Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Молекулярные основы ревматоидного артрита (РА) 11
1.1.1. РА и инфекционные агенты. Теория молекулярной мимикрии ... 11
1.1.2. РА и недостаточность формирования
собственной толерантности 15
1.1.3. РА и генетические полиморфизмы генов МНС-комплекса 17
Ы.ЗЛ.Популяционные и близнецовые исследования
в изучении иммуногенетических основ РА 17
1.1.3.2. Теория общего эпитопа 20
1.1.3.3. Роль гаплотипов в развитии РА 27
1.2. Иммуногенетические исследования популяций 33
1.3.Происхождение башкирской популяции на территории Южного Урала..38
Глава 2. Материалы и методы исследования 40
2.1. Общая характеристика обследованных лиц 40
2.2. Методы исследования 42
2.2.1. Иммуногенетические методы исследования 42
2.2.1.1. Серологическое типирование 43
2.2.1.2. Молекулярное типирование 44
2.3. Статистическая обработка результатов 48
Глава 3. Результаты собственных исследований 51
3.1. Ассоциация генов HLA I и II класса с РА, возрастом начала заболевания,
иммунологическим вариантом и системными проявлениями РА в
башкирской популяции. Протекторные гены 51
3.1.1. Распределение антигеновHLAI класса. Локусы АиВ 51
3.1.2. Распределение генов HLAII класса. Локусы DRB1,DQA1 HDQBI 54
3.1.3. Распределение генов HLA в зависимости от вариантов РА 56
3.1.3.1.Распределение генов HLA в зависимости от возраста начала заболевания 56
3.1.3.2. Распределение генов HLA в зависимости от иммунологического варианта РА (наличия ревматоидного фактора) 58
3.1.3.3. Системные проявления РА и HLA-гены 61
3.1.4. Распределение аллельных специфичностей гена DRB1 04
и аллелей, кодирующих общий эпитоп 62
3.1.5. Протекторные гены. Гаплотипические сочетания гена DRB 1 07..64
3.2. Распределение гаплотипов у башкир с РА 66
3.2.1. Гаплотипы А-В 66
3.2.2. ГаплотипыВ-DRBl 66
3.2.3. Гаплотипы DRB1-DQA1 67
3.2.4. Гаплотипы DRB1-DQB1 67
3.2.5. Гаплотипы DQ3 HDQ5 68
3.3. Популяционные исследования башкир, проживающих на территории Южного Урала 69
3.3.1. Распределение антигенов HLAI —класса. Локусы А и В 70
3.3.2. Распределение генов HLA П-класса.
Локусы DRB1, DQА1 HDQBI 72
3.4. Анализ HLА-гаплотипов этнической группы башкир 74
3.4.1. Гаплотипы А-В 74
3.4.2. Гаплотипы B-DRB1 75
3.4.3. Гаплотипы DRB1-DQA1 75
3.4.4. Гаплотипы DRB1-DQB1 76
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 78
4.1. Особенности иммуногенетики РА в башкирской популяции 78
4.1.1. Сравнительный анализ распределения генов HLAI класса 78
4.1.2. Сравнительный анализ распределения генов HLAII класса 82
4.1.3. Зависимость различных вариантов РА от генов HLA 87
4.2. Особенности иммуногенетического статуса башкирской этнической группы 89
4.2.1. Сравнение распределения генов HLA у башкир с другими популяциями 89
4.2.2. Гаплотипические сочетания у башкир 100
Заключение 104
Выводы 105
Приложение 106
Список литературы 115
- РА и инфекционные агенты. Теория молекулярной мимикрии
- Иммуногенетические методы исследования
- Распределение генов HLA в зависимости от иммунологического варианта РА (наличия ревматоидного фактора)
- Особенности иммуногенетического статуса башкирской этнической группы
РА и инфекционные агенты. Теория молекулярной мимикрии
Недостаточность формирования собственной толерантности проявляется уменьшением на периферии количества Т-рег лимфоцитов и/или их цитокинов. Недавно установлено, что в тимусе чрезвычайно широко представлены тканеспецифические АГ (ТСА) большинства, если не всех, паренхиматозных органов. ТСА презентуются в основном тимическими эпителиальными клетками, и репертуар презентуемых аутоАГ определяет масштаб собственной толерантности, т.к. руководит отрицательной селекцией аутореактивных Т-лф и Т-рег. Количественные и качественные нарушения указанных событий, в т.ч. снижение экспрессии или потеря нескольких/многих генов, кодирующих презентируемые ТСА, приводят к появлению на периферии аутореактивных Т-лф, несущих высокоаффинный Т-клеточный рецептор (ТКР) для комплекса аутоАГпептид/HLA-II, снижению функционально эффективных Т-рег и развитию при определенных условиях аутоиммунного процесса.
