Введение к работе
Актуальность проблемы. Цель работы. Научная новизна и практическая значимость. Апробация работы. Публикации. Структура работы.
-
Бактериородопсин
-
Иммуноглобулин Е
-
Н-2 антигены
-
ИЗУЧЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА АНТИГЕНОВ ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ . . , 22
-
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ БИОСИНТЕЗА БЕЛКОВ И ГЛИКОПРОТЕИНОВ 30
IY. ПРИМЕНЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ СОЗДАНИЯ
СИСТЕМ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ 37
-
Тест-системы для определения IgE
-
Тест-система для определения теофиллина
Актуальность проблемы-- Одним из наиболее важных и перспек
тивных разделов медико-биологической науки является иммунобиотех-
нология, возникшая на стыке иммунологии и биотехнологии и связан
ная , в первую очередь, с разработкой методов получения мкАт к
различным биологически активным веществам и изучением биологичес
ких и физико-химических основ их взаимодействия, а также разра
боткой способов применения мкА.т в фундаментальных и прикладных
исследованиях. Перспективы развития этой области исследований
связаны как с практическими аспектами применения мкАт: создание
систем иммуноанализа для обнаружения БАВ в биологических жидкос
тях, иммуносорбентов для выделения БАБ из сложных смесей, нового
поколения лекарственных препаратов,- так и с уникальными возмож
ностями применения мкАт для структурного и функционального изуче
ния молекул, клеток и сложных биологических систем. Развитие ука
занного направления исследований требует разработки научных основ
получения и применения мкАт как важной задачи современной иммуно
логии. Решение этой проблемы позволит перейти при получении мкАт
от сугубо эмпирических подходов, основанных на скрининге, к нап
равленному конструированию антиген-связывающих центров антител с
любыми заданными свойствами. Определяющим условием для успешного
выполнения этих работ является детальное изучение механизмов вза
имодействия антиген-антитело, структуры отдельных антигенных де
терминант, а также антигенной структуры молекул в целом. Иными
словами, необходима детальная разработка иммунохимии мкАт. Для
решения этой задачи нам представлялось целесообразным применить
методические подходы, разработанные в классической серологии, к
исследованиям, проводимым с помощью мкАт. В качестве обьектов ис
следования были использованы мембранный белок бактериородопсин,
антигены гистосовместимости и иммуноглобулины. v-
Исследование антигенной структуры белков ГКГ имеет самостоятельное важное значение в плане выяснения структурных основ полиморфизма - уникальной особенности этих молекул, лежащей в основе их биологических функций. Нами была исследована возможность применения комплекса биохимических и иммунохимических подходов с использованием мкАт для изучения полиморфизма этих молекул.
Моноклональные антитела, являясь уникальным инструментом для структурно-функциональных исследований, сами представляют удобную модель для изучения биосинтеза гликопротеинов, в частности, таких аспектов, как процессинг углеводных цепей, внутриклеточная сборка, транспорт, секреция. Вследствие отсутствия адекватных моделей
подобные исследования проводились ранее в весьма ограниченном объеме . Нам представлялось целесообразным провести эти исследования на гибридомных клеточных линиях, а также трансфектомах. Предлагаемые нами подходы с использованием ингибиторов гликозилирования, ферментов углеводного обмена и ряда оригинальных биохимических методов могут быть распространены на другие системы.
Важнейшей областью применения мкАт является конструирование тест-систем, предназначенных для обнаружения и, количественного определения БАВ в биологических жидкостях. Нам представлялось целесообразным разработать общие подходы к конструированию различных вариантов тест-систем на основе мкАт для определения как биополимеров ( на примере IgE ), так и низкомолекулярных соединений ( теофиллин ). Эти подходы могут быть использованы при создании диагностикумов других типов.
Цель работы. Настоящая работа посвящена разработке общих методов структурно-функционального изучения белков и гликопротеи-нов с помощью моноклоналышх антител (антигенная структура, полиморфизм и биосинтез) и создания тест-систем на основе монокло-нальных антител.
