Содержание к диссертации
Стр.
Список сокращений 4
ВВЕДЕНИЕ 6
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
-
Механизмы иммунной толерантности матери к плоду. 13 Гипотезы и факты
-
Характеристика иммунной системы в период 15 беременности
-
Роль хорионического гонадотропина в регуляции 23 процессов иммунитета
-
Женские половые стероиды как регуляторы иммунных 37 реакций
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 46
-
Гормоны и ингибиторы 46
-
Объекты исследования 47
-
Культивирование клеток 49
-
Методы исследования 52
-
Статистическая обработка результатов 59 Глава 3. ВЛИЯНИЕ ГОРМОНОВ РЕПРОДУКЦИИ НА 60 ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ ТИМОЦИТОВ
Глава 4. РОЛЬ РЕПРОДУКТИВНЫХ ГОРМОНОВ В 82
КОНТРОЛЕ АКТИВНОСТИ ЗРЕЛЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ
-
Влияние репродуктивных гормонов на пролифертивную 82 активность Т-лимфоцитов
-
Гормон-зависимая регуляция апоптоза Т-лимфоцитов 90
4.3. Влияние репродуктивных гормонов на продукцию 105
цитокинов Т-лимфоцитами периферической крови
Глава 5. ГОРМОНЫ РЕПРОДУКЦИИ В РЕГУЛЯЦИИ
ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ 120
-
Влияние репродуктивных гормонов на фагоцитарную 121 активность нейтрофилов
-
Гормон-зависимая регуляция окислительной активности 126 нейтрофилов
-
Роль репродуктивных гормонов в регуляции апоптоза 139 нейтрофилов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 151
ВЫВОДЫ 174
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 177
Список сокращений
АКМ - активные кислородные метаболиты
АОК - антителообразующие клетки
АФП - а-фетопротеин
АЭТ - аминоэтилизотиурониум бромид
ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа
ДН-тимоциты - дубль-негативные (CD4"CD8") тимоциты
ДП-тимоциты - дубль-позитивные (CD4+CD8+) тимоциты
ЕК - естественные киллеры
ИЛ - интерлейкины
ИФНу - интерферон у
ЛГ - лютеинизирующий гормон
ЛГ/ХГ-Р - рецептор для лютеинизирующего гормона и
хорионического гонадотропина
ЛЗХЛ - люминол-зависимая хемилюминесценция
МкАт - моноклональные антитела
МПК - мононуклеары периферической крови
ПГЕ2, nTF2a- простагландины Е2 и F2a
ПИБФ - прогестерон-индуцируемый блокирующий фактор
ППС - полная питательная среда
РТПХ - реакция трансплантат против хозяина
СКЛ - смешанная культура лимфоцитов
Txl, Тх2 - Т-хелперы 1 и 2 типов
ТЭК - тимические эпителиальные клетки
ФГА - фитогемагглютинин
ФМА - форбол-12-миристат-13-ацетат
ФНОа - фактор некроза опухолей а
ФСГ — фолликулостимулирующий гормон
ХГ - хорионический гонадотропин
ЦТЛ - цитотоксические Т-лимфоциты
ЭБ - эритроциты барана
сАМР - циклический аденозинмонофосфат
АР-1 — активирующий протеин-1
CD - мембранные маркеры лейкоцитов
Con А - конканавалин А
G-белок - ГТФ-связывающий белок
FasL - Fas-лиганд
FITC - флуоресцеинизотиоцианат
HLA - вид антигенов главного комплекса гистосовместимости
МАРК - митоген-активируемая протеинкиназа
МНС - антигены главного комплекса гистосовместимости
NADP - никотинамидадениндинуклеотидфосфат
NFAT - ядерный фактор активированных Т-лимфоцитов
NFkB - ядерный фактор кВ
NOS - NO-синтаза
РЕ - фикоэритрин
PICA - протеинкиназа А
РКС - протеинкиназа С
PLC — фосфолипаза С
PLD - фосфолипаза D
TCR - Т-клеточный рецептор
Введение к работе
Актуальность проблемы. Беременность в силу экспрессии плодом отцовских антигенов является феноменом естественной аллотрансплантации и требует эффективных регуляторных механизмов для предупреждения реакций иммунного отторжения. Известно, что материнская иммунная система способна распознавать фетальные антигены и реагировать на них [90, 178, 288], причем за счет проникновения фетальных [18, 173] и плацентарных [119] клеток в кровоток матери эти реакции проявляются не только на локальном, но и на системном уровне, однако в норме они не имеют негативных последствий.
