Исследование иммуноактивных свойств гуморальных факторов тимуса северного оленя Протопопов, Борис Владимирович

Введение к работе

M«c--^-pv Актуальность темы. В настоящее время с иммуноактивными "^"препаратами типической природы связываются большие надежды в плане их возможного применения с целью физиологической коррекции нарушенных функций клеток иммунной системы. Однако, с одной стороны, отсутствие четких разработок по их применении при различных иммунопатологических состояниях, информативных критериев по оценке их эффективности, а с другой - неясность механизмов их дєйстеея, не позволяет применять препараты тимуса в клинике с точно прогнозированным эффектом. Необходим и поиск новых высокоактивных полипептидных тимических экстрактов, обладающих селективным воздействием на отдельные субпопуляции функционально активных иммунокомлетентных клеток, а также выявление активных действующих пептидов и их композиций у производимых препаратов.

В настоящее время показаны свойства гормонов тимуса регу
лировать экспрессию многих универсальных и функционально ак
тивных мембранных глякопротеидов, представленных как на пред
шественниках Т-лимфонитов - sc-1 антигена (Яри'лин А.А. с соавт.
1086 ), ^РНА рецептора ( Baldasaare А. е.а. 1988 ), Thy-1

( Мпхна Н.Г. 1988 ), рецепторов к глгакокоргикоидам ( Ma D.D., Но а.н. 1984 ), а также и на зрелых формах Т-клеток - Е рецептора ( Goldstein A.L. 1975 ) и рецептора к ИІ-2 ( Sztein М., Serrate s. 1986 ) Кроме этого установлено, что ряд тимических

гуморальных факторов (ТИМОЗИН фракция 5 ( Talmadge J.Е., Lenz в. 1984} ТИМусный гуморальный фактор - ТНР ( Ehoham J., Eshel I. 1980 ) и TP-I ( Menconi е. е.а. 1980 ) проявляют свою актив-ность при реализации клетками иммунной системы своих эффектор-ных и регуляторних функций. Выявление механизмов действия тимических препаратов в отношении функциональной активности клеток иммунной системы является актуальной задачей. Учитывая важность экспрессии молекул гистосоЕместимости в процессах функционирования иммунокомлетентных клеток и в межклеточных взаимоотношениях, особое значение приобретает выявление способностей тимических гуморальных факторов к регуляции уровня экспрессии генных продуктов главного комплекса гистосовместимости (ГКГС).

Очевидно, что проблема гимической регуляции уровня экспрессии нъа антигенов на клетках иммунной системы важна в плане выявления механизмов действия гормональных факторов вилоч-

кобой железы. Решение этого вопроса позволило бы с новых позиций подойти к физиологической коррекции многих иммунопатологических состояний и значению тимической активности в функционировании иммунокомпетентных клеток.

Цель и задачи исследования. Изучить воздействие нового препарата из тимуса северного оленя - олевила, на функциональные свойства иммунокомпетентнюс клеток здоровых лиц в сопоставлении с фармакопейными типическими препаратами.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1.« Изучить воздействие олевила на уровни экспрессии iila антигенов I и II классов на поверхностных мембранах Т-лта|)оци-тов, их субпопуляциях с фенотипом CD4⁺ исоз⁺, не-Т-лимфоцитов и моноцитов периферической крови здоровых лиц.

1. Исследовать влияние олевила и его фракций на функциональную активность лимфоцитов, стимулированных аллогенными клетками в смешанных культурах.

2. Проанализировать взаимосвязи функциональной активности иммунокомпетентных клеток в смешанных культурах с уровнем экспрессии антигенов гиетосовместимости II класса на поверхностных мембранах отвечающих и стимулирующих клеток и их изменение при воздействии олевила.

3. Провести сравнительный анализ шмуномодулирущей активности олевила с другими тимическнми препаратами - тактивином, тималином и их синтетическим аналогом - тимогеноы.

Основные результаты исследования и их новизна. В результате изучения иммуноактившх свойств нового препарата из вилоч-ковой железы северного оленя - олевила (название условное), выявлены его механизмы действия на функциональную активность лимфоцитов периферической крови здоровых доноров.

Методами двойной иммунофлуоресценции с панелью моноклонаяъ-ных антител (МкАТ) впервые установлено, что тимические гуморальные факторы, в том числе олевил, увеличивают уровень экспрессии hla-dr антигенов на Т-лимфоцитах, что является признаком активации данного класса клеток иммунной системы. Показано, что клетками-мишенями для олевила являются и не-Т-лимфоциты, на поверхностной мембране которых наблюдается снижение суммарного количества HLA-DR МОЛеКуЛ.

Впервые показано, что тимические гуморальные факторы воздействуют на процессы экспрессии hia-dr молекул гистосовмести-мости на поверхностных мембранах регуляторних субпопуляций Т-лимфоцитов с фенотипом CD4⁺ и CD8⁺. При этом наблюдаются процессы преимущественной активации Т-клеток с хелперно-индуктор-ными свойствами, что выражается е инверсии баланса экспрессии hla-dr антигенов на сщ⁺ .и era* Т-лимфоцитах в сторону преобладания dr молекул на субпопуляций хелперов/индукторов.

