКАТ на функциональную

активность шнонуклеаров 23

ИССЛЕДОВАНИЕ СУБПОПУЛЯЦИОННОИ СТРКТУРЫ ЛИМФОЦИТОВ ... 30 4.1. Исследование экспрессии

пан-В клеточных антигенов 33

4. 2. Исследование экспрессии

пан-Т клеточных антигенов 35

4. 3. Исследование экспрессии

еубпопуляционных маркеров 39

Актуальность проблемы.. Одной иа уникальных особен ноет о и им иной системы является ее Бисоїсія гетерогенность по своему кло чному составу. Клетки ее слагающие отличаются межцу собой гаг своему антигенному иор.рету, таи и фунісциошиьно. Рэ<".пити<"

МУНОЛОГИИ ПОСЛеДНИХ ЛЄТ ВО МНОГОМ ОПреЛеЛЯЛОСЬ ОТКрЫТИеМ TV.'f;

вых популяций клеток и разделением их на все более и более уг> е субпопуляции, отличающиеся по функциональным или антигенные ойствам (Петров Р. а . 1987). В ходе этой работы постоянно воз кал вопрос о том, гак разделение лимфоцитов но Функциональном ойствам соответствует их разграничению по антигенным (Cantot » Boyse Е. A. , 1977). У исследователей всегда существовало екдениє в том, что в конечном итоге удастся создать таку*) itnp ну строения иммунной ситемы, когда кздлая функциональная сі« пуляция будет характеризоваться только eft присушим антигенным .бором. Это являлялось одним из основных побудительных мотивов я поиска все новых антигенов, маркирующих определенные популя и лимфоцитов. В результате разработок в этом направлении сформовалось новая область исследования - изучение дифференциро-ічньк антигонов лейкоцитов человека, к которым относят

іВерХКОСТНЬїе Маркеры ЛеЙКОЦИТОВ, ПОЯВЛЯЮПИеСЯ И ИСЧ838ДЩИЄ К1

[ределенных стадиях развития клеток (Ыанъко B.W. , 1987; Варыя! гков А. И., Кадагидзе 3. Г. и др., 1989; Глузмаи Л. Ф, 1990: Сидо інко С. П. и др. , 1990; Milstsin С. , 1989).

Основным инструментом выявления и идентификации поверхност к антигенов лейкоцитов явились МКАТ. Зачастую открытие неиз четного ранее маркера являлось следствием получения нового CAT. С помощью МКАТ к настоящему времени охарактеризовано около ) дифференцировочных антигенов лейкоцитов человека, и эту рэбо ' можно считать далеко не. законченной (Knapp W. , et al. 1989) із сомнения, в ближайшие годы списс; открытых антигенов будет тдественно расширен, что позволит углубить наши представления п роении иммунной системы и свойствах ее составляющих леякоівд-

)В.

МКАТ к поверхностным антигенам используются также как высоко ..; пифические зонды, реагирующие с определенными субпопуляциями іеток и гаданными антигенами. Поскольку многие» поверхности'*! ггигены являются рецепторами различного рода фякторрр. то с цч-

мощью ЖАТ. стало возможным моделирование влияния на клетки ] монов и димфокинов, воздействующих опосредованно через те иные антигени (Rover Н. D. et. al. , 1985). Определенные Фуні лимфоцитов возможно как активировать, так, и угнетать с пом ЫКАТ,

.Обладая высокой специфичностью к антигенам, представде на субклассах лимфоцитов, МКАТ предоставляют значительные мокюсти в лечении эаболеваний иммунной системы или состояни развитии которых вовлечены эти клетки. При этом ЫКАТ могут Пользоваться в качестве терапевтического средства как сами себе, так и в комплексах с различными физиологически актив верствами. В частности. ШАГ нашли свое применение в тер при . пересадках почек (Norman D. J., 1985) и костного и (McMlchael A.J. et al., 1987).

. Навамениш МКАТ для научения субпопуляционной органив лимфоцитов в норме и лри патологии. С их помощью возможно только контроль за отклонением иммунной системы от нормаль состояния, но и поиск тех специфических дефектов, которые я ются причиной возникновения определенных иммуиопатаї (Schlossman S. F-., Re inhere E. I., 1G84; Moretta L. et. al.. 1 Хаитов P.M., Османов С. К , 1991).

В свете вышесказанного представляется перспективным по.' нив новых МКАТ.как к известным, так еще неописанным антигеї целью дальнейшего изучения клеточных антигенов, механизмов 4 ционирования лимфоцитов, путей и форм их дифференцировки, а ме для диагностики и лечения различных заболеваний.

Цель к задачи исследования. Перед настоящей работой сі лась задача 'создания панели ШАТ к маркерам основных попу; лейкоцитов человека с целью научения субпопуляционной струї лимфоцитов в норме и при патологии. В качестве основной < патологии были выбраны первичные ВДС у детей. Б задачи исс. вания входило определение нарушений субпопуляционной струк специфических для определенных форм первичных ВДС. Предпо, лось также, что в процессе работы будут получены МКАТ к ! неизвестным ранее антигенам и будут изучены их свойства.