В объяснении причин толерантности матери к генетически чужеродному плоду длительное время преобладала гипотеза о системной иммуносупрессии во время беременности. Многочисленными исследованиями было показано угнетение в этот период как адаптивного [245, 353], так и врожденного иммунитета [54, 85, ПО, 141, 202], а также снижение противоинфекционной резистентности организма [70, 204, 413], и до середины 80-х годов эти изменения рассматривались как необходимое условие благополучного развития беременности.
Впоследствии, однако, выяснилось, что взаимодействие между иммунной и репродуктивной системами не сводится к антагонизму. Напротив, наличие иммунного ответа на фетальные антигены является условием успешной реализации процессов репродукции [273]. В 1987 году на основе противоабортивного эффекта аллоиммунизации родительскими лимфоцитами была выдвинута теория плацентарного иммунотрофизма, в соответствии с которой распознавание иммунокомпетентными клетками матери фетальных антигенов ведет к продукции цитокинов, стимулирующих рост и функции плаценты [411]. Эта теория также нашла многократное экспериментальное подтверждение [48, 49, 95, 413].
Согласно современным представлениям, изменения иммунной системы при беременности не ограничиваются тотальной супрессией - они гораздо сложнее и разнообразнее, и обеспечивают не только фетопротекцию, но и фетостимуляцию, а также уровень иммунореактивности организма, достаточный для эффективной противоинфекционной защиты.
Изучение факторов и механизмов, ответственных за эти изменения, - актуальная проблема репродуктивной иммунологии, и важнейшим направлением исследований в рамках данной проблемы является анализ роли репродуктивных гормонов в контроле процессов иммунитета.
Целью работы было исследование модулирующей активности гормонов беременности хорионического гонадотропина, эстрадиола, прогестерона и их физиологических сочетаний в отношении основных эффекторов адаптивного и врожденного иммунитета, а также определение внутриклеточных механизмов действия гормонов.
В соответствии с этой целью в работе решались следующие задачи: 1. Изучить влияние гормонов репродукции на тимический этап дифференцировки Т-лимфоцитов.
Оценить роль репродуктивных гормонов в контроле активации зрелых Т-лимфоцитов.
Изучить регуляторные эффекты репродуктивных гормонов в отношении нейтрофилов.
Исследовать гормональную регуляцию активности Т-клеток на фоне аутологичных нейтрофилов и наоборот, определить ответ нейтрофилов на действие репродуктивных гормонов в присутствии аутологичных Т-лимфоцитов.
Оценить внутриклеточные механизмы реализации гормональных эффектов с учетом основных мессенджерных систем клетки.
Научная новизна работы. Впервые изучены комбинированные иммуномодулирующие эффекты основных гормонов беременности - хорионического гонадотрогаша (ХГ), эстрадиола и прогестерона. Показано участие репродуктивных гормонов в регуляции тимического этапа дифференцировки Т-лимфоцитов. Изучены механизмы гормонального контроля продукции основных Txl- и Тх2-цитокинов, определяющие изменение их баланса при беременности. Продемонстрирована разнонаправленная регуляция гормонами активности нейтрофилов в зависимости от типа стимуляции. Выявлена способность репродуктивных гормонов регулировать апоптоз Т-лимфоцитов и нейтрофилов. Впервые проанализированы молекулярные механизмы реализации иммуномодулирующих эффектов репродуктивных гормонов с учетом основных мессенджерных систем клетки, причем для стероидных гормонов сделана попытка дифференцировать геномные эффекты от негеномных.
Теоретическая и практическая значимость. Работа существенно расширяет представления о гормональном контроле иммунной системы при беременности, раскрывая новые клеточные и молекулярные механизмы иммуномодулирующей активности репродуктивных гормонов. Продемонстрировано, в частности, что гормоны репродукции способны стимулировать Т-клеточное звено иммунитета на этапе тимической дифференцировки, что позволяет по-новому интерпретировать изменения, происходящие в тимусе во время беременности. Показано, что апоптоз Т-лимфоцитов и нейтрофилов чувствителен к действию репродуктивных гормонов и изменение его уровня может служить одним из способов гормональной регуляции активности этих клеток. Выявлена зависимость гормонального контроля нейтрофилов от уровня их активации. Определены основные внутриклеточные механизмы реализации эффектов ХГ, эстрадиола и прогестерона в Т- лимфоцитах и нейтрофилах, дающие достаточно четкое представление о путях гормональной регуляции функциональной активности этих клеток и позволяющие прогнозировать эффекты других гормонов и белков беременности на основе инициируемых ими внутриклеточных сигналов. Выявлены различия в эффектах, которые ХГ, эстрадиол и прогестерон проявляют индивидуально и в физиологических сочетаниях и показано, что в зависимости от дозы, типа клеток-мишеней и уровня их активации гормоны могут действовать аддитивно, в антагонизме, а также проявлять взаимные пермиссивные и/или сенсибилизирующие эффекты. Выявлено изменение гормональной регуляции Т-лимфоцитов в присутствии аутологичных нейтрофилов и наоборот, показана способность Т-лимфоцитов модулировать ответ нейтрофилов на действие гормонов. Эти данные открывают новые перспективы в исследовании нейроэндокринного контроля иммунной системы.
Выявленные иммуномодулирующие эффекты ХГ, эстрадиола, прогестерона и их сочетаний могут иметь место не только при беременности, но и при различных физиологических и патологических состояниях, сопровождаемых эктопическим синтезом этих гормонов в организме или в случае терапии с использованием ХГ и женских половых стероидов. Они будут интересны и найдут применение в работе гинекологов, акушеров, эндокринологов, и других специалистов, работающих в данной области.
Положения, выносимые на защиту:
В физиологическом сочетании, соответствующем I триместру беременности, ХГ, эстрадиол и прогестерон вызывают фенотипическое и функциональное созревание интактных тимоцитов, а также усиливают дифференцировку этих клеток, индуцируемую тимическим эпителием.
Гормональная регуляция зрелых Т-лимфоцитов напрямую зависит от их активационного статуса. Гормоны усиливают спонтанную пролиферацию Т-клеток, но существенно снижают их пролиферативный ответ на митоген, хотя и несколько повышают численность активированных Т-клеток за счет угнетения их апоптоза. Физиологические сочетания ХГ и стероидных гормонов не изменяют продукцию Т-лимфоцитами
ИФНу, но стимулируют синтез и секрецию ИЛ-4, приводя в конечном счете к сдвигу баланса секретируемых Тх1/Тх2-цитокинов в пользу Тх2-типа.
Эффекты репродуктивных гормонов в отношении нейтрофилов проявляются только в сочетании доз, соответствующих III триместру беременности, и также определяются наличием и уровнем активации этих клеток - в спонтанном варианте или в случае слабой стимуляции гормоны повышают окислительный потенциал нейтрофилов, тогда как в условиях интенсивной стимуляции, напротив, снижают его. Апоптоз нейтрофилов подавляется репродуктивными гормонами независимо от уровня клеточной активации.
Гормональная регуляция активности Т-лимфоцитов изменяется в присутствии аутологичных нейтрофилов. В свою очередь, Т-лимфоциты модулируют ответ нейтрофилов на действие репродуктивных гормонов. Результатом такого взаимодействия может быть как отмена гормональных эффектов в совместной культуре, так и их усиление, в зависимости от дозы гормонов, типа клеток и конкретной функции.
Индивидуальные модулирующие эффекты ХГ и в Т-лимфоцитах, и в нейтрофилах опосредуются сАМР-зависимым сигналом, тогда как действие стероидных гормонов реализуется двумя путями -геномным и негеномным, первый из которых ведет, как правило, к ингибированию функций этих клеток, тогда как второй - к стимуляции. При этом негеномные эффекты эстрадиола и прогестерона в основном опосредуются кальцием. Гормональная комбинация в зависимости от дозы гормонов, типа клеток, уровня их дифференцировки и активации может не только нивелировать или полностью блокировать индивидуальные гормональные эффекты, но и, напротив, обеспечивать их проявление.
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на следующих международных и всероссийских конференциях и конгрессах: Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды-98» (Москва, 1998); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 1998); 6-м Международном экспертном форуме по иммунотерапии и генной терапии (Флоренция, Италия, 1998); III Международном конгрессе по патофизиологии (Лахти, Финляндия, 1998); 11 Международном конгрессе по иммунологии (Стокгольм, Швеция, 2001); IV, V и VI Всероссийских научных конференциях с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург. 2000-2002).
По теме диссертации опубликовано 27 научных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 236 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав экспериментальной части, заключения и выводов. Работа содержит 33 рисунка и 27 таблиц. Список литературы включает 423 источника.
