Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. Роль нейтрофильных гранулоцитов в иммунологической
реактивности человека 10
Морфофизиологические особенности нейтрофильных гранулоцитов 12
Механизмы кислородзависимой реактивности нейтрофилов 16
Принципы изучения кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов 21
Методические особенности проведения НСТ-теста 27
Использование НСТ-теста в клинической практике 35
Особенности функциональной активности нейтрофилов при травме опорно-двигательного аппарата 38
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2. Материалы и методы исследования 43
Глава 3. Разработка способа количественной оценки
кислородзависимого метаболизма нейтрофилов крови человека .... 50
Оптимизация условий выделения и количества нейтрофильных гранулоцитов при постановке реакции восстановления НСТ 51
Разработка условий проведения НСТ-теста и способа фотометрической регистрации его результатов 54
Глава 4. Клиническая апробация способа количественной оценки
кислородзависимого метаболизма нейтрофильных
гранулоцитов 74
Глава 5. Клинико-иммунологическеая значимость фотометрического
НСТ-теста для оценке эффективности иммунокоррекции у
больных с первичным эндопротезированием тазобедренного
сустава 84
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 91
ВЫВОДЫ 103
РЕКОМЕНДАЦИИ В ПРАКТИКУ 105
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 106
Список сокращений.
АФК - активные формы кислорода;
ДФ - диформазан;
КАн - коэффициент активации при стимуляции неопсонизированным
зимозаном; КАо - коэффициент активации при стимуляции опсонизированным
зимозаном; КЗМ - кислородзависимый метаболизм; КО - коэффициент опсонизации;
латНСТ -индуцированный латексом НСТ-тест, ед. изм. в %; н/з - неопсонизированный зимозан; н/зНСТ - индуцированный неопсонизированным зимозаном НСТ-тест,
ед. изм. в mOD; НГ - нейтрофильные гранулоцити; НСТ - нитросиний тетразолиум; о/з - опсонизированный зимозан; о/зНСТ - индуцированный опсонизированным зимозаном НСТ-тест,
ед. изм. в mOD; РВ - респираторный взрыв; сНСТ - спонтанный НСТ-тест, ед. изм. в mOD; спНСТ - спонтанный НСТ-тест, ед. изм. в %; ХГБ - хроническая гранулематозная болезнь; ХЛ - хемилюминесценция; ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы; ЭТС - эндопротезированиз тазобедренного сустава;
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ.
Нейтрофильные гранулоциты (НГ) являются основными эффекторами противоинфекционных механизмов иммунитета. Среди широкого спектра проявлений функциональной активности нейтрофилов особое место отводится кислородзависимому метаболизму - уникальной системе немитохондри-ального дыхания клетки, которое резко возрастает в процессе клеточной активации и потому носит название «респираторного взрыва». Этот процесс сопровождается повышенным потреблением глюкозы и кислорода, а также увеличением продукции активных форм кислорода (АФК): супероксид аниона, пероксида водорода, гидроксил радикала и синглетного кислорода (А.Н. Ма-янский, Д.Н. Маянский, 1989; S.W. Edwards, 1994). Кислородные радикалы являются не только основой антимикробного потенциала нейтрофилов, но и активными регуляторами тканевого метаболизма человека (Н.И. Бахов с со-авт., 1988; И.И. Долгушин, О.В. Бухарин, 2001). Показана высокая информационно-диагностическая значимость исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофилов при бактериальных и вирусных инфекциях (R.D. Feigin, L.K. Pickering, 1975), коллагенозах (М.М. Дейл, 1999), сердечно-сосудистых заболеваниях (S. Kausalya, J. Nath, 1998), респираторном дистресс-синдроме (Г.А. Рябов, 1994) и деструктивном панкреатите (B.C. Тарасенко с соавт., 2000). Однако, особенности метаболической активности НГ при травме опорно-двигательного аппарата изучены недостаточно.
