Введение к работе
Актуальность темы.
На современном этапе патогенетический подход в оценке иммунного статуса играет наиважнейшую роль как в выявлении основных механизмов функционирования иммунной системы при той или иной иммунопатологии, так и в выборе патогенетической терапии при ряде заболеваний (Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н., 1990). При этом речь идет о поиске методов исследования уже известных механизмов (Ьункшюнирования иммунной системы или сравнительно новых позволяющих приблизится к пониманию патогенеза иммунопатологических состояний и более квалифицировано решать вопрос об их иммунокоррекции
Поддержание биологической целостности организма является основным принципом функционирования всех его систем и в первую очередь иммунной. До настоящего времени реализацию данного процесса на клеточном уровне, прежде всего, связывали с активацией, пролиферацией, дифференцировкой и регуляцией. Исследование апоптоза в данном контексте представляет собой достаточно новый Этап развития, хотя отдельные микроскопические признаки, характерные для этого явления, были описаны еще в начале века. Апотоз в клетках взрослого организма является повсеместным и постоянно происходящим процессом. Иммунологические реакции, циклическая регрессия и возрастная инволюция некоторых органов и тканей (например половых желез тимуса эпифиза) - далеко неполный перечень физиологических процессов сопровождающихся апоптозом По мере роста интереса в научном,мире к проблемам апоптоза встал вопрос об экспериментальной модели изучения данного феномена и соответственно о факторах индуцирующих программированную клеточную гибель Часто для индукции апоптоза используются глюкокортикостероидные гормонь^ Гибель тимоцитов в процессе дибФеренцировки в тіусе под воздействием глюкокортикостероидных шрмонов является классическоймоделью индукции апоптоза in vitro.
В своих исследованиях апоптотической гибели лимфоцитов мы применяли модифицированную методику А. Николетти (Nicoletty 1.,
Migliorati G., Pagliacci М.С. et al. 1991).
Данный метод был применен для экспериментального исследования апоптотического процесса в мышиных тимоцитах при помощи проточной цитометрии. Однако, при использовании лимфоцитов человека отмечается целый ряд особенностей, которые мы постарались учесть в нашей работе. Известно, что чаще всего именно в активированном состоянии клетка способна к выполнению той или иной заложенной в ней функции или программы, в том числе и апоптотической гибели. Такие известные индукторы апоптоза, как глюкокортикостероидные гормоны и вещества, обладающие цитостатическим действием, влияют на клетку в основном в активированном состоянии (Dive С, Hickman J. А. 1991). Считается,
что применение в качестве митогена - фитогеммаглютинина в культуре, позволяет смоделировать состояние активации и выявить закономерности программированной клеточной гибели лимфоцитов под воздействием активационного сигнала (Lanza L, Scudeletty М., PuppoF.etal. 1996).
Нарушение клеточной гибели может приводить к возникновению патологических состояний и заболеваний, которые сопровождаются как дегенеративными, так и пролиферативными изменениями (OnishiY, Kizaki Н. 1994).
Повышенная активация апоптоза является звеном в патогенезе ВИЧ инфекции, нейродегенеративных и миелодиспластических заболеваний (Del Llano А. М., Lavergne J. А. 1994). Ингибирование клеточной гибели определяет опухолевые поражения различной природы, аутоиммунные и вирусные заболевания (Fisher D. 1994). В последнее время появился термин "апоптотогенные иммунодефициты" (Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н. 1998).
Исследования последних лет выявили немаловажную роль процесса апоптоза в развитии вторичного иммунодефицита при хронической почечной недостаточности (ХПН) (Savill J. 1994).
Известно, что данная патология характеризуется выраженной прогрессирующей анемией и нарастающей лимфопенией. Доказано, что в качестве одной из основных причин развития иммунодефицита при ХПН выступает полифуранкарбоновая кислота (ПФК) (N iwa Т.. Yazawa Т., KodamaT., UeharaY. etal. 1990).
Данное соединение, накапливаясь в сыворотке уремических больных, вызывает массовую гибель клеток предшественниц эритроидного ряда. Нам представлялось целесообразным изучить влияние ПФК на пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов,
как здоровых доноров, так и больных ХПН.
Изучение апоптогенеза при тех или иных патологических состояниях лежит в основе их целенаправленной иммунокоррекции. В настоящее время, в клинической практике широкое применение получили препараты интерферонов и их индукторы, применяющиеся для лечения многих иммунопатологических состояний. Механизм их действия остается до конца невыясненным. В связи с вышеизложенным нам показалось актуальным изучить влияние индуктора интерферона препарата "Полудан" представляющего синтетический комплекс ПолиА:ПолиУ на пролиферативную активность и апоптоз в культуре лимфоцитов в норме и при хронической почечной недостаточности.