В результате этого события иммунный ответ даже на банальные микроорганизмы становится гиперреактивным, сопровождается значительной деструкцией собственных клеток и тканей, что способно привести к перекрестному ответу как на собственный АГ (ауто-АГ), так и на модифицированный собственный АГ (нео-АГ) [19].
В любом случае, каков бы ни был механизм образования АГ, запуску аутоиммунной реакции способствуют определенные аллельные варианты классических (первого уровня) HLA генов I и II классов, которые прочно связывают и представляют нео-АГ и/или ауто-АГ Т-лимфоцитам. Например, количество аутоиммунных синдромов значительно выше в группе HLA DRB1 04, нежели в группе HLA-DRB1 02 положительных больных [85]. Однако не остаются в стороне и гены HLA III класса, т.к. активность воспалительной реакции, её пролонгированный характер, направленность (по типу ТІ или Т2) и протяженность (локальная/системная) будет определяться генами МНС второго уровня: аллельными вариантами генов цитокинов, комплемента и их рецепторов и т.д.
Итак, для включения ауто- и нео-АГ в иммунный ответ требуются различные факторы, которые условно можно разделить на две большие группы: генетические и средовые, в частности, инфекционные. Генетические особенности могут повлиять на общую иммунореактивность хозяина, а инфекционные - могут модулировать иммунный ответ хозяина и даже репрограммировать его.
Ассоциация аутоиммунных заболеваний с инфекцией и факторами окружающей среды подтверждается и исследователями ИЗСД [25], и рассеянного склероза [113]. Влияние этих факторов на развитие РА также показано в большом количестве работ [73, 108, 113, 141,].
Таким образом, несмотря на большое количество исследований, посвященных вопросам развития мультифакториальной патологии, до настоящего времени остается не ясным, каким образом инфекционный агент способен запустить аутоиммунный процесс. Одинаков ли механизм запуска при различных аутоиммунных заболеваниях? Могут ли бактерии, вирусы и другие микроорганизмы вносить вклад в хронизацию аутоиммунного процесса?
Некоторые авторы считают, что первоначальные изменения при РА и других аутоиммунных заболеваниях связаны не со специфической реакцией иммунного воспаления, а с неспецифическим воспалением, связанным с воздействием различных экзогенных стимулов [158]. Однако если аутоиммунные процессы не имеют специфического возбудителя, но процессы запуска и механизмы развития одинаковы, то остается открытым еще один из основных вопросов - вопрос о выборе органа-мишени при каждой частной нозологии. Одна из теорий, которая активно обсуждается в современной литературе - трансформация механизмов собственной толерантности, прежде всего включая механизмы, отвечающие за формирование центральной толерантности [114].
Как мы уже отметили, РА относится к аутоиммунным заболеваниям. Аутоиммунные заболевания встречаются наиболее часто в индустриальных странах, поражая приблизительно 3% популяции. Пораженность РА в различных популяциях составляет около 1-1,5%, но есть много интересных популяционных исследований, которые выявили отсутствие и, наоборот, повышение заболеваемости в отдельных этнических группах. Так, во многих сельскохозяйственных странах Южной Африки [73, 142], у евреев Израиля [99], в Юго-Восточной Азии, Китае и Японии заболевание встречается крайне редко [141, 160]. Но в изолированных племенах индейцев Америки пима и чиппева РА поражено до 5-7% популяции [143].
Этиология аутоиммунных заболеваний, в т.ч. РА, является комплексной, т.е. определяется характером генетических факторов и окружающей среды. Как показано в многочисленных семейных [12], близнецовых [75, 144] и популяционных исследованиях наследуемость предрасположенности к РА колеблется от 50% до 90%, оставляя на долю средовых факторов 10-50% [ПО].
