Содержание к диссертации
-
ВВЕДЕНИЕ 9
-
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 18
1. БАЗИСНЫЕ ПРИНЦИПЫ РЕГУЛЯЦИИ ИММУННЫХ
ОТВЕТОВ 18
1.1.Th1/Th2 баланс лимфоцитов -основа иммунитета 18
-
Цитокины как регуляторы Th1/Th2 - баланса лимфоцитов 18
-
Контроль за развитием Тп1Яп2 клонов 20
-
Костимулирующие молекулы 21
-
Антиген-представляющие и дендритные клетки 22
-
Пути представления антигенов 26
2. ИММУНОМОДУЛЯТОРЫ 28
2.1. Механизм модуляции иммунного противоопухолевого
ответа 29
2.1.1.0пухолеспецифические антигены 30
2.2. Причины низкой иммуногенности опухоли 34
2.2.1. Низкий уровень экспрессии опухолевых антигенов и
МНС! 34
2.2.2.0тсутствие кости мул ирующих молекул 35
2.2.3. Факторы, подавляющие иммунитет 37
2.3. Клетки-эффекторы в системе противоопухолевой защиты
организма 37
2.4. Иммунотерапия рака 39
2.4.1. Противоопухолевые и иммуномодулирующие свойства
используемых в онкологии растительных препаратов 41
3. НАПРАВЛЕННЫЙ ТРАНСПОРТ ЛЕКАРСТВ. СОЗДАНИЕ
ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ С ПОМОЩЬЮ БЕЛКОВЫХ
ВЕКТОРОВ 46
-
Альфа-фетопротеин в качестве молекулы-вектора 49
-
Семейство эпидермальных факторов роста 51
4. РАЗРАБОТКА ВАКЦИН И НОВЫХ МЕТОДОВ
ИММУНОТЕРАПИИ 56
-
Профилактические вакцины 58
-
Генетическая иммунизация 69
4.3. Использование белков и пептидов в качестве основного
компонента вакцин 83
-
Терапевтические вакцины 85
-
Вакцины на основе белков теплового шока 90
-
HSP-активация неспецифического иммунитета 92
-
Иммуногенность комплексов «пептид-HSP» 93
-
HSP-активация специфического иммунитета 94
-
HSP- вакцины против инфекционных и опухолевых заболеваний 97
-
Необходимость в разработке противотуберкулезных вакцин и новых диагностических тест-систем на М. tuberculosis 98
-
Ранняя диагностика туберкулезной инфекции 103
-
Характеристика антигенов М. tuberculosis 105
-
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 107
-
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 152
1. ВЫДЕЛЕНИЕ, УСТАНОВЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ И ИЗУЧЕНИЕ
БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИЧЕСКИХ
КОМПЛЕКСОВ ОЛИГОМИЦИНОВОГО РЯДА 152
1.1. Изучение антибиотического комплекса, синтезируемого
культурой Streptomyces sp.№182 152
1.1.1.Таксономическая характеристика штамма-продуцента
олигомицинового комплекса 153
1.1.2.Физиологические свойства культуры 156
1.1.3.Биосинтез антибиотического комплекса 158
1.1.4. Вы деление ол и гоми циново го комплекса 158
1.1.5.Биологическая активность олигомицинового
комплекса 160
И.б.Выделение и очистка 160
1.1.7.Изучение физико-химических свойств 161
1.2. Изучение антибиотического комплекса, синтезируемого
культурой Streptomyces sp.№162 172
1.2.1. Изучение морфологических признаков культуры Streptomyces №162 - продуцента антибиотического
комплекса BSK17 172
1.2.2.Физиологические характеристики 173
-
Исследование изменчивости популяции штамма Streptomyces $р. 162 по морфологическим признакам и антибиотикообразованию 175
-
Разработка метода биосинтеза антибиотического комплекса 176
-
Выделение антибиотического комплекса, определение компонентного состава 178
-
Антибактериальная активность BSK- 17 181
-
Первичная иммунологическая оценка 183
-
Угнетение ФГА-индуцированной пролиферации лимфоцитов под воздействием BSK-17 183
-
Влияние фракции 1 антибиотического комплекса BSK - 17 на апоптоз трансформированных клеток ... 184
1.2.8. Изучение противовирусной активности антибиоти
ческого комплекса BSK-17 в сравнении с BSK-14 186
2. РАЗРАБОТКА КОНСТРУКЦИЙ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОГО
ТРАНСПОРТА ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ
ПРЕПАРАТОВ 189
2.1.Ковалентные и нековалентные конъюгаты белковых векторов
с противоопухолевыми препаратами и антибиотиками 189
2.1.1.Ковалентный конъюгат «DR -AFP» 189
2.1.2.Ковалентный конъюгат «эсперамицин-AFP» 191
2.1.3.Нековалентный конъюгат «ТХДД-AFP» 193
2.1.4.Конъюгаты «EGF-DR» 195
2.2.Антибактериальные и противоопухолевые препараты на
основе респекриновых комплексов 201
З.ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ И ПРОТИВОВИРУСНОЙ
АКТИВНОСТЕЙ ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ 206
3.1. Иммуномодулятор растительного происхождения 206
3.1.1.Биологические свойства ИРП 207
3.1.2.Исследование противоопухолевой активности
ИРП 216
3.1.3. Исследование эффективности профилактического
применения ИРП для предупреждения образования
опухолей 221
3.2. Исследование противовирусной и иммуномодулирующей
активностей препарата Гепон 222
