Содержание к диссертации
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙАктуальность проблемы
Цель и задачи исследования
Научная новизна
Практическая значимость исследования
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Первичное заражение М. tuberculosis
1.2. Т- клеточный иммунитет при туберкулезной инфекции
1.3. Механизмы протективного действия Т-лимфоцитов CD
1.3.1. Субпопуляции Т-лимфоцитов CD
1.3.2. Роль лимфоцитов Thl и Th2 в протекции при туберкулезной инфекции
1.3.3. Роль лимфоцитов Treg и ТЫ7 в протекции при туберкулезной инфекции
1.4. Дифференцировка ТЫ Т-лимфоцитов CD
1.5. Роль CD27 в дифференцировке эффекторных Т-лимфоцитов
Введение к работе
Актуальность проблемы В настоящее время туберкулез (ТБ) является одной из самых распространенных и опасных инфекционных болезней в мире. По данным Всемирной Организации Здравоохранения в течение последних десяти лет зарегистрированы 90 миллионов новых случаев заболевания активным туберкулезом и около 30 миллионов смертей от этого заболевания [WHO].
Несмотря на то, что вакцинация детей вакциной BCG охватывает около 85% населения Земли и что в основном устранен дефицит противотуберкулезных препаратов первого ряда, по данным ВОЗ за 2004 г. в мире зарегистрировано
14,6 млн. больных ТБ, в том числе 8,9 млн. новых случаев. Смертность от ТБ составляет 1,5-2 млн. в год [WHO; Frieden et al., 2003].
Основными подходами к лечению и профилактике туберкулеза являются химиотерапия и вакцинация BCG, однако оба они часто оказываются неэффективными. Так, химиотерапия не эффективна при устойчивости штаммов М. tuberculosis к применяемым антибиотикам, а распространенность таких штаммов в мире постоянно нарастает. К этой категории относятся штаммы, резистентные к одному-двум препаратам, к нескольким препаратам первого ряда (MDR-штаммы) и ко многим препаратам первого и второго ряда
(XDR-штаммы) [Espinal et al., 2001; Migliori et al., 2007]. Эффективность вакцины BCG для профилактики заболевания ТБ колеблется от 0 до 80 процентов в разных популяциях [Colditz, 1994]. Причины такой вариабельности остаются неясными, несмотря на ряд попыток разобраться в этом вопросе.
Наконец, на частоту ТБ с клиническими проявлениями существенно влияет пандемия ВИЧ-СПИД [Corbett et al., 2003]. Таким образом, неблагоприятное влияние на ситуацию оказывают факторы, связанные как с паразитом, так и с хозяином, и все они имеют глобальное распространение.
Разработка новых противотуберкулезных вакцин и лекарств, эффективных против ТБ, требует точных знаний о том, каким образом происходит формирование противотуберкулезного иммунного ответа и какие клеточные и молекулярные механизмы обеспечивают протекцию при туберкулезной инфекции. Считается, что одним из основных факторов защиты при туберкулезной инфекции являются Т-лимфоциты с фенотипом CD4+. В очаге инфекции эффекторные лимфоциты CD4+ продуцируют IFN-y, который активирует как прямую антпмикобактериальную активность макрофагов, так и выработку последними TNF-ct и IL-12 - главного индуктора самого IFN-y [Collins and Kaufmann, 2001; Mogues et al., 2001; Cooper et al., 2002; Апт и др., 2008]. В связи с этим дифференцировка Т-лимфоцитов и образование клеток, секретирующих IFN-y, - это ключевые события в адаптивном иммунном ответе при туберкулезной инфекции. До настоящего времени подробно были изучены лишь процессы дифференцировки, происходящие в лимфатических узлах.
Однако открытым оставались вопросы о том, что происходит собственно в легочных очагах инфекции, через какие стадии проходит клетка в процессе дифференцировки, существуют ли специфические маркеры клеток, находящиеся на разных этапах дифференцировки, на какой стадии дифференцировки клетки приобретают способность мигрировать в очаг инфекции.
Ранее И. Лядовой и соавторами было показано, что после иммунизации мышей BCG пул активированных легочных Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+ CD44 l l lghCD62L low включает две субпопуляции, отличающиеся по уровню экспрессии молекул CD27. Высокой способностью к продукции IFN-y обладают только лимфоциты CD62L lowCD27 low [Lyadova et al., 2004]. Однако до настоящего времени оставалось невыясненным, отличаются ли эффекторные лимфоциты CD62LIowCD27high и CD62LI o wCD27 l o w по другим характеристикам, каковы взаимоотношения между этими субпопуляциями в процессе дифференцировки, и какова роль каждой из них в формировании протективного иммунитета при экспериментальной туберкулезной инфекции. Эти вопросы и определяют актуальность данной работы.
Цель и задачи исследования Значительная часть информации о патогенезе ТБ и иммунном ответе на инфекцию была получена в эксперименте. Недаром рабочее совещание NIH по исследованию ТБ рекомендовало считать моделирование инфекции на лабораторных животных методом выбора для анализа патогенеза, иммунного ответа и генетического контроля заболевания [Smith et al., 2005]. Как и при других медико-биологических исследованиях, основным объектом для изучения экспериментального ТБ послужили инбредные лабораторные мыши, что объясняется следующими причинами.
