Введение к работе
Актуальность проблемы:
Интенсивность противовирусного иммунитета определяется сложной системой межклеточных и медиаторных отношений, зависящей от иммунного статуса организма и особенностей конкретного возбудителя. Несмотря на то, что в настоящее время для лечения и профилактики социально значимых вирусных инфекций используется достаточно большое количество иммуномодуляторов и противовирусных препаратов (циклоферон, виферон, кагоцел, ридостин и др.), разработка и изучение новых препаратов (особенно - природного происхождения), обладающих противовирусными свойствами и повышающих резистентность к вирусным инфекциям, по-прежнему является актуальной задачей (Ершов Ф.И., 2006 г.).
Это связано с целым рядом обстоятельств, к важнейшим из которых следует отнести: недостаточную изученность механизмов действия многих известных препаратов на гуморальное и клеточное звено противовирусного иммунитета, на репродукцию и инфекционность вирусов, а также отсутствие у многих препаратов антивирусной активности непосредственно на этапах взаимодействия вирус-клетка. В частности, остается малоизученным влияние препаратов на основе растительных полиизопреноидов на синтез белков - иммуногенов вирусов.
В предыдущих исследованиях было показано, что фосфорилированные полиизопреноиды хвои сосны обладают противовирусной активностью в отношении вирусов иммунодефицита человека, гепатитаА, клещевого энцефалита (ВКЭ), чумы плотоядных, гриппа и др. (Санин А.В. и др., 1991; Sanin A.V. et al., 1992; Pronin A.V. et al., 1996; Danilov L.L. et al, 1997). Показана также способность природных полиизопреноидов подавлять размножение вирусов жёлтой лихорадки, инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ВИРТ КРС) в чувствительных культурах клеток (Ожерелков СВ., 2005). В настоящее время препараты фоспренил (ФП) и гамапрен (ГП), разработанные и внедренные в практику в ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН, широко и успешно используются для профилактики и лечения вирусных инфекций в ветеринарии. В то же время механизмы противовирусной активности этих препаратов остаются недостаточно изученными, в частности не изучено влияние препаратов на синтез основного иммуногена ВКЭ - белка Е.
Полиизопреноиды - интегральные компоненты прокариотических и эукариотических клеток; входя в филогенетически древнюю систему изопреноидов, они участвуют во многих важнейших процессах, происходящих в клетках (Наровлянский А.Н. и соавт., 2007). Препараты на основе фосфорилированных полиизопреноидов не являются ксенобиотиками, нетоксичны, нетератогенны (Деева А.В.и др., 2003). В то же время для внедрения таких препаратов в медицинскую практику
необходимо более детальное исследование механизмов их активности, в том числе в противовирусном иммунитете.
Известно, что формирование адекватного противовирусного иммунитета зависит от баланса иммунорегуляторных цитокинов (в частности, ИФН, ИЛ-4, ИН-12, фактора ингибирующего миграцию (МИФ), роль которых остается малоизученной (Носик Н.Н.,2000); недостаточно и данных о возможности применения иммуномодулирующих препаратов в качестве регуляторов продукции тех цитокинов, которые могут играть как защитную, так и повреждающую роль (развитие аутоиммунных, аллергических и других иммунопатологических реакций).
Инфекция, вызываемая ВКЭ, остаётся одной из социально значимых вирусных инфекций в России и ряде зарубежных стран. Несмотря на проводимую иммунопрофилактику (вакцинацию и введение иммуноглобулинов по эпидемическим показаниям), тенденция к увеличению заболеваемости клещевым энцефалитом (КЭ) по-прежнему сохраняется (Злобин В.И.,2007). При этом продолжается поиск и внедрение лечебно-профилактических препаратов против КЭ. Некоторые из них (йодантипирин, панавир) достаточно успешно зарекомендовали себя в медицинской практике (Ершов Ф.И.,2006). В то же время вышеуказанные препараты являются преимущественно интерфероногенами и применяются лишь для профилактики, но не лечения КЭ.
Вирус энцефаломиелита Тейлера (ВЭМТ) вызывает у мышей тяжёлую инфекцию, которая служит экспериментальной моделью рассеянного склероза за счет сходной патологии тканей ЦНС и вовлечения иммунной системы в развитие процесса демиелинизации (E.L.Oleszak, 2004). Поскольку ВЭМТ главным образом размножается в клетках макрофагального ряда (астроциты, клетки микроглии), изучение размножения ВЭМТ в клеточных макрофагальных культурах P388D1 представляет значительный интерес, как с точки зрения развития иммунного ответа, так и с точки зрения формирования персистенции вируса.