Установлено, что тимические гуморальные факторы модулируют уровень функциональной активности лимфоцитов. Модулирующий эффект препаратов зависит от исходного уровня параметров активации и функционального состояния Г-лимфоцитов и максимально проявляется на клетках, обяадавдих низкой пролиферативной активностью в СКЛ и минимальным содержанием hla-dr молекул на поверхностной мембране.

Выявлены фракции олевила, обладающие наивысшей активностью в отношении экспрессии антигенов II класса ГКГС и функциональной активности лимфоцитов периферической крови. При этом установлено, что в состав олевила входят полипептиды, оказывающие как селективное действие на Т— или В-лимфоциты, так и проявляющие активность в отношении обоих классов иммунокомпетентяых клеток.

Впервые проведенный сравнительный анализ активности отечественных тимических препаратов тактивина, тжмалина и тим стена на функциональные СЕОйства клеток иммунной системы в СКЛ и сопоставление их эффектов с таковыми олевила, позволили сделать вывод о наибольшей, активности олевила, его полипептидных фракций и тимогена.

Детальное сопоставление механизмов дєйстеия олевила и так-тиЕина показало их схожесть в отношении Т-звена иммунитета и различие е воздействии на В-клетки.

Практическая значимость. Выявленные иммуномодулирующие свойства препарата тимической природы - олевила, позволяют ожидать положительный эффект при использовании препарата е клинике у больных с иммунопатологическими процессами, сопровождающимися дефектами хелперных Т-лимфоцитов. Определена активность и установлены дозозаЕисимые эффекты олевила и его полипептидных фракций на исследованные параметры клеток-мишеней, что позволяет рекомендовать применение препаратов в конкретных дозировках,

Модифицированный метод двухцветной полтічєсте-єеноп пзго-флуориметрии с Г.'кАТ к первичная адлогенная СКЧ ^г,огут быть рекомендованы в драк тику научных лабораторій каз: тест-еисте:;к для оценки и сравнения активности тимнчесхих гуморальных факторов.

Предложен метод оценки свойств им:.туноакткы:ых препаратов по их способности активировать регулягорше су Or.cirv дядин ?-дам-фоцитов с фенотипом CD4⁺ и CD8⁺, что является '.шХорыатпЕкк-.' критерием при определении направленности деіісг::;:я :» ргг:;гь?і5-РУЕщего эффекта препаратов.

Разработаны принципы подбора дон open, ли;,; ?o:ihtl: которых обладает наибольшей чувствительностью к деист:: яз регуляторних типических факторов и могут быть нслользовзня г теот-онеггг'ах для определения и сравнения активности различный типически:: препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Тимические гуморальные факторы оказывает воздействие на экспрессию HLA антигенов II класса, локализованных ка дсЕэрхно-стной мембране CD4⁺ и CDS⁺ позитивных субклассов Т-лимчснятое, однако эффекты следила шире и проявляются ве только на Т-клег-ках, но н на не-Т-лимфоцитах.

2. Иммунологическая активность следила связана с пре:::,:у-ществекной активацией и усилением функционально:; активности хел-перно-шдукторкых Т-димфоцдтов с фенотипом cd4⁺,er⁺, что подтверждается максимальным эффектом препарата к моменту пика про-ЛЕфвративноЯ активности Г-хелперов в СКЛ.

3. Гуморальные факторы тимуса северного оленя с различной молекулярной массой способны изменять функциональную активность лимфоцитов и воздействовать на уровни экспрессии hla-de антигенов на поверхностных мембранах Т- и не-Т-лимфоцитов, при этом эффекты' и активность ряда фракций отличаются от таковых, присущих цельному препарату олевил.

4. Тест-система регистрации поверхностных маркеров активации на различных субклассах лимфоцитов периферической крови в сочетании с принципами отбора доноров клеток крови позволяет проводить скрининг активности тимических гуморальных факторов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста. Состоит из внздения, обзора ли-

тературы, описания материалов к методов, результатов исследования и их обсуждения, кзлс.тєякчх в 6-ти главах, заключения з внЕодоЕ. Иллюстрирована 23 таблицами и 9 рисунками. Список литературы состоят из 196 источников, из них 39 отечественных автороЕ.

Апробация работы и публикации. Материалы работы били ло— ложены и обсуздены на региональной конференции иммунологов Сибири и Дальнего Востока "Иммунология на Востоке страны" (Красноярск, 1968 г.), Ї Всесоюзном симпозиуме по жммуногенетике (Новосибирск, 1989 г.), Г Всесоюзном съезде иммунологов (Дагомыс, 1989 г.), конференции молодых ученых СО АШ СССР "Молодые ученые медики - науке и практическому здравоохранению" (Новосибирск, 1989 г.), конференции молодых ученых Сибири и Дальнего Востока (Красноярск, 1990 г.). По теме работы имеется положительное решение о выдаче авторского свидетельства на заявку й 4678398 "Способ получения имыуноактивных тимусных полипептидов" .

Диссертация апробирована на расширенном семинаре Института клинической ит.щупологий СО АМН СССР 14 нарта 1991 года. По тегзо диссертации опубликовано 6 печатных работ.