Иммуногенетические методы исследования
Молекулярное типирование основано на анализе ДНК, позволяет идентифицировать непосредственно аллели HLA-генов. ДНК-типирование имеет существенные преимущества перед серологическим методом: отсутствие необходимости в использовании жизнеспособных лимфоцитов, возможность идентификации аллелей, не имеющих серологических аналогов, высокая точность результатов. Молекулярное типирование HLA генов позволяет установить нуклеотидную последовательность участков ДНК, которая характерна для определенной HLA специфичности.
Геномную ДНК для исследования выделяли из мононуклеарных клеток стабилизированной EDTA периферической крови, свежей или свежезамороженной и сохраняемой при -20С, согласно инструкции по применению набора реагентов для выделения ДНК («НПФ ДНК-Технология», Москва). Кровь в количестве 500,0 мкл центрифугировали при 13000g в течение 1 минуты в пластиковой пробирке типа «Eppendorf». Затем эритроциты удаляли путем обработки осадка 500,0 мкл лизирующего буфера с последующим центрифугированием при 13000g в течение 1 минуты. Процедуру лизиса повторяли до тех пор, пока надосадочная жидкость не становилась совершенно прозрачной. После окончательного удаления надосадочной жидкости при помощи автоматического дозатора, к осадку добавляли 60,0 мкл буфера, содержащего 250 мкг/мл протеиназы К, и ресуспендировали. Инкубировали с ферментом в течение 60 минут при +55С.
Инактивацию протеиназы после инкубации проводили нагреванием пробирки на водяной бане при +95С в течение 10 минут. После остывания конденсат осаждали центрифугированием при 13000g в течение 10-15 секунд. Раствор ДНК хранили при +4С до использования. Для длительного хранения ДНК замораживали при -20С. Определение аллелей HLA-DRB1, DQA1 uDQBl генов. Определение аллелей HLA-DRB1, DQA1 и DQB1 генов проводили методом полимеразной цепной реакции с помощью наборов реагентов («НПФ ДНК-Технология», Москва). Отличительной особенностью примененного метода является использование во время одной амплификации смеси нескольких пар праймеров (в наборе содержится 10 видов смесей), образующих в ходе ПЦР продукты различной длины. Это позволяет амплифицировать одновременно различные аллельные варианты исследуемого гена и идентифицировать их по соотношению ПЦР-продукта со стандартным маркером длин ДНК (PUC 19). Двухстадийная схема амплификации обеспечивает надежность и специфичность реакции. Амплификацию проводили на амплификаторе «ТЕРЦИК» той же фирмы. Общий объем реакционной смеси для амплификации в одной пробирке на всех этапах составлял 10 мкл, включая 4 мкл готовой смеси для амплификации, 5 мкл прилагаемого разбавителя №1,1 мкл исследуемой ДНК и 1 единицу термостабильной Taq-полимеразы. Типирование аллелей HLA-DRB1 гена
Определение аллелей HLA-DRBl-гена проводили с использованием набора сиквенс-специфических праймеров, позволяющим определять 13 групп аллелей (DRB1 01, 03 (17), 04, 07, 08, 09, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16). Амплификацию проводили в 2 этапа: 1 этап - амплификация II экзона DRB1 гена из выделенной ДНК. Продукт амплификации первого этапа (длиной 247 пар нуклеотидов), после 10-кратного разведения прилагаемым разбавителем №2, использовался как исследуемый материал на втором этапе типирования. 2 этап - серия амплификации со специфическими парами праймеров. Продукт, полученный в ходе амплификации, определяли методом горизонтального электрофореза в окрашенном бромистым этидием 3,3%-ом агарозном геле в ультрафиолетовом свете (310 нм). Специфичность продукта амплификации на всех этапах исследования оценивали в соотношении со стандартным маркером длин ДНК (PUC-19) (Таб. №2 и №3).
Продукт, полученный в ходе амплификации, определяли методом горизонтального электрофореза в 3,3%-ом агарозном геле. Специфичность продукта амплификации на всех этапах исследования оценивали в соотношении со стандартным маркером длин ДНК (PUC-19). Наличие в генотипе аллелей определяли по комбинации продуктов амплификации в соответствующих реакционных «смесях» согласно предложенной производителем набора схеме, аналогичной таковой, приведенной для локуса DRB1.