Заболевания и травма крупных суставов занимают одно из ведущих мест среди причин временной нетрудоспособности и инвалидизации больных (О.Ш. Буачидзе с соавт., 2001). Отмечается неуклонный рост количества медиальных переломов бедра, что связано с увеличением доли пожилых людей среди населения (G.H. Anderson et al., 1993; Н. Burger, 1999; СЕ. DeLaet, Н.А. Pols, 2000). Современным подходом к решению этого вопроса является вы-
полнение первичного эндопротезиропания тазобедренного сустава (В.П. Охотский, И.Ю. Клюквин, 1999; Н.В. Корнилов, 2000; G.M. Robbins et al., 2001). Проведение оперативного вмешательства у пациентов старших возрастных групп на фоне посттравматической и возрастной иммуносупрессии, большого числа сопутствующих заболеваний, определяет необходимость оценки состояния иммунной системы, включая изучение функциональной активности нейтрофилов. Так, показана прогностическая значимость показателей гуморального звена иммунитета (уровень циркулирующих иммунных комплексов и интерлейкина-1) у пациентов с дегенеративно-дистрофическими заболеваниями тазобедренного сустава, подвергнутых эндопротезированию (А.В. Костюшко, 2000). Предложены схемы иммунодиагностики осложнений при эндопротезировании суставов, включающие определение уровня иммуноглобулинов классов М п G, активности NK-клеток, содержания малонового диальдегида, скорости и реакции торможения миграции лимфоцитов (Г.Л. Плоткин с соавт., 2001). Однако, целенаправленная оценка функциональной активности НГ, а также иммунокоррегирующая терапия не проводилась.
Одним из основных методов исследования функциональной активности НГ является тест с нитросиним тетразолием (НСТ). Метод основан на способности практически бесцветного НСТ восстанавливаться кислородными радикалами в темно-синий диформазан (ДФ). Наибольшее распространение в клинической практике получили варианты визуального учета НСТ-теста, основанные на микроскопическом подсчете процента нейтрофилов, содержащих в цитоплазме гранулы ДФ (В.Н. Park, S.M. Fikrig, Е.М. Smithwick, 1968; Т.К. Бумагина, Е.И. Шмелев, 1981; В.И. Щербаков, 1989; Б.С. Нагоев, Н.Г. Ораза-ев, 2000).
Основными недостатками такого подхода является отсутствие количественной регистрации кислородных радикалов, генерированных пулом нейтрофилов, а также субъективность учета результатов реакции. Для объективизации оценки результатов исследования предложены различные варианты фо-
тометрического учета НСТ-теста (R.L. Baenher, D.G. Nathan, 1968; В.К. Вагнер с соавт., 1989; BJL Мельников, 1991; М.Р. Richardson et al., 1998; MB. Черешнева с соавт., 2000). Эти методики подразделяются по способу экстрагирования восстановленного НСТ и регистрации оптической плотности полученного раствора. Экстракцию ДФ осуществляют органическими растворителями (диоксан, пиридин, диметилформамид) на кипящей водяной бане, а оптическую плотность регистрируют с помощью спектрофотометра (А.Л. Не-вмятуллин с соавт., 1985; В.К. Вагнер с соавт., 1989; М.Р. Richardson et al., 1998; М.В. Черешнева с соавт., 2000). Однако использование кипящих токсических растворителей, больших объемов реагентов и отсутствие автоматизированной регистрации результатов реакции существенно ограничивают производительность и значительно повышают трудоемкость исследования функциональной активности НГ в клинико-лабораторной практике. В этой связи, ряд исследователей (G. Virella et al., 1990; Е.П. Киселева и А.В. Полевщиков, 1994; А.А. Капралов с соавт., 1997) предлагают регистрировать результаты НСТ-теста с помощью многоканальных фотометров в 96 луночных иммунологических планшетах. Однако использование реактивов, изменяющих функциональное состояние клеток, незначительный диапазон получаемых результатов, отсутствие контролей на реагенты, ограничивают их широкое использование.
