Введение к работе
Актуальность проблемы. Производство лечебных ферментных препаратов имеет огромное значение для обеспечения потребностей практического здравоохранения. Одним из ценнейших их представителей является препарат гиалуронидаза. Низкое содержание этого фермента в сыворотке крови человека делает нерентабельным промышленный выпуск гомологичного препарата, что заставляет искать альтернативные источники. В настоящее время в качестве такового используют семенники крупного рогатого скота (КРС) - доступное и дешевое сырье, позволяющее производить отечественный препарат «Лидаза» с относительно низкой себестоимостью.
Нельзя не учитывать тот факт, что препараты, изготовленные на основе сырья животного происхождения, гетерологичны для человека и могут вызывать различные аллергические реакции (Адо А.Д., 1978). Возможность развития таких реакций в ответ на введение тестику-лярной гиалуронидазы (ТГ) показана в работах K.Sakamoto et al. (1980) и Z.Szepfalusi et al. (1997). Кроме того, в результате многолетнего применения в клинике накопился значительный материал, свидетельствующий, что у некоторых больных в ответ на введение данного препарата развиваются аллергические реакции различной степени тяжести. Это указывает на необходимость повышения качества препарата ТГ и, в первую очередь, снижения его аллергизирующих свойств.
Благодаря проведению углубленных исследований ведущими научными центрами мира и выпуску фирмами-производителями вы-сокоочишенных препаратов ТГ стало возможным их интенсивное и широкое применение в клинике. За последние годы, в печати, главным образом зарубежной, появилось много сообщений о высокой эффек-
тивности препаратов ТГ при лечении ишемии и инфаркта миокарда (Earnshaw J.S. et al., 1985), терапии химиорезистентных неоперабельных опухолей различных органов (Knocker S. et al.,1995; St. Croix В. et al., 1998), трансплантации почек (Johnsson С. et al., 1999) и в офтальмологии (Stein R. et al., 1982; Gaider I.G. et al., 1986; Harooni M. et al., 1998).
Кроме того, за рубежом широко используется определение гиа-луронидазы (Г) в сыворотке крови человека с диагностической целью, для уточнения прогноза опухолевых и ревматоидных заболеваний, определения распространенности процесса. В нашей стране подобные исследования не проводились, что объясняется отсутствием как специфической антисыворотки, так и стандарта белка.
Необходимо отметить, что вопросам промышленного получения гиалуронидазы из семенников КРС посвящен ряд работ отечественных исследователей (Виха И.В. и др., 1971; Стекольников Л.И. и др., 1984; Пак В.Н. и др.,1995). К сожалению, качество выпускаемого є России препарата не сравнимо с зарубежными аналогами.
В связи с вышеизложенным, а также учитывая потребность практического здравоохранения в высококачественном препарате тести-кулярной гиалуронидазы, была сформулирована цель и определень задачи настоящего исследования.
Цель работы. Разработка способа получения из сємєнникое крупного рогатого скота отечественного высокоочищенного препарате гиалуронидазы и изучение его свойств. Задачи исследования:
-
Изучить качественный состав коммерческого препарата «Лидаза» производимого предприятиями России.
-
Разработать метод выделения высокоочищенной тестикулярної гиалуронидазы.
-
Создать промышленную технологию и провести научно обоснованную оптимизацию процесса получения высококачественного препарата тестикулярной гиалуронидазы.
-
Провести сравнительное изучение аллергенности препаратов тестикулярной гиалуронидазы различной степени очистки на моделях активной системной анафилаксии и гиперчувствительности замедленного типа.
-
Изучить физико-химические и иммунохимические свойства полученного высокоочищенного препарата тестикулярной гиалуронидазы и оценить его стабильность при хранении.
Научная новизна. Создана научно обоснованная технология, позволяющая получать высококачественный целевой продукт - препарат гиалуронидазы, обладающий высокой удельной активностью и стабильными физико-химическими свойствами.
Впервые установлено наличие в коммерческом и разработанном препаратах гиалуронидазы сывороточного происхождения, которая при рН выше 6,0 полностью теряет свою активность.
Показано, что высокая аллергенность существующего коммерческого препарата «Лидаза» обусловлена присутствием в нем контами-нирующих веществ и прежде всего - бычьего сывороточного альбумина (БСА), содержание которого достигает 27,7 %.
Новизна проведенных исследований подтверждена:
-
патентом РФ № 2158131 от 27.10.2000 г. «Способ получения тестикулярной гиалуронидазы»;
-
патентом РФ № 2159284 от 20.11.2000 г. «Способ получения гиалуронидазы».
Практическая значимость работы. Разработана промышленная технология получения из семенников КРС высокоочищенного ареактогенного препарата тестикулярной гиалуронидазы.
Показано, что высокая аллергенность существующего коммерческого препарата «Лидаза» зависит, в основном, от наличия в нем бычьего сывороточного альбумина.
На основании проведенных исследований на препарат ТГ составлены:
-
проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП), где заложены требования на ограничение содержания в препарате БСА (не более 200 мкг/мл), общего белка (не более 5 мг/мл), удельная активность должна быть не менее 13 у.е./мг;
-
опытно-промышленный регламент (ОПР), обеспечивающий получение препарата необходимого качества.
В соответствии с разработанной нормативно-технической документацией (НТД) приготовлены четыре экспериментально-производственные серии препарата ТГ, которые прошли контроль в ОБТК ГУП «Иммунопрепарат». Получены паспорта качества.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Разработан метод выделения высокоочищенной гиалуронидазь из семенников КРС.
-
Создана промышленная технология получения препарата тести кулярной гиалуронидазы с высокой удельной специфической ак тивностью, обеспечивающая стабильность физико-химически; свойств, максимальное освобождение от контаминации и основ ного аллергизирующего компонента - БСА.
і. Получен отечественный высокоочищенный гипоаллергенный препарат гиалуронидазы, что позволит свести к минимуму риск возникновения нежелательных реакций при терапии больных. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и эбсуждались на Всероссийской научной конференции «Актуальные зопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», посвященной 95-летию Уфимского НИИВС им. И.И. Мечникова ГУП «Иммунопрепарат» (Уфа, ЮОО); на VI11 Российском национальном конгрессе «Человек і лекарство» (Москва, 2001). Диссертация апробирована на заседали ученого совета Уфимского НИИВС им. И.И. Мечникова "УП «Иммунопрепарат» (протокол № 5 от 20.06.2001 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано шесть >абот в центральной печати, из них два патента.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125-ти страницах, иллюстрирована 14-ю таблицами и 13-ю рисунками. Эна состоит из введения, обзора литературы (2 главы), раздела собственных исследований (4 главы), заключения, выводов и списка іитературьі, содержащего 195 источников (60 отечественных и 135 зарубежных).