Научная новизна и практическая значимость. Предложены новые подходы к изучению антигенной структуры и полиморфизма белков и гликопротеинов с использованием ноноклональных антител, протеоли-тических фрагментов молекул и синтетических пептидов. Впервые исследована антигенная структура интегрального мембранного белка бактериородопсина и уточнена его топография в мембране. Разработаны подходы для локализации эпитопов антигенов гистосовместимос-ти и изучения их полиморфизма. Проведено широкое изучение биохимического полиморфизма антигенов I класса главного комплекса гис-тосовместимости человека. Проведено исследование биосинтеза IgD и IgE с использованием ингибиторов гликозилирования, выявлены общие закономерности процессинга иммуноглобулинов у миелом, гибридом и трансфектом.
В ходе работы разработан ряд новых методических приемов, из которых, в первую очередь, следует отметить следующие: показана возможность точной локализации антигенных детерминант с помощью комбинации химической и ферментативной модификации и синтетических пептидов (бактериородопсин, Н-2 антигены); на примере IgE показана возможность изучения тонкой антигенной специфичности мкАт с помощью протеолиза и-вестерн-блота; на примере HLA-A.B антигенов показана возможность изучения полиморфизма с помощью мкАт к
мономорфным детерминантам в комбинации с двумерным электрофорезом; показана возможность использования опытов с импульсной меткой в сочетании с ингибиторами гликозилирования для изучения роли гликозилирования в транспорте и секреции IgE в миеломах, гибридо-мах и трансфектомах; разработаны высокоэффективные методы получения антител к коротким пептидам, изучения взаимодействия мкАт с пептидами.
В ходе работы было получено более 30 мкАт к 10 физиологически активным веществам, которые тщательно охарактеризованы по иммуно-химическим и биохимическим параметрам.
Разработаны 6 тест-систем для определения IgE и тест-систеї^ для лекарственного мониторинга теофиллина.
Созданные мкАт и тест-системы нашли широкое применение в медико-биологических и клинических исследованиях в нашей стране и за рубежом.
Апробация работа. Результаты исследований были представлены на 5-ом Международном иммунологическом конгрессе (Киото, Япония, 1983), на III советско-швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функция" (Ташкент, 1983), на Всесоюзном совещании по генетике соматических клеток (Звенигород, 1983), на 16-ой конференции ФЕБО (Москва, 1984), на IV Всесоюзной межуниверситетской конференции по биологии клетки (Тбилиси, 1985), на Всесоюзном симпозиуме по медицинской энзимологии (Махачкала, 1986), на 2-ой Всесовзной конференции по фармакокинетике (Каунас, 1987), на 1-ой и 2-ой Всесоюзных конференциях "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москва, 1988; Москва, 1990), на 1-ом Всесоюзном иммунологическом сьезде (Дагомыс, 1989), на республиканской конференции "Иммуноферментный анализ в медицине" (Харьков, 1989), на 6-ом международном конгрессе по быстрым методам иммуноанализа RAMI-90 (Хельсинки,' 1990), на Международном симпозиуме "IgE: регуляция синтеза и клиническая значимость" (Москва, 1990), на годичном собрании Европейской Академии аллергологии и клинической иммунологии (Цюрих, 1991), на Международной конференции "Медицинская биотехнология, иммунизация, СПИД" (Ленинград, 1991).
Публикации, по материалам диссертации опубликовано 65 работ, получены 3 авторских свидетельства.
Структура работы. Материалы работы распределены по главам в следующем порядке. В I главе анализируются подходы к изучению антигенной структуры белков с помощью моноклональных антител. Представлены результаты иммунохимического изучения мембранного фото-рецепторного белка бактериородолсина, антигенов гистосовмесгимос-ти и иммуноглобулина Е. В главе II проводится анализ полиморфизма антигенов гистосовместимости с помощью моноклональных антител. В главе III рассматриваются возможности изучения биосинтеза гликоп-ротеинов на модели моноклональных и рекомбинантных антител. В главе IV суммированы данные- о разработанных иммуноферментных тест-системах.