Введение к работе
Актуальность исследования. Стрептококки группы A (Streptococcus pyogenes) относятся к наиболее распространенным возбудителям постинфекционных поражений сердца и почек. Ревматическое поражение сердца и острый постстрептококковый гломерулонефрит - это тяжелые иммунопатологические заболевания, поражающие в основном детский и юношеский контингент. Часто эти нозологические формы протекают остро, но имеют тенденцию к хроническому течению, что может приводить к глубокой инвалидизации больных. Поэтому изучение патогенеза стрептококковых осложнений иммунопатологического характера сохраняет свою актуальность не только для практического здравоохранения, но и для медицинской науки.
Несмотря на многочисленные экспериментальные и клинические исследования, данные о патогенезе указанных заболеваний нельзя считать исчерпывающими (Артем А-Тотолян и ЛА.Бурова, 2001; Stevens D.L., 2000; Qumingham M.W., 2000, 2004). В основе их патогенеза в качестве факторов, инициирующих иммунопатологические поражения, наиболее часто рассматриваются следующие: а) перекрестно-реагирующие антигены микроба (стрептококка группы А) и тканей организма хозяина (почки, сердце); б) поверхностные белки стрептококковой клетки, способные взаимодействовать с Fc фрагментом молекулы IgG хозяина, так называемые стрептококковые IgG Fc-связываюшяе белки семейства М протеинов. Исследованиями, проведенными в Отделе молекулярной микробиологии ГУ НИИЭМ РАМН, была выявлена биологическая активность IgG Fc-связывающих белков стрептококков группы А, заключающаяся в их способности влиять на вирулентность микроба в опытах in vivo, способствовать устойчивости микроба к фагоцитозу, истощать систему комплемента, индуцировать синтез антииммуноглобулинов при введении экспериментальным животным (Л.А-Бурова, В.А.Нагорнев и др., 1999). Эти данные легли в основу выдвинутой концепции о механизмах развития экспериментального стрептококкового гломерулонефрита и миокардита, нашедшей подтверждение в ряде выполненных впоследствии исследований (Артем А-Тотолян, Л.А.Бурова и др., 2001, 2003). В экспериментах деструктивно-дегенеративный процесс в миокарде и в почечных клубочках обычно развивался между 4-й и 8-й неделями от начала введения кроликам стрептококковых клеток. Вызывался процесс исключительно IgG Fc-позитивными, но не IgG Fc-негативными штаммами стрептококков группы А. При экспериментальном воспроизведении гломерулонефрита микробами, обладающими другими типами IgG Fc - связывающих белков, он развивался крайне редко при использовании стрептококков серологической группы G и отсутствовал при введении кроликам Staphylococcus aureus. Экспериментальные данные позволили оценить IgG Рс-связывающие белки стрептококков группы А в качестве
2 инициирующих факторов, ответственных за иммунное воспаление и деструктивные изменения в сердечной и почечной тканях. Настоящая работа является логическим продолжением проводимых в Отделе молекулярной микробиологии исследований по доказательству способности IgG Fc-связывающих белков индуцировать экспериментальные иммунопатологические процессы в почечной и сердечной тканях для уточнения их патогенетических механизмов.
Цель работы заключалась в получении доказательств патогенетической роли стрептококковых IgG Гсчшязывающих М подобных белков в инициации экспериментальных иммунопатологических процессов. Задачи исследования:
1. Дать сравнительную оценку экспериментальных моделей изучения патогенеза
стрептококкового гломерулонефрита, для этого:
адаптировать на кроликах «мышиную» модель стрептококкового гломерулонефрита с использованием подкожно имплантированных тканевых камер;
исследовать способность стрептокиназы в опытах in vitro трансформировать пяазминогеи различной видовой специфичности в плазмин.
2. Исследовать способность изогенных мутантов стрептококка группы А типа М22,
дефицитных по генам (етт и игр), ответственным за синтез стрептококковых IgG Fc -
связывающих М подобных белков, индуцировать экспериментальный гломерулонефрит и
миокардит у кроликов.
3. Изучить способность стрептококков группы А типа М12 связывать иммунные комплексы
и определить роль подобного связывания в индукции экспериментального
гломерулонефрита.
Исследовать способность Fc фрагментов IgG блокировать развитие у кроликов стрептококкового гломерулонефрита.