Таким образом, до настоящего времени отсутствуют доступные и объективные методы количественного исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофилов; не представлена характеристика функциональной активности лейкоцитов у пациентов с травмой опорно-двигательного аппарата; не изучена динамика кислородного метаболизма НГ в зависимости от выбранной тактики лечения медиальных переломов бедра; не обосновано проведение иммунокоррекции у больных после первичного эндопротезирования тазобедренного сустава.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:
Разработать фотометрический НСТ-тест с нейтрофилами крови человека и оценить его клинико-иммунологическую значимость у больных с травмой опорно-двигательного аппарата.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
Оптимизировать процедуру выделения и количество нейтрофильных гранулоцитов крови человека, участвующих в реакции восстановления НСТ.
Усовершенствовать условия проведения НСТ-теста и способ фотометрической регистрации его результатов.
Провести сравнительную оценку кислородзависимого метаболизма нейтрофилов крови здоровых и пациентов с различной патологией.
Оценить клинико-иммунологкческую значимость разработанного НСТ-теста для оценки эффективности иммунокоррекции у больных после первичного эндопротезирования тазобедренного сустава.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА:
Разработан способ диагностики функционального состояния нейтрофилов человека (патент Российской Федерации на изобретение № 2218567 от 24.12.2003), основанный на использовании высокоочищенного пула нейтрофилов крови человека при заданной концентрации и соотношении клетка/индуктор, а также двух-волновой регистрации продуктов реакции с помощью многоканального фотометра.
Обосновано использование заданной концентрации нейтрофилов (50 0000±50 000 клеток/лунке), опсонизированного и неопсонизированного зимо-зана в соотношении 20±2 частиц/клетку в качестве индукторов кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов, а также 2-х волновой (тестовая Я,=630 нм; референтная Я,=490 нм) регистрации продуктов реакции в НСТ-тесте.
Доказана высокая чувствительность разработанного варианта НСТ-теста для оценки активности процесса образования активных форм кислорода при воздействии ингибиторов кислородзависимого метаболизма нейтрофилов.
Показана высокая информационная значимость использования двух корпускулярных индукторов кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов (опсонизированный и неопсонизированный зимозан) для оценки дискретности клеточного ответа, опосредованного через различные рецепторы и внутриклеточные пути активации.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ:
На разработанный способ диагностики функционального состояния нейтрофилов человека оформлено рационализаторское предложение (№ 662, НИИ скорой помощи им. Н.В.Склифосовского) и с 1999 года метод используется в практической деятельности лаборатории клинической иммунологии и диагностики СПИД.
Выявлено, что 47% больных со свежими медиальными переломами бедра имеют нарушения кислородзависимого метаболизма нейтрофилов и обосновано проведение у них профилактической иммунокоррекции с помощью препаратов, обладающих выраженным эффектом в отношении фагоцитарного звена иммунитета.
С помощью фотометрического НСТ-теста в травматологическую практику внедрен алгоритм иммунологического пособия пациентам с медиальными переломами бедра, заключающийся в приоритетном исследовании в предоперационном периоде метаболической активности нейтрофилов, выявлении им-мунокомпромитированных пациентов и включении в схему послеоперационного ведения таких больных иммунокорректоров.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.
Результаты работы доложены на юбилейной научной конференция «Современные технологии и перспективы развития военной травматологии и ортопедии» (Санкт-Петербург, 2000); городской научно-практической конференции «Первичное эндопротезирование тазобедренного сустава у больных пожилого и старческого возраста с медиальными переломами бедра» (Москва, 2001); всероссийской юбилейной научно-практической конференции «Лечение сочетанных травм и заболеваний конечностей» (Москва, 2003); межклинической конференции проблемно-плановой комиссии по неотложной травматологии НИИ скорой помощи им. Н. В. Склифосовского (Москва, 2003).
ПУБЛИКАЦИИ.
По теме диссертации опубликовано 11 работ, получен патент РФ на изобретение.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций в практику и списка цитируемой литературы, состоящего из 83 отечественных и 130 зарубежных источников. Диссертация изложена на 129 страницах, содержит 10 таблиц, 17 рисунков.
![Состав и функциональные особенности прилипающей фракции пуповинной крови человека [Электронный ресурс]](/i/i/4250/195028.png "Состав и функциональные особенности прилипающей фракции пуповинной крови человека [Электронный ресурс] Бархатов Ильдар Мунерович")