3.2.1. Оценка иммунного контроля оппортунистических
инфекций у больных ВИЧ-инфекцией под влиянием
иммуномодулятора Гепон 223
3.2.2. Активация образования антител к антигенам ВИЧ
при лечении больных ВИЧ-инфекцией 238
3.2.3. Изучение динамики основных субпопуляций
лимфоидных клеток крови 245
3.2.4. Влияние на продукцию антител 253
3.2.5. Изучение зависимости иммуноадьювантного
действия Гепона от его пептидной структуры 259
3.2.6. Изучение транскрипции генов цитокинов в
перевиваемых клетках человека 267
4. РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ
ТУБЕРКУЛЕЗА НА ОСНОВЕ АНТИГЕНОВ М. tuberculosis 278
4.1. Конструирование плазмид и получение штаммов-продуцентов рекомбинантных антигенов М. tuberculosis. . . 279 4.2.Выделение рекомбинантного белка CFP10 из биомассы штамма-продуцента Е. coli методом лигандообменной
хроматографии 281
4.3.Выделение рекомбинантного слитого белка CFP10-ESAT6
из биомассы штамма-продуцента Е. coli методом
лигандообменной хроматографии 282
4.4.Тестирование диагностического реагента на основе белков
ESAT-6 и CFP-10 для определения гиперчувствительности
замедленного типа к /И. tuberculosis 282
-
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 285
-
ВЫВОДЫ 292
-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 294
Введение к работе
Иммунная система является уникальным регуляторным органом, контролирующим организм как в норме, так и при различных патологических состояниях. Суть выздоровления, в общем случае, - это стремление организма как единой системы к некоему состоянию равновесия, дестабилизируемого болезнью. Баланс клеточного и гуморального иммунных ответов является определяющим в этом равновесии. Смещение активности в пользу одного из них вызывает необходимость внешней коррекции, выражающейся в специфическом моделировании активностей иммунной системы, прогнозирования иммунных ответов и управления ими. Подобные манипуляции возможны с развитием современных средств медицинской науки, которая располагает большим арсеналом средств для разработки новых препаратов направленной реактивности.
Моделирование иммунных ответов достигается многими средствами, часть из которых представлена готовыми фармакологическими формами, тогда как другая пока находится в стадиях различной степени изучения. Иммунный дисбаланс должен регулироваться направленно, и это достигается различными по своему происхождению веществами. Интенсивный поиск ведется среди антибиотиков с новыми активностями, традиционно - среди препаратов растительного происхождения, и, с учетом состояния развития мировой молекулярной медицины, наметилась четкая тенденция к разработке биоинженерных средств с иммунобиологическими и иммуномодулирующими свойствами. Поэтому, если рассматривать иммунную систему в частности, и организм в целом, как объекты моделирования биологических ответов, можно увидеть, что имеет место некая система, которую уместно охарактеризовать как моделирование направленной реактивности иммунных ответов (МНРИО).
Огромной проблемой всегда были и остаются лечение и профилактика опухолевых, аутоиммунных, инфекционных патологий. Большое количество различных препаратов, существующих на рынке, говорит только о том, что до сих пор не существует сколь-нибудь однозначного подхода для терапии вышеуказанных заболеваний. Кроме того, большинство из них обладает нежелательными побочными эффектами, коррекция которых выливается порой в дополнительную проблему. С одной стороны, причиной этому является отсутствие селективности действия используемых лекарственных средств, а с другой, как это ни парадоксально, - отсутствие грамотного выбора среди множества аналогичных средств. Все это диктует необходимость в разработке препаратов нового поколения, метаболизм которых в организме может быть однозначно предсказуем, которые могут быть управляемы и которые должны иметь минимум побочных эффектов или, в идеале, не иметь их вовсе. Организм млекопитающих представляет собой сложную многоклеточную систему, и нарушение его гомеостаза влечет необратимые нарушения органов и систем. Интеллектуальные «возможности» новых иммуномодулирующих препаратов, селективно «узнающих» свои мишени in vivo среди множества других, являются фактором неоспоримого качества и важным показателем их надежности. Строго говоря, речь идет о работающей in vivo системе МНРИО. Данный подход может быть положен в основу комплексной терапии заболеваний не только самой иммунной системы, но и всех остальных патологий, возникших на фоне иммунного дисбаланса.