Определить роль стрептококковых IgG Fc-связывающих М подобных белков в индукции иммунного воспаления в миокарде и развитии экспериментального миокардита. Научная новизна и теоретическая значимость работы. Впервые получены данные по сравнительной характеристике двух экспериментальных моделей стрептококкового гломерулонефрита. С этой целью «мышиная» модель с подкожно имплантированными тканевыми камерами была адаптирована к использованию на кроликах. Было установлено, что:
- высокая летальность кроликов при введении им «живых» клеток высоко вирулентного
стрептококка типа Ml ограничивает использование более широкого набора штаммов
стрептококков в экспериментах по исследованию их «нефритогенной» потенции;
- создание локального очага инфекции в подкожно имплантированных тканевых камерах позволяет делать акцент в основном на роли экстрацеллюлярных продуктов микробной клетки, и не оценивает роль основных факторов патогенности стрептококков, к которым в первую очередь следует отнести IgG Fc-связывающие М подобные белки. Таким образом, модель экспериментального гломерулонефрита, разработанную в Отделе молекулярной микробиологии, можно считать более адекватной патологии человека.
Введение стрептококков группы А типов Ml и М22 и их ska изогенных мутантов в тканевые камеры не выявило роли стрептокиназы в индукции гломерулонефрита у кроликов, так как: а) не было установлено разницы в «нефритогенной» активности между исходными штаммами и их ska изогенными мутантами; б) стрептокиназа из указанных штаммов стрептококков не обладала способностью трансформировать плазмияоген кролика вплазмин.
Впервые исследована способность стрептококков группы А типа Ml2, референс-штамма и клинических изолятов, выделенных от больных с острым постстрептококковым гломерулонефритом, взаимодействовать с искусственно-образованными иммунными комплексами. Только клинический изолят, также как и референс-штамм, связывающие в опытах in vitro иммунные комплексы, были способны при введении кроликам индуцировать деструктивно-дегенеративные изменения в почечной ткани, характерные для мембранозно-пролиферативного гломерулонефрита.
Впервые показана способность Fc фрагментов IgG кролика и человека, но не Fab фрагментов IgG, введенных животным на начальной стадии экспериментального гломерулонефрита, блокировать его дальнейшее развитие.
Впервые получены генетические доказательства роли IgG Fc-связывающих М подобных белков Emm22 и Мгр22 в инициации и развитии поражений почечных гломерул и миокарда.
Работа носит экспериментально-теоретический характер. Проведенные исследования являются вкладом в изучение общих патогенетических механизмов иммунопатологических процессов стрептококковой этиологии. Полученные данные доказывают ведущую роль IgG Fc-связъшаклпих М подобных белков в патогенезе экспериментальных гломерулонефрита и миокардита.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Исследование патогенетических механизмов развития иммунопатологических процессов стрептококковой этиологии зависит от выбора оптимальной экспериментальной модели, наиболее адекватной патологии человека
«Нефритогенная» активность IgO Fc-негативных стрептококков группы А типа М12 обусловлена их способностью связывать иммунные комплексы. Только штаммы, связывающие иммунные комплексы, были способны индуцировать гломерулонефрит у кроликов.
Введение кроликам Fc фрагментов гомологичного или гетерологичного IgG на ранних этапах развития патологического процесса в почечной ткани, обусловленного стрептококком группы А, приводило к подавлению проявлений деструктивно-дегенеративных изменений в почечных гломерулах.
Использование нзогенных мутантов стрептококка группы А типа М22, дефицитных по генам, ответственным за экспрессию IgG Fc-свяывающих М подобных белков, показало, что для индукции экспериментального гломерулонефрити и миокардита у кроликов достаточно наличия одного из двух генов (етт или тгр), контролирующих синтез соответствующих IgG Fc-связывающих белков. Изогенный мутант, полностью лишенный обоих указанных генов, был не способен индуцировать патологический процесс в почечной и сердечной тканях. Личный вклад автора в проведение исследований: все препараты, их очистка, схемы введения, а также работа с экспериментальными животными были выполнены лично автором. Иммуноморфологические исследования были выполнены в сотрудничестве с гистологами. Вклад остальных соавторов состоял в предоставлении ряда необходимых реактивов и финансовой поддержке при выполнении экспериментального раздела данной работы.
Апробация работы. Материалы диссертационного исследования доложены на 6-ти симпозиумах и конференциях: на Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2004, 2006), на Юбилейной конференции молодых ученых Северо-Западного региона, посвященной 60-летию Российской Академии медицинских наук (Санкт-Петербург, 2004), на Международной научно-практической конференции молодых ученых Одесского Государственного медицинского Университета (Одесса, 2004), на XV и XVI Международных Симпозиумах по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям имени Ленсфилд (2003, 2005).
Материалы диссертации были апробированы на заседании Отдела молекулярной микробиологии ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН 11 декабря 2006 года. Проведенные исследования были поддержаны грантом РФФИ - 02-04-49223 и грантом Президента Российской Федерации НШ-2206.2003.4. Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них - 5 статей.
5 Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 103 страницах машинописного текста, включающего в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, пять глав собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и список литературы. Работа проиллюстрирована 10 таблицами и И рисунками. Список литературы содержит 180 источников, в том числе 16 отечественных и 164 иностранных.