Вирус группы герпесвирусов ВИРТ КРС - является возбудителем распространённого и опасного заболевания КРС, для профилактики и лечения которого лекарственных средств до сих пор практически нет. (Белоусова Р.В. и др., 2000)
По-прежнему остаётся актуальной проблема поиска и внедрения
высокоэффективных адъювантов для противовирусных вакцин и
приготовления гипериммунных сывороток, используемых для диагностики социально значимых вирусных инфекций (Козлов В.Г. 2006 г).
Цель работы: изучение механизмов иммуномодулирующего и
противовирусного действия полиизопреноидов растительного
происхождения при экспериментальных вирусных инфекциях in vivo и in vitro, вызванных как безоболочечными ( ВЭМТ), так и оболочечными РНК-( ВКЭ) и ДНК-( ВИРТ)-содержащими вирусами.
Задачи исследования:
-
Исследовать влияние препаратов Фоспренил(ФП) и Гамапрен(ГП) на течение экспериментальных инфекций, для отработки оптимальной лечебно-профилактической схемы их применения.
-
Изучить механизмы противовирусного действия ФП и ГП на различных этапах взаимодействия вирус-клетка, включая созревание вирусных белков при экспериментальных инфекциях.
-
Изучить влияние ФП и ГП на синтез ряда иммунорегуляторных цитокинов in vivo и in vitro, как в норме, так и при экспериментальной вирусной инфекции.
-
Исследовать возможность применения ФП в качестве адыованта для вакцин и при изготовлении диагностических энтеровирусных сывороток.
Научная новизна
- Выявлена протективная активность исследуемых препаратов при
экспериментальных инфекциях. ГП в два раза удлиняет показатель средней
продолжительности жизни (СПЖ) у мышей, зараженных ВЭМТ (штамм GD
VII), ФП вызывает защиту 60% животных от высокопатогенного ВКЭ
(штамм Абсеттаров).
Установлено, что препараты ФП и ГП значительно снижают инфекционность вирусов ВКЭ и ВЭМТ в чувствительных культурах клеток P388D1 и ВНК-21, соответственно.
Впервые показано, что ФП и ГП проявляют противовирусную активность на этапе созревания вирусных белков в клетке. Установлено, что ГП снижает эффективность синтеза структурного белка VP3 ВЭМТ на ранних стадиях репродукции в клетках ВНК-21 и P388D1. Получены данные о значительном снижении накопления структурных белков ВКЭ и ВИРТ КРС in vitro в присутствии ФП или ГП.
Впервые исследована роль МИФ при экспериментальном КЭ в опытах in vivo и in vitro. Показано, что введение мышам, инфицированным ВКЭ, МИФ в дозе 40 нг/мышь приводит к значительному снижению показателя СПЖ. Введение антител к МИФ, напротив, защищает животных от высоколетального КЭ: показатель летальности у мышей, которым вводили AT к МИФ, был в 2 раза ниже, а показатель СПЖ - в 3 раза выше, чем у контрольных. Показано, что ФП подавляет вирусиндуцированную продукцию МИФ in vivo и in vitro.
Установлено, что включение ФП в технологический цикл промыпшенного изготовления диагностических энтеровирусных сывороток, стимулирует гігхздукцию специфических нейтрализующих антител к вирусам полиомиелита, ECHO. При этом нейтрализующая активность сывороток к полиовирусу возрастала в 3 раза, а активность сывороток к вирусу ECHO 5 -в У раза Показано, что ФП при однократном введении совмесшо с инакгивированной коммерческой вакциной прошв клещевого энцефалита (производства ФГУП<<ПИГШЭш.1.МГ1Чумакова>> РАМН) увеличивает ее протекгивную активность.
Практическая значимость
Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования ФП в качестве высоэффективного адъюванта для вакцин и при промышленном получении диагностических энтеровирусных сывороток. Механизмы противовирусного и иммуномодулирующего действия ФП и ГП, изученные в ходе данной работы, не только значительно расширяют спектр их использования в ветеринарной практике, но и создают базу для создания лекарственных форм препаратов для лечения и профилактики некоторых вирусных инфекций, играющих важную роль в инфекционной патологии человека.
Внедрение полученных результатов
Подготовлены методические рекомендации « Использование фоспренила в качестве адъюванта при получении диагностических гипериммунных сывороток к некоторым энтеровирусам» , утвержденные на Совете по внедрению научных достижений в практику в ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН( протокол №3 от 7февраля 2008г).
Апробация работы:
Материалы исследований были доложены на: межлабораторном семинаре молодых ученых ГУ Научно-исследовательского института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН (Москва, 2006 г), в свободной сессии научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней Воєнно - медицинской академии им. СМ. Кирова (Санкт- Петербург 2006).
Апробация диссертации состоялась на научной конференции отдела иммунологии ГУ НИИЭМ им.Н.ФТамалеи РАМН 27 июня 2007 года.
Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (52 отечественных и 100 зарубежных источников). Работа изложена на 154 страницах, иллюстрирована 18 таблицами и 12 рисунками.
