Введение к работе
Актуальность проблемы.
Значение генов и антигенов системы НРА (Human Platelet Antigens) в различных областях медицины, в том числе трансфузиологии и трансплантологии (в частности при алломиелотрансплантации), определяется их разнообразием и высокой иммуногенностью.
Накопленные и обобщенные к настоящему времени данные по частоте генов НРА свидетельствуют о наличии расовых и популяционных особенностей их распространенности. Иммуногенетические характеристики НРА хорошо изучены у населения большинства стран Западной и Восточной Европы [Reviron D. et al., 1992; Simsek S. et al., 1993; Holensteiner A. et al., 1995; Kekomaki S. et al., 1995; Legler T.J. et al., 1996; Steffensen R. et al., 1996; Merieux Y. et al., 1997; Drzewek K. et al., 1998; Rozman P. et al., 1999; Jones D.C. et al., 2003], Африки [Mojaat N. et al., 1999; Ferrer G. et al., 2002; Halle L. et al., 2004; Paola J.D. et al., 2005], Азии [Santoso S. et al., 1993; Kim H.O. et al., 1995; Urwijitaroon Y. et al., 1995; Tanaka S. et al., 1996; Chang Y.W. et al., 1998; Seo D.H. et al., 1998; Lyou J.Y. et al., 2002; Halle L. et al., 2004; Kulkarni B. et al., 2005; Al-Subaie A.M. et al., 2006; Feng M.L. et al., 2006], Северной и Южной Америки [Covas D.T. et al., 1997; Chiba A.K. et al., 2000; Cardone J.D.B. et al., 2004; Toralles-Pereirac C. et al., 2005], Австралии [Bennett J.A. et al., 2002]. У населения Российской Федерации сведения об иммуногенетических параметрах НРА отсутствуют.
Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) широко применяется в лечении больных заболеваниями системы крови, прежде всего, гемобластозами. После пересадки ГСК необходимо проводить мониторинг за их приживлением. Для этих целей используют различия реципиентов и их доноров по многим маркерам, так называемым «меткам». Маркерами могут быть гипервариабельные участки ДНК – тандемные повторы с изменяющимся количеством копий и короткие тандемные повторы [Демидова И.А. и Савченко В.Г., 1995; Демидова И.А., 1997; Демидова И.А. с соавт., 1997], половые хромосомы (если донор и реципиент являются разнополыми) [Виноградова О.А., 2001], эритроцитарные антигены различных систем [Зотиков Е.А. с соавт., 1996; Порешина Л.П., 2004] и др. Различия по перечисленным маркерам удается найти только у 80% близкородственных пар донор-реципиент [Bryant E., Martin P.J., 2004], поэтому поиск новых «меток» представляется весьма актуальным. В настоящее время интенсивно разрабатываются методические приемы, позволяющие изучать замены единичных нуклеотидов в генах (SNP - single nucleotide polymorphism). Эти методы позволяют быстро и качественно использовать полученные результаты для оценки приживления трансплантированных ГСК [Hochberg E.P. et al., 2003]. Полиморфизм НРА-генов обусловлен, в основном, заменой одного нуклеотида в структуре аллель-специфических сайтов. Фенотипическая экспрессия антигенов системы НРА определяется несколькими генами, локализованными на длинном плече 5, 17 и 22 хромосом. Гены системы HLA расположены на 6 хромосоме. В соответствии с законом Моргана локализация генов на разных хромосомах предполагает их независимое наследование. Таким образом, HLA-идентичные сибсы могут различаться друг от друга по НРА-генам. Изучение распределения НРА-генов у HLA-идентичных сибсов, один из которых болен онкогематологическим заболеванием и является потенциальным реципиентом близкородственных ГСК, позволит использовать различия по НРА для проведения мониторинга за приживлением алломиелотрансплантата.
Внутривидовые различия людей по антигенам систем НРА и главного комплекса гистосовместимости – HLA (Human Leukocyte Antigens), их иммуногенность, являются причиной аллоиммунизации пациентов при проведении трансфузионной терапии компонентами крови, прежде всего тромбоцитами. В то же время, совершенствование программ цитостатической полихимиотерапии больных гемобластозами немыслимо без трансфузионного обеспечения. Переливания тромбоцитов являются эффективным методом лечения и профилактики геморрагических осложнений, обусловленных дисфункцией, снижением количества тромбоцитов периферической крови вследствие аплазии кроветворения или замещения нормального гемопоэза опухолевыми клетками. Аллоиммунизация пациентов, являясь основной причиной развития иммунологических реакций негемолитического типа, может привести к полному отсутствию клинического эффекта от переливания тромбоцитов. Иногда после трансфузий тромбоцитов доноров, несовместимых с реципиентом как по НРА, так и HLA, в организме больного происходят тяжелые нарушения в иммунной системе, проявляющиеся в срыве иммунологической толерантности и развитии аутоиммунного процесса (аутоиммунной тромбоцитопении), приводящие к тяжелым геморрагическим проявлениям.