Распределение генов HLA в зависимости от иммунологического варианта РА (наличия ревматоидного фактора)
Кроме генов чувствительности к PA DRB1 01 и 04, мы выявили ассоциацию заболевания с геном DRB1 17 ( 03). Этот ген в целом хуже представлен в монголоидных, чем в европеоидных популяциях. Но мы не стали пренебрегать его относительно низкой частотой встречаемости и отсутствием достоверности, т.к. роль этого гена в развитии РА показана в некоторых исследованиях (у народов Кувейта) и его роль обсуждается при других аутоиммунных заболеваниях, например, СКВ [153] и ИЗСД [41]. Однако, влияние и этого гена, как мы обсуждали выше, не является самостоятельным, а проявляется в контексте единого гаплотипа А1-В8-DRB1 17.
Анализ распределения генов при различной аутоиммунной патологии показывает (ИЗСД, РА, АИТ, СКВ и т.д.) нередкое упоминание «общих» предрасполагающих генов DRB1 01, 04, 17; протективных - DRB1 07, ВІЗ и т.д. [2, 8, 33, 56, 61], что согласуется и с нашими данными. Наличие одинаковых генов предрасположенности при этих заболеваниях позволяет предположить единые механизмы развития этих аутоиммунных заболеваний, но оставляет открытым вопрос об инициаторе воспаления и выборе органа-мишени при каждой патологии.
Несмотря на приоритетную роль генов DRB1, обсуждается и влияние других генов HLAII класса - DQA1 и DQB1 на развитие РА [88]. Но т.к. гены локусов DQA1 и DQB1 находятся в неравновесном сцеплении с генами DRB1, то в большинстве литературных данных проводится анализ частот гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1. Более важным остается вопрос, какой из этих генов является основным в развитии РА?
В локусах DQA1 и DQB1 только повышение гена DQA1 0301 статистически достоверно в исследуемой группе - 46,0% и 22% в группе контроля, RR=3,02. Величина относительного риска выше 1 для генов этих локусов: DQA1 0101 (38,1% и 28% соответственно; RR=1,6), DQB1 0302 (15,9% и 6%; RR=2,96), 0303 (14,3% и 8%; RR=1,9), 0401/2 (9,5% и 4%; RR=2,5), 0501 (31,7% и 24%; RR=1,5). И хотя повышение частоты этих генов не достоверно, мы обратили внимание на то, что все эти гены образуют гаплотипы, объединенные под названием DQ3 и DQ5. БСХЗ-гаплотип — DQB1 03/DQA1 03 и DQB1 04/DQA1 03; DQ5-raroioran DQB1 0501/DQA1 0101 и DQB1 0501/DQA1 0104. Мы получили данные, которые согласуются с данными авторитетного исследователя проблем иммуногенетики РА Э. Занелли, который рассматривает действие генов DRB1 при наличии генов DQA1 и DQB1. Его гипотеза не противоречит теории «SE», но главными в развитии аутоиммунного процесса он видит гены гаплотипов DQ3 и DQ5. В популяционных исследованиях РА и недифференцированного артрита в экспериментальных работах на мышах Э. Занелли с соавторами продемонстрировали, что гаплотипы DQ3 и DQ5 сцеплены с любыми аллельными специфичностями генов DRB1 01, 04, 09 и 10 вне зависимости от того, кодируют или нет эти гены общий эпитоп. Э. Занелли склонен предполагать, что эффект генов DRB1 01, 04, 09 и 10 зависит от присутствия в гаплотипе DQ3 и DQ5. Т.е. молекулы DQB1 или DQA1, входящие в гаплотип DQ3 и DQ5, презентуют собственные DRB1-молекулы (в частности, речь идет о молекулах SE) Т-хелперам, и т.о. запускают иммунный ответ на собственный АГ определяя, таким образом, будет действие молекул DRB1 реализовано в развитии РА или нет.
В нашей работе 85,8% пациентов несли какой либо из гаплотипов DQ3 или DQ5 (либо их сочетания), в контрольной группе эта цифра равна 50%. Наибольшее число пациентов несли гаплотип DQ3 в сочетании с другими гаплотипами (41,3% против 22,0% в контроле), 31,7% пациентов несли другие варианты гаплотипов (не DQ3 и DQ5) и столько же пациентов были DQ5-позитивными (24,0% в группе контроля). Сочетания гаплотипов DQ3 и DQ5, также как и варианты DQ3/3 и DQ5/5 встречались чаще в группе больных, но не достоверно; в целом частота позитивных лиц по обоим из этих гаплотипов в обеих группах низка (от 0 до 4,8%).