Основные характеристики первичного и адаптивного иммунного ответа на микобактерии, в частности, защитная роль Т-лимфоцитов CD4+, IFN-y и TNF-a, сходны у человека и мыши [North, Jung, 2004]. Показано, что при заражении генетически резистентных к туберкулезу мышей низкими дозами микобактерии у них развивается выраженный иммунитет к М. tuberculosis, способный в течение долгого времени контролировать размножение микобактерии, что приводит к хронической туберкулезной инфекции.
Латентный туберкулез, развившийся на фоне лечения антибиотиками у генетически чувствительных мышей, как и у людей, может спонтанно реактивироваться и переходить в активную форму [Радаева и др., 2002; Radaeva et al., 2005; 2008]. Мыши незаменимы для генетического анализа, в том числе для обширных экспериментов по генетическому картированию в масштабах всего генома, благодаря наличию огромного числа инбредных конгенных, рекомбинантных и мутантных линий с разной чувствительностью к туберкулезу [Fortin et al., 2007; Yan et al., 2006]. Наконец, исследования на лабораторных мышах обеспечены бесконечным рынком реактивов и тест-систем для иммунологических и генетических экспериментов, тогда как для других лабораторных животных аналогичный рынок достаточно скуден. Поэтому сформулированные нами цель и задачи исследования базируются на изучении туберкулезной инфекции на модели лабораторных инбредных мышей.
Целью работы стало исследование направления дифференцировки, фенотипов и функциональной активности Т-лимфоцитов CD4+ в лимфоидных органах и легких при туберкулезной инфекции у мышей.
В связи с этим, были поставлены следующие задачи:
1. Сравнить функциональную активность Т-лимфоцитов CD4+ с различным уровнем экспрессии поверхностного маркера дифференцировки CD27.
2. Ркследовать динамику перехода (дифференцировку) Т-лимфоцитов между фазами CD27hlgh и CD27 l o w при иммунном ответе на антигены микобактерий in vitro и in vivo.
3. Изучить влияние лимфоцитов CD4+CD27high и CD4+CD27 low на бактериостатическую активность макрофагов.
4. Провести количественную оценку пула лимфоцитов CD4+CD27 l g и CD4+CD27Iow в органах зараженных мышей с различной генетической чувствительностью к туберкулезной инфекции.
Научная новизна
1. Впервые проведено детальное исследование конечных этапов дифференцировки эффекторных Т-лимфоцитов CD4 и охарактеризованы изменения их поверхностного фенотипа.
2. Разработана модель для изучения дифференцировки эффекторных лимфоцитов CD4+ in vitro и продеманстрировано, что Т-лимфоциты CD4+CD62L lmvCD27 lmv образуются из предшественников CD4+CD62L lmvCD27h,gh при ответе на антигены микобактерий.
3. Впервые показано, что при туберкулезе окончательная дифференцировка Т-лимфоцитов-эффекторов CD4+CD62L o w CD27 l o w из предшественников CD4+CD62L l0WCD27hish происходит in situ в легких.
4. Установлено, что субпопуляция Т-лимфоцитов CD4+CD62L lowCD27 low отличается от субпопуляции CD4+CD62LIowCD27hlgh более высоким уровнем экспрессии генов регуляторных и эффекторных цитокинов и хемокинов.
5. Впервые показано, что уровень апоптоза субпопуляций Т-лимфоцитов CD4+CD62L l0WCD27high и CD4+CD62L lowCD27 low разный в разных органах.
6. Обнаружено, что классические регуляторные Т-лимфоциты с фенотипом CD25h,g Foxp3+ принадлежат к субпопуляции Т-лимфоцитов CD4+CD62L lowCD27high.
7. Впервые проведено исследование влияния различных субпопуляций эффекторных Т-лимфоцитов CD4 на бактерицидную активность макрофагов и показано, что Т-лимфоциты CD4+CD62L lowCD27 low намного эффективнее активируют макрофаги в системе in vitro, чем клетки CD4+CD62L,0WCD271,igh.
8. Впервые показано наличие прямой корреляции между накоплением в легких Т-лимфоцитов CD4+ CD62L l o wCD27 l o w и уровнем протекции против туберкулезной инфекции Практическая значимость исследования Получены данные о характере поверхностного фенотипа эффекторных Тлимфоцитов при экспериментальной туберкулезной инфекции. Эти данные могут быть использованы для оценки эффективности Т-клеточного ответа у больных ТБ. Помимо этого, полученные результаты позволяют по-новому понять процессы дифференцировки и регуляции активности Т-лимфоцитов, что важно учитывать при разработке подходов к иммуномодуляции при туберкулезе.
Хотя работа носит экспериментальный характер и посвящена выяснению фундаментальных механизмов иммунного ответа, полученные результаты могут оказаться важными для понимания легочной патологии и динамики защитных и деструктивных тканевых реакций у больных туберкулезом. Это может помочь разработке новых средств патогенетической терапии, в частности целенаправленной регуляции воспалительных реакций при туберкулезе.
Материалы диссертации используются в курсе лекций для аспирантов и ординаторов ЦНИИТ РАМН.