Проведенные ранее исследования больных с множественными трансфузиями тромбоцитов были посвящены аллоиммунизации преимущественно к антигенам главного комплекса гистосовместимости [Компанеец М.А. с соавт., 1992; Зотиков Е.А. с соавт., 1996], в то время как за рубежом подход к проблеме был комплексным – вместе с анти-HLA антителообразованием изучали и аллоиммунизацию к антигенам системы НРА [Kickler T.S. et al., 1990; Chow M.P. et al., 1992; Wernet D. et al., 1993; Novotny V.M.J. et al., 1995; Zimmerman R. et al., 1999]. Изучение частоты аллоиммунизации антигенами системы НРА и HLA больных гематологическими заболеваниями с множественными трансфузиями компонентов крови необходимо для правильного выбора доноров тромбоцитов. Доноров обычно выбирают из регистра, в который внесены данные по гено(фено)типу форменных элементов крови - эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов. Для вычисления числа НРА-типированных доноров, достаточного для трансфузионного обеспечения пациентов с заболеваниями системы крови, необходимо знание иммуногенетических параметров НРА здорового населения в локальной популяции или конкретной местности, в нашем случае представителей восточно-европейской популяции Российской Федерации, самоидентифицирующих себя как русские.
Цель исследования:
Изучить генетический полиморфизм тромбоцитспецифических антигенов и его значение при алломиелотрансплантации и в клинической трансфузиологии (при переливании тромбоцитсодержащих сред) у больных с заболеваниями системы крови.
Задачи исследования:
-
Определить иммуногенетические характеристики НРА представителей восточно-европейского региона России, самоидентифицирующих себя как русские: частоты генов, аллелей, генотипов, гаплотипов, величину гаметной ассоциации и генетической дистанции, выявить особенности распределения НРА. Изучить распределение НРА-генов у HLA-идентичных сибсов в семьях, где один из детей болен гемобластозом.
-
Оценить возможность проведения мониторинга приживления близкородственного алломиелотрансплантата по генам НРА.
-
Определить частоту аллоиммунизации к антигенам систем НРА и HLA у гематологических больных после терапии компонентами крови. Изучить частоту реагирования анти-НРА антител у аллоиммунизированных больных.
-
Оценить влияние подбора доноров тромбоцитов иммунологическими методами аллоиммунизированным больным на эффективность трансфузий.
-
Определить величину контингента НРА-типированных доноров, необходимого для трансфузионного обеспечения совместимыми по антигенной структуре тромбоцитами первичных больных с аплазией кроветворения.
Основные положения, выносимые на защиту:
1) Применение молекулярных методов исследования позволяет изучить все иммуногенетические параметры НРА представителей восточно-европейского региона России, самоидентифицирующих себя как русские, выявить особенности распределения НРА русских по сравнению с представителями иных популяций.
-
Независимое наследование HLA и HPA генов позволяет использовать имеющиеся различия по НРА между донором и реципиентом в качестве «метки» при оценке приживления близкородственного HLA-идентичного алломиелотрансплантата.
3) Частота аллоиммунизации к антигенам системы НРА у больных заболеваниями системы крови после множественных трансфузий тромбоцитов высока и превалирует над частотой аллоиммунизации к антигенам системы HLA.
Научная новизна исследования
Исследования по изучению полиморфизма НРА представителей восточно-европейского региона России, самоидентифицирующих себя как русские, проводились впервые. Рассчитаны все иммуногенетические характеристики НРА – частоты генов, аллелей, гено- и гаплотипов, величина неравновесного сцепления. Впервые по собственным данным частотных распределений аллелей НРА и литературным данным частоты НРА у представителей разных популяций вычислена величина генетической дистанции между русскими и иными народами. Впервые представлены данные по особенностям распределения НРА у русских при сравнении с результатами исследования зарубежных авторов. Впервые проведены исследования семей, доказано наследование генов GP2B и GP3A гаплотипами, выявлен кроссинговер между генами GP2B и GP3A материнской 17 хромосомы с формированием нового генотипа у одного из пяти детей.
Впервые показана частота и характер отличий по НРА HLA-идентичных сибсов.
Впервые в практике мировой трансплантологии доказана возможность проведения мониторинга приживления близкородственного алломиелотрансплантата по НРА-генам. Проведено сопоставление результатов мониторинга приживления стволовых гемопоэтических клеток по молекулярным и цитогенетическим маркерам, доказано, что критерии идентификации ремиссии и рецидива основного заболевания после алломиелотрансплантации совпадают.