Т.о., мы не исключаем роли этих гаплотипов в развитии РА у башкир, но в нашем исследовании не можем расставить приоритеты в гипотезах «SE» и «DQ3 и DQ5», оставляя решение вопроса «кто главный» другим ученым, которые в эксперименте смогут дать на него ответ.
Нами установлено снижение частоты встречаемости генов при РА в локусах DQA1 и DQB1, но данные статистически не достоверны, что не позволяет говорить об их выраженном протекторном эффекте. Несмотря на это, полученные данные заслуживают обсуждения, т.к. вновь перекликаются с результатами генетического типирования при ИЗСД: снижены гены DQA1 0102 (22,2% и 34%, RR=0,6) и 0103 (15,9% и 28%; RR=0,5), DQB1 0301(30,2% и 42%; RR=0,6) и 0602/8 (23,8% и 30%; RR=0,7).
Т.о., роль HLA-генов II класса в развитии и протекции РА у башкир приоритетна. Генами, предрасполагающими к развитию РА, являются гены общего эпитопа и гены, входящие в гаплотипы DQ3 и DQ5. Утверждать о первостепенности каких-либо из этих генов мы не можем, но можем предположить единые их эффекты в составе гаплотипических сочетаний. Протективную функцию несет гаплотип В 13-DRB1 07-DQA 1 0201-DQB 1 0201.
Особенности иммуногенетического статуса башкирской этнической группы
В здоровой башкирской популяции выявлено преобладание сцепленного монголоидного гаплотипа А2-В13 над европеоидным А2-В12. Расширенный гаплотип A2-B13-DRBl 13-DQAl 0103-DQBl 0602/8 характеризует монголоидные популяции в целом. Родоначальником этого гаплотипа являются гены ВІЗ и DQB 1 0602/8. Сцепление отдельных пар этого гаплотипа и частота их встречаемости является наиболее высокой в группе здоровых лиц, и несколько ниже - в группе больных РА. Ген DRB1 13, входящий в этот гаплотип, является общим геном африканских популяций, т.е. определяется в азиатских и европейских популяциях, и может находиться в гаплотипическом сочетании как с геном ВІЗ, так и с геном В17 в составе гаплотипа В57.1.
Анцесторный, т.е. предковый гаплотип B13-DQAl 0102-DQBl 0602/8 был выявлен не только в группе контроля, но и в группе больных РА. Частота отдельных генов, входящих в этот гаплотип, в группе больных оказалась ниже, чем у здоровых, но сила сцепления была высокой. Поэтому этот гаплотип может определять устойчивость к РА в башкирской популяции.
Второй вариант АН - B13-DRB1 07-DQA1 0201-DQB 0201 также выявлен в группах и больных, и контроля. Одна из составляющих этого гаплотипа - ген DRB1 07 - одинаково часто встречается у монголоидов и европеоидов, но в азиатских популяциях он сцеплен с геном ВІЗ, что определяет его принадлежность к монголоидной группе. Сила сцепления генов в этом гаплотипе высокая в обеих группах, однако, в группе больных частота встречаемости первых трех генов этого гаплотипа ниже, чем в группе контроля.
В сравниваемых группах оказалась высока частота гаплотипов А2-В40 и А9-В40. Их высокое представительство вполне предсказуемо, т.к. характеризует в целом монголоидные популяции. Но, как и в предыдущих описанных гаплотипах, сила сцепления у больных оказалась ниже, чем у здоровых.
Гены A3 и В7 хорошо сцеплены и вместе выявляются достоверно часто. АЗ-В7 входит в широкий гаплотип A3-B7-DRB1 15 DQA1 0102-DQB 1 0602/8 (7.1). Несмотря на то, что гаплотип 7.1 не устойчив, разрушается в процессе точковых мутаций и конверсии, возможно, благодаря изолированности башкирской популяции сохранил свое представительство целиком. В группе больных и здоровых частота и неравновесное сцепление отдельных пар гаплотипа 7.1. примерно одинаковы, и вероятно, он не участвует в развитии аутоиммунного процесса при РА, как при некоторых других аутоиммунных заболеваниях, например, СКВ.