Научная вощана. Получены и охарактеризованы МКАТ, ра наитие неизвестные ранее антигены. Впервые найден антиген, юшийся общим маркером В- и NK-клеток и не обнаруживаемый на гих типах клеток. Показано, что действие МКАТ па функциона

тивность мононуклеаров может определяться не только спєцифи-ским взаимодействием антиген-антитело, но и уникальным угяе-дным составом Fc-фрагмента МКАТ. Продемонстрировано, что "пан-клеточные антигены CD5 и CD7 могут использоваться для изучэ-я тонкой субпопуляционно^-" структуры Т-лимфоцитов. Впервые об-ружен бимодальный характер экспрессии антигенов CD5 и CD7 на мфоцитах при некоторых формах первичных ИДС. Изучено распрсде-ние клеток с высокой и низкой степенью экспрессии антигенов 5 и CD7 по субпопуляциям OD4⁺- и СБв*-лимфоцитов. Впервые исс цован характер разделения CD4+ и CD8+ субпопуляций по зкспрес-л антигена CD27. Детализированы на уровне тонкой субпопуляци-^:гой структуры нарушения, наблюдаемые при первичных ИДС.

В ходе работы разработан ряд новых методических приемов, из рорых, в первую очередь следует отмотить следующие: показі на шоаность использования неизотопного меченкя (биотинилирова-:) в реакции иммунопреципитации для определения молекулярных :с поверхностных антигенов лимфоцитов, продемонстрирована воз-тость усиления реакции иммунофлуорасценции с использованием гоэритрин-антификоэритриновой системы, предложен метод соеди-зщий в себе процедуры скрининга и отбора клонов гибридом, сек-ирующих цитотоксические МКАТ, использован метод коррекции шых определения субпопуляций путем нормализации к числу 0045^-іток, разработана математическая модель, позволяющая по данным тецветной иммунофлуоресценцки расчитывать субпопуляционную іуктуру с учетом одновременной экспрессии до о антигенов.

Научно-практтесиое значение. Полученные МКАТ были переданы испытание в более, чем 100 научных учреждений СССР и получили ожительные отзывы. МКАТ внедрены в производство, и в настоя-

время доступны коммерчески. Полученные ШАГ используются при нке иммунного статуса больших конг нгентов людей, в том числе , пострадавших при аварии на ЧАЭС. Данные ЫКАТ нашли примене-

при фенотипировании лимфом и лейкозов, а такие для выделения популяций лимфоцитов. МКАТ внедрены в практику иммунологичее-

исследований в лаборатории клинической иммунологии Института унологии Шнздрава Российской Федерации, НИИ проблем онколо-

им. Р.Е. Кавецкого АН Украины, Научном центре радиационной (Щнны (г. Киев), Онкологическом научном центре РАМН, ГОШ ге-элогии и переливания крови МЗ Беларусь, Львовском филиале Ки-«эго НИИ гематологии и переливания крови, НИИ трасплангологии

» иокуои'вэннш органов. Институте онкологии С г. С-Петербург) цр. учреждениях. Полученные ШАЇ ааявлеїш для участия в V Мєжд народном рабочем совещании ио дифференцировочйым антигенам ле кнцихов человека.

Основные пижлтаия, выносимые на защиту.

1. Cos дана панель ЫКАТ к дифференцировочным антигенам д (шцитоа человека. Проведено в соответствии с международной к» иификациой отнесение основной чисти полученных UKAT к определ цім (кластерам дкффаренцировки.

2. Выявлены МКАТ, которые по специфичности не соответств известным кластерам дифференцировки и, по-видимому, расповн неизвестные ранее антигены лимфоцитов человека.:

3. Установлено, что FcR-опосредованиыё функции- моноц* могут блокироваться ШАТ T5G11, роагируївдим с антигеном с мс кудяриой массой 110 кда. Показано, что эффэкторной" частью мс нуды Т5Ш1 является" ее Fc-фрагмент, и важную роль в проц< блокирования играют углеводные остатки Fo-фрагыента T5S11,

4. Обнаружен новый антиген, являющийся обидам для ! NK-лимфоцитов, который состоит иа двух цепей с ыолекуляр: массами 87 и 71 кДа и, который находится на поверхности клет виде олигомарных комплексов.

5. Разработаны общие' принципы анализа субпопуляцио структури лимфоцитов, возводящие детализировать иммунные н шения на сублоиуляционном уровне.

Алробация дюеергации. Результаты исследований были щ тавлены ка I Всесоюзном биофизическом сгеаде (Москва, 1982) Всесоюзном совещание'по генетике соматических клеток в кулы (Москва, 1983), Всесоюзной конференции "Профилактика, диагн< ка и лечение аутоиммунных заболеваний и вторичных иммунодеї тов. (Новосибирск, 1985), V Всесоюзном биохимическом съезде ев, 1986), Симпозиуме с международным участием "Иммунодефии аллергия" (Москва, 1966), 1-ой и 2-ой Всесоюзных конфере "Современные направления создания медицинских диагностик (Москва, 198В; Москва, 1890), III Республиканской конфер "Автомативация цитологических исследований" (Киев, 1990), t 10-ой межинегитутской конференции "Факторы клеточного и рального иммунитета при различных физиологических и патолої ких состояниях" (Челябинск, 1983; Челябинск, 1990), Бсес<

- Б -

ференции "Генная и клеточная инженерия в решении фундамен-ьньк проблем биотехнологии" (Тарту. 1989), I Всесоюзном имму-огическом съезде (Сочи, 198S), IV Международной конференции дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека (Вена, 9), VII Международной "онференции по маркерам опухолей чело-а (Киев, 1990), IV Всесоюзном совещании "Люминесцентный ана-

в биологии и медицине и его аппаратурное обеспечение" (Моск-

1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 52 рабо-

получены 4 авторских свидетельства