Для количественного анализа апоптоза наиболее быстрым и простым в техническом плане является метод проточной цитометрии с использованием различных ДНК красителей, в частности, пропидин нодида. Морфологические признаки апоптоза были изучены очень давно. На основании морфологической характеристики, выделяют несколько основных стадий апоптоза. Одной из задач, которую мы себе поставили, был сравнительный анализ двух методов количественной оценки: метод проточной цитометрии и количественный анализ по морфологическим критериям.
Все вышесказанное свидетельствует об актуальности проблемы, связанной с изучением программированной клеточной гибели лимфоцитов человека в норме и при иммунопатологии.
В связи с этим целью нашей работы явилось следующее: изучение программированной клеточной гибели лимфоцитов человека in vitro и влияние на нее дексаметазона, полифуранкарбоновой кислоты и синтетического комплекса ПолиАЛолиУ в норме и при хронической почечной недостаточности.
Задачи.
-
Выработка оптимальных условий количественного анализа апоптоза лимфоцитов периферической крови человека in vitro методом проточной цитометрии.
-
Морфологическая оценка апоптотических изменений лимфоцитов.
-
Проведение сравнительного анализа морфологического и цитометрического методов определения апоптоза.
-
Изучение действия различных агентов на пролиферативную
активность апоптоз лимфоцитов здоровых доноров в культуре in vitro (кортикостероиды, ПФК, комплекс ПолиАЛолиУ).
-
Изучение влияния дексаметазона, полифуранкарбоновой кислоты и синтетического комплекса ПолиАЛолиУ на апоптоз лимфоцитов больных ХПН в культуре in vitro.
-
Иммунофенотипический анализ лимфоцитов больных ХПН в культуре.
Научная новизна.
Разработана модель количественной оценки апоптоза лимфоцитов периферической крови контрольной группы здоровых доноров с использованием различных доз дексаметазона с помощью проточной цитометрии. Проведен сравнительный анализ цитометрического анализа апоптоза и морфологической оценки при помощи световой микроскопии. Изучено влияние различных доз полифуранкарбоновой кислоты на пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов здоровых доноров и больных в терминальной стадии хронической почечной недостаточности. Выявлен значительный апоптогенный эффект у полифуранкарбоновой кислоты.
Исследовалось влияние синтетического комплекса ПолиАЛолиУ на апоптоз лимфоцитов в норме и у больных с ХПН. Изучая фенотип лимфоцитов в условиях культивации in vitro, получены экспериментальные доказательства, что иммунодефицит у больных с ХПН, сопровождающийся лимфопенией лимфоцитов, протекает при непосредственномучастии ПФК, за счет индукции апоптоза и угнетения пролиферативной активности лимфоцитов, преимущественно CD4 субпопуляции. Отмечено некоторое снижение чувствительности лимфоцитов больных ХПН к индукции апоптоза под влиянием дексаметазона и ПФК, по сравнению с культурой здоровых доноров.
Выявлены значительные различия влияния митогена ФГА на апоптоз лимфоцитов в норме и у больных с ХПН. На основании полученных нами данных сделан вывод об имеющемся у больных ХПН эффекте предактивации CD4+ лимфоцитов in vivo, приводящей к усиленной апоптотической гибели лимфоцитов.
Экспериментальные исследования влияния синтетического комплекса ПолиАЛолиУ выявили его способность предотвращать гибель и повышать жизнеспособность лимфоцитов в культуре in vitro как здоровых доноров, так и больных ХПН. Полученные результаты могут служить основанием для дальнейщего изучения ПолиАЛолиУ с
целью применения его для патогенетической терапии заболеваний, связанных с дефектом процесса апоптоза.
Практическая значимость.
На современном этапе не всегда при помощи существующих методов исследования, удается полно раскрыть механизм развития той или иной иммунопатологии. С введением термина "апоптоз" и изучением участия данного механизма в патогенезе развития различных заболеваний, а также индукция или наоборот ингибиция программированной клеточной гибели под влиянием различных веществ, в том числе и лекарственных препаратов, обусловило потребность в оценке данного процесса. Разработанная нами модель количественной оценки активационно индуцированного in vitro апоптоза лимфоцитов позволяет оценивать данный процесс при помощи проточной цитометрии в динамике. Данный метод также позволяет исследовать влияние различных веществ и лекарственных препаратов на апоптоз, а также изучать апототические процессы в связи с пролиферативной активностью лимфоцитов.
Апробация материалов диссептаиии.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на симпозиуме РААКИ (Москва, 1998), на IV Международном конгрессе по иммунореабилитации (Сочи, 1998), на IV Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1999), на конференции кафедры иммунологии РГМУ и отдела иммунологии МЛК (Москва, 1999), на V Международном конгрессе по иммунореабилитации (Тенериф, 1999).
Публикации
По результатам исследования опубликовано 5 печатных работ.
Объем и структура диссертации