Введение к работе
Актуальность проблемы
Приобретенная апластическая анемия (АА) - заболевание системы крови, характеризующееся значительным уменьшением количества кроветворных предшественников, сопровождающимся замещением функционально активного красного костного мозга (КМ) инертной жировой тканью и панцитопенией (уменьшением количества клеток всех ростков кроветворения периферической крови). Существует несколько гипотез о причинах данного заболевания, однако точный механизм возникновения болезни до сих пор остается не ясным. На основании результатов некоторых экспериментов, а также достаточно успешного применения иммуносупрессивной терапии (ИСТ) на данный момент считается, что существенную роль в патогенезе апластической анемии играет неправильное функционирование иммунной системы. С другой стороны, отсутствие ответа на стандартное лечение у 30% больных и провалившиеся попытки найти аутоантигены, вызывающие неадекватный иммунный ответ, привели к поиску альтернативных гипотез, способных объяснить механизм возникновения данного заболевания.
Известно, что стволовые кроветворные клетки (СКК) функционируют в тесном контакте с кроветворным микроокружением. Важным компонентом кроветворного микроокружения, регулирующего СКК, являются веретеновидные остеобласты, формирующие вместе с другими клетками функциональную нишу для покоящихся СКК. Регуляция самоподдержания СКК в этой нише происходит, в том числе, за счет взаимодействия молекул ТГЕ-2, находящихся на их поверхности, и ANG-1, экспрессированных на остеобластах. Ниша для пролиферирующих СКК располагается в синусах костного мозга и связана с эндотелиальными клетками, экспрессирующими различные факторы роста. Одним из важнейших является фактор роста и регуляции клеток эндотелия VEGF. Адгезия СКК к нишам является принципиальной для их самоподдержания, и молекулы адгезии, в том числе VCAM-1, играют здесь значимую роль.
Нарушение взаимодействия стволовой кроветворной клетки со своим микроокружением может приводить к патологическим изменениям пролиферации и дифференцировки СКК. Так, анализ мезенхимных стромальных клеток (МСК) - одного из клеточных типов, составляющих кроветворное микроокружение, у больных с различными заболеваниями крови, в том числе с миелодиспластическим синдромом (МДС), показал их функциональную несостоятельность (Mayani, Н. 2007). В работе других авторов было показано, что концентрация фибробластов -потомков МСК в костном мозге была изменена у больных лейкозом по сравнению со здоровыми донорами (Nara, N.1984).
Было выдвинуто предположение, что у больных апластической анемией могут иметь место аналогичные нарушения в морфо-функциональных характеристиках МСК и их потомков. Однако
данные о способности стромального микроокружения костного мозга больных апластической анемией поддерживать кроветворные клетки оказались противоречивыми. В исследованиях 2-х групп ученых было продемонстрировано, что в отличие от длительных культур костного мозга доноров на стромальных подслоях больных АА кроветворение практически отсутствует (Marsh, J. 1996; Selleri, С, 1996). В то же время Новицкий Н. и соавторы (1995г.) не выявили различий способности к поддержанию кроветворения стромальными подслоями больных АА и здоровых доноров.
Таким образом, на данный момент отсутствует достаточная информация о роли стромального микроокружения в патогенезе апластической анемией. Исследование кроветворного микроокружения больных АА, а также изучение возможного изменения экспрессии важных для самоподдержания СКК генов (ANG-1, VEGF, VCAM-1) является необходимым для более глубокого понимания патогенеза заболевания, а также для понимания функционирования СКК и их взаимодействия со стромальным микроокружением костного мозга.
Цель работы:
Охарактеризовать in vitro стромальное микроокружение костного мозга больных апластической анемией.
Задачи исследования:
Сравнить способность мезенхимных стромальных клеток к росту и дифференцировкам больных апластической анемией и доноров.
Охарактеризовать способность к росту потомков мезенхимных стромальных клеток -колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕ-Ф) больных апластической анемией и доноров.
Проанализировать возможные изменения экспрессии генов, ответственных за поддержание стволовых кроветворных клеток (ANG-1), молекул адгезии (VCAM-1) и ростовых факторов (VEGF) в длительных культурах костного мозга (ДККМ) больных апластической анемией и доноров.
