Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
1 Развитие и совершенствование иммунологических методов на
основе феномена агглютинации 14
Теория преципитации и агглютинации в иммунохимии 14
Разработка систем автоматизации и объективизации агглютинационных тестов 19
2 Применение агглютинационных тестов для серодиагностики
сифилиса, а также для иммунодетекции возбудителей бруцеллеза и
туляремии 25
Методы серодиагностики сифилиса 25
Методы выявления бруцелл 37
Методы выявления Francisella tularensis 46
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 54
3 Материалы 54
Штаммы бактерий и бактериальные антигены 54
Антисыворотки и антитела 55
Формалинизированные эритроциты барана 56
Клинический материал 56
Диагностические тест-системы 56
Комплектующие аппаратно-программного комплекса «Критерий 2» 56
4 Методы исследования 58
Иммунизация мышей 58
Получение гибридом 59
Выделение моноклональных и поликлональных антител 64
ИФА для определения ЛПС бруцелл 68
ИФА для определения ЛПС F.tularensis 68
Приготовление тестовых и контрольных эритроцитов для РПГА 69
РПГА для определения ЛПС и микробных клеток бруцелл и F.tularensis 71
РПГА для выявления антитрепонемных антител 73
Аппаратно-программный комплекс «Критерий 2» и методика автоматизированного количественного определения реакции агглютинации 73
Клинические исследования АПК «Критерий 2» , 74
Статистические методы 74
РЕЗУЛЬТАТЫ
Общая характеристика программы анализа изображений РПГА «Критерий 2» 75
Разработка РПГА-АКАТ для серодиагностики сифилиса 86
Разработка РПГА-АКАТ и системы сравнения на основе ИФА для иммунодетекции бруцелл 91
7.1 Получение и характеристика моноклональных антител, специфичных к Л ПС
бруцелл 91
7 2 Разработка референсного ИФА для иммунодетекции бруцелл 95
Разработка РПГА-АКАТ для иммунодетекции бруцелл 103
Определение чувствительности и специфичности РПГА-АКАТ для иммунодетекции бруцелл в сравнении с референсным тестом ИФА 114
8 Разработка РПГА-АКАТ и системы сравнения на основе ИФА для
иммунодетекции F.tularensis 118
8.1 Разработка референсного ИФА для иммунодетекции F.tularensis 118
8 2 Разработка РПГА-АКАТ для иммунодетекции F.tularensis 122
ОБСУЖДЕНИЕ 137
ВЫВОДЫ 157
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 159
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
DMSO
VDRL
БОБР
ИППП
КЭ ЛАТ
М.к./мл
ПС-НАТ
РАГА
РИБТ
РИФ-АБС
РИФ-АБС 19S IgM AT
Диметилсульфоксид
Полиэтиленгликоль
Быстрый плазмареагиновый тест
Аналог RPR
Антиген
Аппаратно-программный комплекс
Антитело
База данных
Буфер для разведения образцов
Бычий сывороточный альбумин
Буфер для разведения эритроцитов
Гемагглютинация
Государственное учреждение здравоохранения
Инфекция, передаваемая половым путем
Иммуноферментный анализ
Кожно-венерологический диспансер
Конъюгат
Конъюгатный буфер
Коэффициент регрессии
Комплекс серологических реакций, в которые
входят входят РСК и МРП
Контрольные эритроциты
у-глобулиновая фракция из лошадиной
антитуляремийной антисыворотки
Липополисахарид
Микробные клетки в миллилитре
Моноклональные антитела
Протеин А-сефароза
Полная среда для ведения клеточных культур
Селективная среда для получения гибридом с
добавлением гипоксантина, аминоптерина и
тимидина
Пероксидаза хрена
Полимеразная цепная реакция
Полиэтиленгликоль
Реакция агрегат-гемагглютинации
Реакция Вассермана
Реакции иммобилизации бледных трепонем
Реакция иммунофлюоресценции
Реакция иммунофлюоресценции в постановке с
абсорцией сыворотки,
Реакция иммунофлюоресценции с абсорбцией
Введение к работе
Актуальность проблемы
Существует множество методов, применяемых для иммунодетекции
различных маркеров возбудителей инфекций и иммунодиагностики
инфекционных заболеваний. Каждый метод имеет свои преимущества и
недостатки. Методы, основанные на разных принципах, дополняют друг
друга в верификации результатов иммуноанализа. Иммунологические
методы могут обладать высокой чувствительностью и специфичностью,
сравнимой в предельных значениях с молекулярно-биологическими тестами
[23, 135]. Метод иммуноферментного анализа (ИФА), основанный на
принципе иммуносорбции, где антитела взаимодействуют с антигеном на
твердой фазе, а несвязавшийся избыток реагентов удаляется, обладает
высокой чувствительностью и специфичностью, однако этот метод
многоэтапный, требует специального оборудования и высокой квалификации
персонала. Агглютинационные тесты, основанные на принципе
иммунопреципитации (агглютинации), где взаимодействие антител и
антигенов происходит в оптимальном соотношении в растворе с
образованием «решетки» из антигенов и антител, удобны и просты в
постановке, в принципе могут обладать сравнимой с ИФА
чувствительностью, но имеют один существенный недостаток
субъективизм учета результатов [38, 160]. В современных условиях, когда
требования доказательной медицины направлены на исключение ошибок
лабораторного персонала путем автоматизации и даже роботизации
диагностических методологий, методы твердофазного иммуноанализа
подверглись более интенсивному развитию, чем агглютинационные тесты,
поскольку больше соответствовали предъявляемым требованиям. В связи с
этим, в ходе непрерывного совершенствования иммунодиагностических
методов вообще, для агглютинационных тестов наиболее актуальным
становится их объективизация, автоматизация, стандартизация, разработка
аналитических количественных характеристик [54, 160].
Попытки автоматизации и даже роботизации агглютинационых тестов предпринимались неоднократно, но только фирме Olympus (Япония) удалось создать роботизированную систему для учета результатов реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) и зарегистрировать ее для применения в лабораторной практике, успешно пройдя испытания в FDA (США) [100]. Система Olympus применяется для серодиагностики сифилиса и цитомегаловируса, а также при определении групп крови. Остальные, весьма разнообразные по принципу, попытки автоматизации агглютинационных тестов не получили практического приложения. Однако система Olympus, несмотря на использование очень дорогостоящего оборудования и компьютерного программного обеспечения, не обладает возможностями количественного анализа результатов. Olympus лишь объективизирует учет результатов РПГА и выражает его в трех вариантах (положительный, отрицательный и неопределенный), а еще в 30-50-е годы прошлого века в классических исследованиях Heidelberger и Kendall, Zinsser, Jones и Pol было доказано, что преципитация и агглютинация, лежащие в основе агглютинационных тестов, являются аналитическими количественными реакциями. Метод количественной агглютинации, разработанный в 1929-1935 гг. Heidelberger и Kendall, позволяет осуществить точное аналитическое определение общего весового количества агглютининов в антисыворотках. Реакция количественной агглютинации была использована для исследования антисывороток к бруцеллам, пневмококкам, гемолитическим стрептококкам, стафилококкам, менингококкам, гонококкам, дизентерийным микробам, дрожжам, H.influenzae В и B.pertussis, B.proteus и S.typhosa [11]. Поэтому становится очевидным, что для того чтобы решать многие научные и иммунодиагностические задачи, используя наряду с иммуносорбентными методами количественные агглютинационные тесты, необходимо разработать методологию количественной, объективной и автоматизированной оценки результатов этих тестов, удобную для применения не только в научных целях, но и в клинической практике.
Агглютинационные методы прямой иммунодетекции возбудителей инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы широко используются. Эти тесты применяют для обнаружения возбудителей хелико-и кампилобактерной инфекции [130], менингококковой инфекции [104], пищевых токсикоинфекций [124], в том числе холерного токсина и энтеротоксина E.coli [89], трихомониаза [29], а также ВИЧ [77], аденовирусов [105], герпесвирусов и ротавирусов [114, 167], и возбудителей других инфекций. Кроме того, эти тесты используют для определения групп крови с помощью моноклональных антител [177]. В России, согласно приказу МЗ РФ № 64 от 21.02.2000 «Об утверждении номенклатуры клинических лабораторных исследований», для диагностики 85 инфекций, вызываемых вирусами, бактериями, грибами, гельминтами и простейшими, используют 165 агглютинационных тестов, из которых доля РПГА составляет 32%. Однако до сих пор агглютинационные тесты используют либо в качественном, либо в полуколичественном варианте (определение титра) с визуальным субъективным способом оценки их результатов [54, 63].
Большинство возбудителей инфекций, диагностируемых с помощью агглютинационных тестов, требуют постоянного эпидемиологического надзора и ранней диагностики инфекционных заболеваний. Массовый серологический скрининг населения в России на маркеры сифилиса (около 70 миллионов анализов ежегодно) проводится в подавляющем числе случаев с использованием морально устаревших субъективных методов: реакция Вассермана (РВ), реакция микропреципитации (РМП), реакция иммунофлюоресценции (РИФ), а также РПГА с визуальным учетом результатов. Однако известно, что РПГА - очень удобный простой метод, высокочувствительный и специфичный к T.pallidum. В настоящее время в условиях перехода на современные методы диагностики сифилиса в России (Приказ МЗ РФ № 87 от 26.03.2001 «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса»), этот метод является альтернативой ИФА и может широко применяться как скрининговый или подтверждающий тест. Главный
недостаток РПГА - отсутствие объективного автоматизированного учета результатов. А это противоречит основным требованиям, предъявляемым к современным методам иммунодиагностики [54].
В настоящее время в России сохраняется опасность эпизоотических вспышек бруцеллеза и туляремии, а также существует возможность осуществления актов биотерроризма, связанных с этими инфекциями. Однако как в России, так и в мире, отсутствуют доступные коммерческие тест-системы для иммунодетекции возбудителей бруцеллеза и туляремии, основанные на современных автоматизированных технологиях. Для решения проблем мониторинга за особо опасными инфекциями агглютинационные тесты для иммунодетекции возбудителей представлены среди рекомендованных для полевых исследований диагностикумов как простые, удобные и относительно дешевые тесты [103].
Таким образом, разработка автоматизированного количественного агглютинационного теста для иммунодетекции возбудителей и иммунодиагностики инфекций является актуальной проблемой здравоохранения России для скрининга населения, мониторинга животных и окружающей среды в целях биобезопасности, эпидемиологического надзора и диагностики актуальных инфекций.
Цель работы:
Разработать автоматизированный количественный агглютинационный тест (АКАТ) для определения антигенов и антител на модели РПГА и автоматизированную количественную РПГА для иммунодетекции возбудителей бруцеллеза и туляремии, а также для серодиагностики сифилиса.
Задачи исследования:
1. На модели РПГА разработать методологию автоматизированного количественного агглютинационного теста (АКАТ), основанную на преобразовании визуального ряда данных реакции агглютинации в
шкалу количественных значений, полученную в результате оцифровывания изображений, их компьютерной обработки, введения эталонов и расчета коэффициента регрессии.
Разработать аппаратно-программный диагностический комплекс, включающий модифицированный сканер, компьютер, принтер, базовое и специализированное программное обеспечение с базой данных для количественного учета результатов агглютинационных тестов (на модели РПГА), применимый для иммунодетекции возбудителей и диагностики инфекций.
Разработать вариант РПГА-АКАТ для серодиагностики сифилиса с использованием коммерческих диагностических тест-систем и провести клинические испытания автоматизированного комплекса для серодиагностики сифилиса вариантом РПГА-АКАТ, оценить его преимущества перед обычной методологией.
Разработать вариант РПГА-АКАТ для определения антигенов бруцелл с использованием моноклональных антител против ЛПС и изучить чувствительность и специфичность РПГА-АКАТ для иммунодетекции ЛПС в клетках различных видов бруцелл по сравнению с иммуноферментным анализом.
Разработать вариант РПГА-АКАТ для определения антигенов F.tularensis с использованием моноклональных и поликлональных антител против возбудителя туляремии и изучить чувствительность и специфичность РПГА-АКАТ для иммунодетекции ЛПС в клетках различных подвидов возбудителя туляремии в сравнении с иммуноферментным анализом.
Научная новизна
1. Впервые на модели РПГА разработан автоматизированный количественный агглютинационный тест (АКАТ) для определения антигенов и антител, применимый для различных научных и
иммунодиагностических целей, в частности, для иммунодетекции возбудителей и диагностики инфекционных заболеваний. С помощью АКАТ решена задача количественной оценки результата реакции агглютинации.
Впервые создан аппаратно-программный диагностический комплекс (АПК), необходимый для получения оцифрованных изображений микропланшетов с тестами РПГА, последующего вычисления коэффициента регрессии и классификации полученных изображений по 4-х «крестовой системе». Показана применимость данного АПК для иммунодетекции возбудителей и диагностики инфекций.