Впервые в стране на большом материале представлена частота аллоиммунизации больных заболеванием системы крови после трансфузий тромбоцитов. Впервые проведен детальный анализ структуры аллоиммунизации у больных разными нозологическими формами заболеваний системы крови, определена частота реагирования анти-НРА антител.
Впервые подбор доноров тромбоцитов аллоиммунизированным больным выполнен двумя серологическими методами – методом иммуноферментного анализа и в лимфоцитотоксическом тесте. Предложен алгоритм и обоснована целесообразность проведения подбора донора тромбоцитов аллоиммунизированным больным по антигенам двух систем – НРА и HLA, который приводит к увеличению эффективности трансфузий тромбоцитов.
Практическая значимость
Полученные сведения по распространенности НРА-генов у русских использованы для вычисления величины контингента НРА-типированных лиц, необходимого для трансфузионного обеспечения больных с заболеваниями системы крови.
Собранные образцы ДНК доноров с установленным НРА - генотипом использованы как стандарты для создания отечественной системы генотипирования НРА.
Генетические различия гемопоэтических стволовых клеток реципиента и донора по НРА могут быть использованы для оценки приживления костного мозга.
Генотипирование по НРА можно применять в практической работе учреждений службы крови для трансфузионного обеспечения совместимыми по антигенной структуре тромбоцитами аллоиммунизированных больных.
Разработан алгоритм подбора доноров тромбоцитов больным, аллоиммунизированным к антигенам систем НРА и HLA.
Внедрение в практику
Результаты исследования внедрены в практику ГУ ГНЦ РАМН. Результаты работы используются при чтении лекций врачам, проходящих усовершенствование по специальностям «Иммуногематология», «Клиническая лабораторная диагностика», «Клиническая трансфузиология».
Работа выполнена в рамках следующих тем НИР: «Иммунологическая диагностика тромбоцитопений» (1997-1999) № гос.регистрации 01970000925 (Рук. академик Е.А. Зотиков), «Изучение иммуногенетических параметров тромбоцитспецифических антител (анти-НРА) у больных, сенсибилизированных в результате тромбоцито-, миело-, гемотрансфузий или иным путем» (2000-2002) № гос.регистрации 01200001737 (Рук. академик Е.А. Зотиков), «Изучение иммуногенетических параметров тромбоцитспецифических антигенов (НРА)» (2003-2005) № гос.регистрации 01200301548 (Рук. академик Е.А. Зотиков, канд.мед.наук Л.Л. Головкина).
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на научно-практических конференциях «Новое в трансфузиологии» (Москва, 2000 г.), «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2000 г.), «Клиническая и производственная трансфузиология – единство целей» (Москва, 2001 г.), Пятой научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001 г.» (г. Санкт-Петербург, 2001 г.), II Всероссийском съезде по трансплантологии и разработке искусственных органов (Москва, 2002 г.), V съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2003 г.), VIII Европейском конгрессе международного общества трансфузиологов (Стамбул, Турция, 2003), на 8 Европейском симпозиуме по иммунобиологии тромбоцитов и гранулоцитов (Руст, Австрия, 2004), научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2004 г.), XIX Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместимости (Стамбул, Турция, 2005 г.), XXVIII конференции «Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования» (Москва, 2005 г.), XX Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместимости (Осло, Норвегия, 2006), 9 симпозиуме по иммунобиологии тромбоцитов и нейтрофилов (Тромсе, Норвегия, 2006), XXI Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместимости (Барселона, Испания, 2007 г.), Второй конференции иммуногенетиков «Восток-Запад» (Прага, Чехия, 2007), конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии» (Москва, 2007 г.), Ученом Совете ГУ ГНЦ РАМН (22 мая 2007 г.), 10 симпозиуме по иммунобиологии тромбоцитов и нейтрофилов (Тун, Швейцария, 2008). Апробация диссертации состоялась на заседании проблемной комиссии Гематологического научного центра РАМН «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология; гемобластозы и депрессии кроветворения» (16 июня, 2008).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 50 печатных работ, в том числе: монография «Тромбоциты и антитромбоцитарные антитела», глава в монографии «Основы трансфузионной иммунологии», 2 главы в монографии «Очерки по производственной и клинической трансфузиологии», статья в Российской энциклопедии, 8 статей (перевод одной статьи опубликован в США) и 12 тезисов в центральных российских журналах, рекомендованных ВАК; 2 статьи за рубежом и 10 тезисов в материалах Международных симпозиумов и конференций, в том числе 4 в иностранных журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации