Миелопептиды, индуцирующие терминальную дифференцировку лейкозных клеточных линий Суворов Николай Иванович

Введение к работе

Актуальность проблемы

Известно, что нарушение процессов пролиферации и дифференцировки клеток в костном мозге приводит к развитию тяжелых, а часто и неизлечимых заболеваний. К таким заболеваниям относятся различные типы лейкозов, в частности острые нелимфобластные (ОЛ или ОНЛЛ) и хронические (ХЛ). Это объясняет важность проблемы поиска новых дифференцировочных факторов, особенно эндогенной природы, которые могли бы быть использованы в комплексной противолейкозной терапии.

ОЛ встречаются в разных странах с частотой от 2 до 4 на 100 000 населения в год. У детей лейкозы являются наиболее частым злокачественным новообразованием (38-40%), они обуславливают высокую летальность, уступая первое место среди причин смертности у детей старше 2 лет лишь травмам. Частота лейкозов у детей составляет 3.2-4.4 на 100 000. У взрослых на долю ОНЛЛ приходится 80% среди всех острых лейкозов. Заболеваемость ОНЛЛ увеличивается с возрастом, достигая частоты 10-15 на 100 000 в год в популяции старше 65 лет. ОЛЛ составляют лишь 20% среди всех острых лейкозов взрослых. Мужчины и женщины заболевают с равной частотой. [Liesner RJ, Goldstone AH., 1997] В настоящий момент основой терапии всех ОНЛЛ, кроме варианта М3 (острый промиелоцитарный лейкоз), является сочетание различных методов химиотерапии.

Наряду с химиотерапией, приводящей к гибели опухолевых бластов, получает развитие терапия, вызывающая дифференцировку незрелых опухолевых клеток. Однако, следует отметить, что таких препаратов в настоящее время сравнительно мало. Так, терапия острого промиелоцитарного лейкоза основана на применении производных витамина А (ATRA) и As₂O₃, вызывающих созревание лейкозных клеток. Ведутся активные исследования других соединений, потенциально способных к их использованию в клинике – это производные витамина D, Е, сАМР, препараты на основе цитокинов и др. Однако, применение дифференцировочной терапии и противоопухолевых препаратов часто сопровождается развитием побочных реакций. В связи с этим возрастает потребность в препаратах, применение которых в комплексной терапии лейкозов останавливает рост опухолевых клеток, вызывает их дифференцировку и в тоже время оказывает минимальный побочный эффект.

В начале 1970-х годов группой российских иммунологов под руководством Р.В. Петрова впервые были обнаружены иммунорегуляторные пептиды костного мозга – миелопептиды (МП) (Petrov R.V., Mikhailova A.A., 1972,). МП синтезируются клетками костного мозга человека и млекопитающих без какой-либо стимуляции антигенами или митогенами. Они лишены видовой специфичности и, таким образом, могут быть использованы для иммунокоррекции при различных заболеваниях человека. В настоящее время структурно охарактеризованы и синтезированы шесть МП, каждый из которых обладает собственной иммунокорригирующей активностью. Среди выделенных МП имеются два пептида, обладающие способностью индуцировать терминальную дифференцировку клеток линий миелобластного и эритробластного лейкозов HL-60 и К-562. МП-4 и МП-6 увеличивают уровень экспрессии дифференцировочных антигенов CD14, CD38 и CD44, снижают уровень пролиферации бластных клеток, вызывают характерные морфологические изменения. Это указывает на перспективу использования их в комплексной терапии лейкозов, однако, остаются неясными вопросы относительно механизма их действия на опухолевые клетки.

2. Цели и задачи

Целью данной работы является изучение дифференцировочной активности миелопептидов МП-4 и МП-6 на лейкозных клеточных линиях HL-60 и K-562 и анализ возможных механизмов действия этих пептидов.

В рамках данной работы решались следующие задачи

1. Изучить дифференцировочные свойства миелопептидов МП-4 и МП-6 на модели лейкозных клеточных линий HL-60 и К-562 по различным показателям дифференцировочного процесса;

2. Исследовать характер связывания МП-4 с клетками линии HL-60 и оценить возможность его проникновения внутрь клетки;

3. Определить влияние МП-4 на активацию/ингибирование компонентов системы МАР – киназ в клетках линии HL-60;

4. Изучить роль ионов Са²⁺ в индукции дифференцировки клеток HL-60 под влиянием МП-4.

Научная новизна

В настоящей работе впервые проведено комплексное исследование дифференцировочной активности пептидов костномозгового происхождения миелопептидов МП-4 и МП-6 на лейкозных клеточных линиях HL-60 и К-562 и выявление некоторых механизмов их действия.

Установлено, что клетки миело- и эритролейкоза человека под влиянием миелопептидов останавливают свой рост, экспрессируют на своей поверхности ряд дифференцировочных маркеров. Морфологический анализ клеток линии HL-60 выявил достоверное увеличение количества клеток, которые приобрели характерные черты зрелых форм – моноцитов и макрофагов. Показано что под влиянием МП-4 и МП-6 увеличивается функциональная активность клеток линии К-562, что говорит об их созревании.

Впервые показано вовлечение в процесс дифференцировки различных сигнальных путей - компонентов системы МАР киназ – ERK, JNK, p38 как в общей, так и в фосфорилированной форме. Инкубация HL-60 клеток с МП-4 в течение 72 часов сопровождалась увеличением амплитуды Са²⁺ ответов на формил пептид, что свидетельствует об изменении состояния дифференцировки этих клеток. В то же время, изменение базального уровня Са²⁺ в клетках HL-60 под влиянием МП-4 было незначительным и недостоверным, что показывает, что этот пептид практически не влияет на данный жизненно важный показатель.

В работе установлен факт специфического связывания МП-4 с поверхностью клеток HL-60, построена кривая полного насыщения для МП-4, рассчитана Kd =1,3x10^-9М. Методом конфокальной микроскопии с использованием ФИТЦ-меченого МП-4 показано проникновение этого пептида в клетку и его локализация в околоядерной области.

Практическая значимость

Результаты, полученные в данной работе, представляют интерес не только для фундаментальной науки, но и для возможного использования их в медицине. В настоящее время терапия лейкозов с помощью дифференцировочных агентов является одним из наиболее перспективных направлений в лечении данного вида опухолевых заболеваний.

Понимание механизмов дифференцировочного действия МП-4 и МП-6 на клетки лейкозных линий необходимо для разработки наиболее эффективных методов терапии острых миелобластных лейкозов. Результаты диссертации целесообразно использовать для создания новых лекарственных средств, вызывающих дифференцировку опухолевых клеток и направленно действующих на определенные компоненты сигнального каскада в опухолевой клетке.

Материалы диссертации доложены: на 5-ом конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002), на седьмом чтении, посвященном памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2004), на 2-ом всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2004), на международной летней школе для студентов, аспирантов и молодых ученых «Многогранные способы применения специфической иммунотерапии» (Дубровник, 2004, Хорватия), на международном семинаре «Иммунология для онкологов» (Аскона, 2005, Швейцария), на 15-й конференции по протеин-киназам «Пространственная и временная регуляция сигнализации» (Осло, 2006, Норвегия).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и библиографического указателя. Работа изложена на _____ страницах машинописного текста, включая ____ таблиц и ____ рисунков. Список цитируемой литературы содержит 141 ссылку.