Научная новизна:
В данной работе in vitro впервые было продемонстрировано, что стромальное микроокружение больных апластической анемией изменено на уровне предшественников разной степени зрелости.
Были обнаружены изменения в способности МСК больных АА к длительному пассированию, накоплению суммарной клеточной продукции в культуре и скорости деления.
Нами было показано, что потомки МСК - колониеобразующие единицы фибробластов дают увеличенные колонии в культуре, а их концентрация в костном мозге повышена на начальном этапе болезни, что указывает на изменение пролиферативной активности данных предшественников.
Полученные в работе данные выявили, что при длительной иммуносупрессивной терапии оказывается как положительное, так и негативное воздействие на стромальное микроокружение. В ответ на терапию происходит активация стромы, что сопровождается увеличением уровня экспрессии генов ANG-1 и VCAM-1, важных для поддержания кроветворения. У больных АА, получавших иммуносупрессивную терапию более года, наблюдается нормализация параметров роста КОЕ-Ф, с другой стороны, МСК таких больных хуже проходят жировую и костную дифференцировки, что было отмечено в ходе гистохимического анализа и анализа уровня экспрессии молекулярных маркеров дифференцировки.
Научно-практическое значение работы:
Результаты, полученные в ходе данной работы, могут быть использованы в экспериментальной гематологии. Полученные данные способствуют пониманию роли стромального микроокружения костного мозга в патогенезе апластической анемии и вносят новый вклад в представления о механизме развития данного заболевания.
Положения, выносимые на защиту:
1. Мезенхимные стромальные клетки больных апластической анемией на первом этапе
течения болезни характеризуются увеличенной способностью к росту в культуре по сравнению с
донорами.
2. На этапе длительной иммуносупрессивной терапии способность мезенхимных
стромальных клеток больных апластической анемией к костной и жировой дифференцировкам
изменена по сравнению с донорами.
Основные характеристики колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕ-Ф) больных апластической анемией на начальном этапе течения болезни отличаются от таковых у доноров.
У больных апластической анемией, получающих продолжительную иммуносупрессивную терапию возможна нормализация параметров роста КОЕ-Ф.
5. На фоне длительной терапии может происходить активация стромального
микроокружения, выражающаяся в значимом увеличении экспрессии генов, участвующих в
регуляции стволовых кроветворных клеток.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.
Апробация работы
Диссертационная работа апробирована 19 октября 2009 года на заседании проблемной комиссии «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология; гемобластозы и депрессии кроветворения» Учреждения Российской академии медицинских наук Гематологического научного центра РАМН.
Материалы работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах:
" Нарушения экспрессии генов, регулирующих стволовые кроветворные клетки, в стромальных клетках больных апластической анемией ". XXX Международная Гематологическая Школа "Лейкозы. Терапия и фундаментальные исследования", Москва, 28-29 июня, 2006.
"Improvement of Hematopoietic and Stromal Cells Interaction after PTH Treatment of Long-Term Bone Marrow Cultures from Patients with Aplastic Anemia." The American Society of Hematology. 48th Annual Meeting and Exposition December 9-12, 2006.
"Alterations in osteoblastic and vascular niches revealed in adherent cell layers of long-term bone marrow cultures from patients with aplastic anemia." 12th Meeting of the European Hematology Association, Vienna, Austria, June 7-10, 2007.
Neutralization of supressive effect of blood serum from aplastic anemia patients on donor stromal cells by PTH treatment. 36th Annual Scientific Meeting, ISEH, Hamburg, Germany, September 28-30, 2007.
"Alterations of mesenchymal stromal cells in patients with aplastic anemia". 27th Meeting in Wilsede «Modern trends in human leukemia», Wilsede, Germany, June 14-18, 2008.
"Пролиферативный потенциал человеческих мезенхимных стромальных клеток (МСК) доноров и больных апластической анемией." Всероссийская научная школа-конференция Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования. Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова, Сентябрь 21-26. Москва 2009.
Структура и объем работы
Похожие диссертации на Характеристика in vitro стромального микроокружения костного мозга больных апластической анемией
![Клинико-иммунологическая характеристика больных ревматоидным артритом с анемией [Электронный ресурс]](/i/i/4501/197048.png "Клинико-иммунологическая характеристика больных ревматоидным артритом с анемией [Электронный ресурс] Сизиков Алексей Эдуардович")