Впервые разработан вариант РПГА-АКАТ, применяемый для выявления анти-трепонемных антител при серодиагностике сифилиса.
Впервые для автоматизированного количественного учета результатов РПГА-АКАТ при серодиагностике сифилиса разработана база данных, позволяющая архивировать информацию о пациентах, параметрах тестирования и полученных результатах в виде коэффициентов регрессии, оценки в 4-х «крестовой системе» и диагностического заключения, а также формировать отчеты с протоколами исследований и проводить целенаправленный поиск данных.
Впервые разработан вариант РПГА-АКАТ с использованием моноклональных антител для определения ЛПС и микробных клеток различных видов бруцелл с чувствительностью 103-104 м.к./мл и 0,1-0,2 нг/мл ЛПС, не обладающий перекрестной реакцией с гетерологичными микроорганизмами и по чувствительности превышающий ИФА.
Впервые разработан вариант РПГА-АКАТ для определения микробных клеток и ЛПС F.tularensis с чувствительностью 103-104 м.к./мл и 0,25 нг/мл ЛПС, не обладающий перекрестной реакцией с гетерологичными микроорганизмами, и сравнимый по чувствительности с ИФА.
Впервые для агглютинационных тестов для расчета достоверности различия положительных значений реакции в опыте по сравнению с
контролем и совершенствования интерпретации результатов введено отсекающее значение (cut-off), основанное на количественной оценке результата реакции (коэффициенте регрессии). Показано применение cut-off для прямой иммунодетекции возбудителей бруцеллеза и туляремии методом РПГА-АКАТ.
Научно-практическая значимость
Применение технологии автоматизированного количественного агглютинационного теста (АКАТ) позволяет производителям агглютинационных тест-систем (РПГА, латекс-агглютинации и др.) создать новое поколение простых, быстрых, удобных в постановке диагностических тест-систем с новыми возможностями количественного и объективного учета результатов реакции, а затем широко внедрить их для различных целей иммунодиагностики инфекций.
Разработанный высокочувствительный тест на основе АКАТ для определения антигенов возбудителя бруцеллеза применим для их иммунодетекции в биологических материалах, а также смывах и пробах из объектов окружающей среды. В настоящее время в России отсутствуют коммерческие тест-системы для прямой иммунодетекции возбудителя бруцеллеза и туляремии.
Разработанный высокоэффективный аппаратно-программный комплекс (АПК) «Критерий 2» для серодиагностики сифилиса применяется для первичного массового обследования населения и при дальнейшем лечении больных сифилисом и наблюдении за ними. Кроме того, АПК «Критерий 2» применим для выявления маркеров возбудителя сифилиса в ликворе. Применение АПК позволяет организовать работу по серодиагностике сифилиса методом РПГА в соответствии с современными требованиями доказательной медицины, так как оно дает возможность объективно классифицировать изображения, как по
привычной для дерматовенерологов 4-х «крестовой системе», так и по количественному параметру, характеризующему интенсивность реакции (коэффициенту регрессии). Важной частью АПК является База Данных (БД), позволяющая удобно протоколировать процесс постановки РПГА, проводить поиск по пациентам и организациям, а также формировать несколько видов отчетов. Применение АПК «Критерий 2» и РПГА-АКАТ в клинической практике позволяет повысить выявляемость анти-трепонемных антител и снизить количество неопределенных результатов. Применение АПК «Критерий 2» в условиях широкомасштабного скрининга позволяет также не только значительно улучшить качество серодиагностики сифилиса, но и экономить реактивы и рабочее время, затрачиваемые на ретестирование.
Внедрение полученных результатов в практику
Зарегистрирован автоматизированный диагностический комплекс для учета результатов РПГА с использованием тест-системы «Люис РПГА тест» (№ ФС 02012005/2712-06).
Диагностический комплекс и методика РПГА-АКАТ используется в лабораторной практике в ведущих центрах дермато-венерологической службы: ГУ ЦНИКВИ, ГУЗ РКВД г. Чебоксары, 121 п-ка г. Москвы, 1-й КВД г. Москвы, КВД г. Мытищи, КВД г. Сочи, КВД г. Калуги, КВД г. Ханты-Мансийска, КВД г. Нижневартовска, КВД г. Майкоп, КВД г. Тверь, КВД г. Кызыл, КВД г.Тольятти.