Также можно отметить отсутствие сцепления генов в гаплотипе А2-В15, который служит маркером аутоиммунных заболеваний у европейцев. Этот гаплотип не проявил себя ни у больных, ни у здоровых башкир.
Гаплотип A1-B8-DRB1 17 (8.1) наиболее часто встречается в европейских популяциях и несет факторы риска развития РА и других аутоиммунных заболеваний в некоторых популяциях. Этот гаплотип в расширенном виде представлен следующей прописью: Al-Cw7-B8-ТКГАВ а2ЬЗ-ТМРЫ 8-С2 С-В 5-С4А до-С4В 1-ВКВ1 0301-ВКВЗ 0101-DQA1 0501-DQB1 0201 [166]. Гаплотип А1-В8 выявлен у здоровых лиц башкирской популяции в 1,88% случаев. В группе больных РА гаплотип А1-В8 имеет сильное сцепление и обнаружен в 4,5 раза чаще - в 8,4% случаев. Т.о., возможно, гаплотип 8.1 (или его составляющие) способен определять развитие РА и у башкир.
В составе какого гаплотипа представлен ген DRB1 04 у больных РА башкир? У европейцев аутоиммунные процессы часто связаны с гаплотипами B15-DRB1 04. Основной ген этого гаплотипа - В15. В группе больных можно выделить два гаплотипических сочетания этого гена: В15 102
DRBl 08-DQAl 0103-DQBl 0401/2 и B15-DRB1 08-DQA1 0401 DQB 1 0601/2, но ни один из этих гаплотипов не несет ген DRB1 04. Таким образом, гаплотип B15-DRB1 04 не отвечает за развитие аутоиммунных процессов у башкир, что может являться их особенностью, как популяции монголоидов. В обеих группах (как у больных, так и в контрольной) представлен «хвост» гаплотипа: DRB1 04-DQA1 0301-DQB 1 0301, но величина А и Н у больных в 2 и более раз выше, чем у здоровых, т.о., эти гены могут усиливать свое артритогенное действие в присутствии друг друга.
Ген DRB1 04, часто выявляемый в группе больных РА, слабо сцеплен со всеми генами локуса В в обеих группах. Возможно, что «несцепленная четверка» (DRB1 04) с геном В15 у больных начинает «вести себя самостоятельно», проявляя артритогенный эффект, а находясь в сцеплении, она этого действия не проявляет?
Т.о., отсутствие сцепления гена DRB1 04 с локусом В может определять его артритогенное действие либо артритогенное действие DRB1 04 проявляет, находясь в сцеплении с генами широкой специфичности 03 локусов DQA1 и DQB1, неся синергичный эффект?
В целом, при сравнении вариантов гаплотипов в башкирской популяции у здоровых и больных РА, мы выявили меньшее разнообразие сцепленных гаплотипов у больных. Даже такое простое сравнение косвенно может говорить о существовании аутоиммунных гаплотипов. Их длина не ограничивается только локусом HLA, как показано в литературных данных, но этот локус может быть основным, т.к. наиболее полиморфен и генетически более стар. Вероятно, что гены, входящие в гаплотип, могут как сдерживать, так и усиливать аутоиммунное действие друг друга.
Кроме этого, башкирская популяция, являющаяся в большей степени популяцией азиатской, «теряя» гены монголоидов и «приобретая» взамен их европеоидные, получала вместе с ними и предрасположенность к аутоиммунным заболеваниям, в частности, к РА.
Похожие диссертации на Иммуногенетическая характеристика ревматоидного артрита и HLA-генетический профиль башкирской популяции Южного Урала
![Клинико-иммунологическая характеристика больных ревматоидным артритом при различных аллельных вариантах генов ФНО-[А] (-308) и ИЛ-1[В] (+3953)](/i/i/4321/312305.png "Клинико-иммунологическая характеристика больных ревматоидным артритом при различных аллельных вариантах генов ФНО-[А] (-308) и ИЛ-1[В] (+3953) Герцог Оксана Александровна")
![Клинико-иммунологическая характеристика больных ревматоидным артритом с анемией [Электронный ресурс]](/i/i/4501/197048.png "Клинико-иммунологическая характеристика больных ревматоидным артритом с анемией [Электронный ресурс] Сизиков Алексей Эдуардович")