Развитие современной медицины немыслимо без участия и совместного «сотрудничества» многих смежных дисциплин. Для разработки надежных диагностических тест-систем, направленного транспорта лекарств, вакцин нового поколения необходимо использовать наукоемкие технологии с учетом современных достижений медицины. Разработка новых лекарственных препаратов подразумевает знания о молекулярной основе заболевания для управления меж- и внутриклеточными сигнальными процессами на уровне клеток, вовлеченных в патологический процесс. Более полное понимание специфики функционирования вне- и внутриклеточных медиаторов стало доступным в последние годы, поэтому анализ и применение огромной базы накопленных знаний породили развитие принципиально новых подходов в создании биологически активных соединений. Изучение многообразия типов клеток, особенностей организации сигнальных каскадов, белок-белковых (лиганд-рецепторных) взаимодействий, способов активации и проведения сигналов внутри клеток-мишеней являются, таким образом, составляющими системы управления клеточными ответами, что является важнейшим достижением современной молекулярной биологии, биохимии, медицины.
Исследование биологических активностей различных факторов на клетку позволило по-новому взглянуть на способы лечения многих болезней человека, которые обычным, традиционным способом излечиваются не полностью, либо относятся к неизлечимым. По сути, современная молекулярная медицина призвана решать эти задачи. Это одна из «ветвей» медицинской науки, которую можно назвать как самой молодой, так и самой
12 древней.
Моделирование направленной реактивности иммунного ответа (МНРИО) может быть реализовано с помощью веществ, созданных как природой, так и с помощью возможностей современных биотехнологических направлений. МНРИО создает основу для комплексной терапии заболеваний иммунной системы на уровне управления различных систем клетки, в том числе рецепторных (мембранных, ядерных), цитоплазматических, других органных систем.
Новый класс антибиотиков, относимых к олигомицинам, а также препараты на основе растительного сырья (ИРП) являются вновь открытыми природными объектами, на базе которых возможно создание новых биологически активных лекарственных средств, обладающих иммуносупрессивными, антифунгальными (антибиотики), иммуностимулирующими, противоопухолевыми (ИРП) свойствами.
Разработанные конъюгаты на основе AFP, EGF в комплексе с цитостатиками, а также иммунотоксины нового поколения, респекрины, обеспечивают направленный транспорт лекарственного вещества в клетку, обладают низкой токсичностью и высокой избирательностью и могут служить основой для лечения опухолей любого генеза, на которых имеются возможности рецепторного узнавания вышеуказанными лигандами. Эти вещества являются примером возможностей биотехнологического разнообразия приемов и методов, использование которых позволяет добиться получения субстанций с заданными свойствами.
Иммуномодулятор Гепон является эффективным препаратом, имеющим позитивные результаты в клинике при лечении больных с инфекционными патологиями, в том числе с оппортунистическими инфекциями.
Все вышеуказанные препараты являются представителями новых классов иммунобиологических лекарственных средств, перспективных для клинического использования в комплексной терапии заболеваний, связанных с иммунным дисбалансом организма, в том числе в терапии опухолей.
Диагностикум на туберкулез, выполненный на основе белковRD-региона М.tuberculosis ESAT-6 и CFP-10 и представляющий собой классический пример биотехнологической наработки рекомбинантных белков через создание штамма-продуцента, является примером практического применения МНРИО и позволяет с высокой достоверностью отличать инфицирование вышеуказанным патогеном от любого другого микобактериального заражения.
Целью настоящей диссертационной работы явилось исследование механизмов направленной реактивности иммунного ответа с помощью веществ различного происхождения, регуляции клеточного и гуморального типов иммунитета, а также подбор адекватных критериев использования МРНИО в практической медицине и медицинской биотехенологии.
Довольно быстрый прогресс в исследовании молекулярного взаимодействия клеточных медиаторов и их рецепторов наметился в последние 10-15 лет. Современные технологии по клонированию рекомбинантных ДНК позволили детально проанализировать многие аспекты белок-белковых взаимодействий с участием цитокинов, клеточных антигенов, факторов роста, установить особенности экспрессии данных белков, а также . получить возможность беотехнологической наработки чистых белков для использования их как объектов для молекулярной коррекции нарушенных клеточных функций при той или иной патологии.
![Комплексная инструментальная оценка церебрососудистой реактивности у больных с каротидным и коронарным атеросклерозом и математическое моделирование гемодинамической эффективности реваскуляризации головного мозга [Электронный ресурс]](/i/i/4254/203527.png "Комплексная инструментальная оценка церебрососудистой реактивности у больных с каротидным и коронарным атеросклерозом и математическое моделирование гемодинамической эффективности реваскуляризации головного мозга [Электронный ресурс] Шарова Ирина Михайловна")
![Полиморфизм G1846A гена GYP2D6 и фармакологический ответ на [в]1 -адреноблокаторы](/i/i/4345/360495.png "Полиморфизм G1846A гена GYP2D6 и фармакологический ответ на [в]1 -адреноблокаторы Казаков Руслан Евгеньевич")
