Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 3
ВВЕДЕНИЕ 4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
Функциональное состояние иммунной системы при туберкулезе 10
Роль IL-18 в патогенезе туберкулеза 18
Создание противотуберкулезных вакцин 23
Общая характеристика дендритных клеток 26
Роль дендритных клеток в патогенезе туберкулеза 33
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 38
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 49
Получение зрелых антиген-активированных дендритных клеток из моноцитов периферической крови 49
Модуляция эффекторных функций мононуклеарных клеток с помощью зрелых антиген-активированных дендритных клеток 56
3.2.1. Влияние антиген-активированных ДК на апоптоз и распределение
мононуклеарных клеток по фазам клеточного цикла 56
Влияние антиген-активированных ДК на пролиферативную активность мононуклеарных клеток in vitro 59
Влияние антиген-активированных ДК на количество IFN-y-продуцирующих клеток в культуре мононуклеарных клеток in vitro 62
Влияние антиген-активированных ДК на продукцию IFN-y и IL-4 в культуре мононуклеарных клеток in vitro 66
Влияние антиген-активированных ДК на экспрессию перфорина мононуклеарными клетками in vitro 69
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 72
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 88
ВЫВОДЫ 90
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 92
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
BCG-бацилла Кальметта-Герина
FCS - эмбриональная телячья сыворотка
GM-CSF - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор
IFN-y - интерферон гамма
IL - интерлейкин
LPS - липополисахарид
PPD - очищенный белковый дериват М. tuberculosis
ТВ - туберкулез
TNF а - фактор некроза опухоли альфа
АПК - антиген-представляющие клетки
ДК - дендритные клетки
МНК - мононуклеарные клетки
нф - неприлипающая фракция
ПК - периферическая кровь
рчІЬ - рекомбинантный человеческий интерлейкин
Введение к работе
Актуальность проблемы
Туберкулез относится к числу так называемых социальных болезней и характеризуется хроническим течением, многообразием клинических форм и поражением различных органов, главным образом дыхательной системы. К факторам риска заболевания относятся иммуносупрессивные заболевания, дефицит питания, стресс, социальные условия, а также генетическая предрасположенность, обусловленная дефектом генов костимуляторных молекул, цитокинов и их рецепторов [5]. Одним из основных механизмов патогенеза туберкулеза является нарушение клеточного иммунитета, осуществляемое по нескольким механизмам:
длительная персистенция М. tuberculosis внутри антиген-презентирующих клеток, таких как макрофаги и ДК
нарушение презентации антигена
секреция иммуносупрессорных цитокинов и появление иммуносупрессорных Т-клеток
повышение апоптоза Т-клеток и подавление апоптоза инфицированных макрофагов [3, 53].
В настоящее время развитие новых эффективных подходов к лечению инфекционных заболеваний связано с использованием собственных механизмов защиты организма и их возможной модуляции. Протективный иммунный ответ на М. tuberculosis связан с индукцией эффекторных функций Т хелперов 1 типа, что в свою очередь зависит от представления им антигена и дифференцировки «наивных» Т-клеток, что осуществляется дендритными клетками как основными антиген-презентирующими клеточными элементами.
В патогенезе туберкулеза дендритные клетки наряду с макрофагами являются клетками-мишенями для М. tuberculosis. Инфицированные М. tuberculosis дендритные клетки могут способствовать распространению заболевания и накапливаться в лимфоидных органах и грануломах
инфицированных крыс и людей, что говорит об отсутствии или подавлении эффективных механизмов уничтожения М. tuberulosis и формировании ниш для долговременного выживания микобактерий в участке инфицирования [ПО]. В то же время дендритные клетки обладают уникальными механизмами захвата антигена и представления его наивным Т-клеткам, усиливают врождённый иммунитет, регулируют развитие специфического иммунного ответа, определяют направленность и активность иммунных реакций, поэтому их все чаще используют для иммунотерапии различных заболеваний [2]. Кроме того, показано, что ДК, полученные in vitro из моноцитов, культивированных с GM-CSF и IL-4, не поддерживают внутриклеточную репликацию М. tuberculosis в отличие от макрофагов, полученных из тех же самых моноцитов [168].
Эффективность иммунного ответа при бактериальной инфекции также зависит и от иммунорегуляторных факторов, непосредственно определяющих состояние иммунной системы в норме и при патологии, в частности IL-18. При микобактериальной инфекции IL-18 стимулирует продукцию IFN-y Т-клетками и NK-клетками, тем самым, способствуя активации макрофагов и уничтожению М. Шбеги/сш'я-инфицированных клеток. Однако у пациентов, больных туберкулезом наблюдается значительное снижение продукции IL-18 и IFN-y. При этом в ряде работ отмечают роль IL-18 в дифференцировке наивных Т-клеток в Т-хелперы 1 типа вообще и в М. ґибеги/ош-индуцированном синтезе цитокина 1-го типа IFN-y в частности [182].
Исходя из функциональной неполноценности дендритных клеток в патогенезе туберкулеза, а также роли дендритных клеток и IL-18 для реакций клеточного иммунитета, представлялось актуальным и значимым рассмотреть возможность стимуляции эффекторных функции мононуклеарных клеток периферической крови больных туберкулезом под действием зрелых аутологичных ДК и IL-18 in vitro.
Цель работы:
Изучить возможность модуляции антиген-специфического иммунного ответа с помощью аутологичных активированных дендритных клеток и интерлейкина-18 в культуре мононуклеарных клеток больных туберкулезом. В связи с поставленной целью предстояло решить следующие задачи:
Исследовать фенотипические и функциональные показатели дендритных клеток больных туберкулезом легких по сравнению с дендритными клетками здоровых доноров.
Исследовать особенности прохождения дендритных клеток по клеточному циклу в процессе генерации под действием используемых факторов дифференцировки.
Исследовать влияние антиген-специфических дендритных клеток и IL-18 на пролиферативную активность МНК в ответ на специфический ' антиген М. tuberculosis ESAT-6.
Исследовать влияние антиген-специфических дендритных клеток и IL-18 на количество IFN-у-продуцирующих клеток и продукцию IFN-y и IL-4 МНК в ответ на специфический антиген М. tuberculosis ESAT-6.
Исследовать влияние антиген-специфических дендритных клеток и IL- > 18 на экспрессию перфорина МНК в ответ на специфический антиген М. tuberculosis ESAT-6.
Научная новизна работы.
Установлено, что использование рч1Ь-18 при совместном культивировании мононуклеарных клеток со зрелыми аутологичными ДК приводит к максимальной стимуляции антиген-индуцированной продукции IFN-y, достоверному повышению содержания IFN-y -продуцирующих клеток по сравнению с МНК, культивированными с ДК в отсутствии IL-18.
Показана фенотипическая и функциональная состоятельность зрелых дендритных клеток, презентирующих специфический антиген М. tuberculosis ESAT-6, полученных из моноцитов периферической крови пациентов,
больных туберкулезом легких при использовании модифицированного «короткого» 48 часового протокола.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные результаты расширяют представления об
иммунорегуляторном потенциале дендритных клеток моноцитарного происхождения при туберкулезе легких, демонстрируют возможность влияния цитокинов и антигенов на направленность противоинфекционного иммунного ответа, предполагают возможность использования антиген-активированных дендритных клеток, IL-18 и мононуклеарных клеток в качестве эффективного подхода к восстановлению специфического иммунного ответа in vivo у больных туберкулезом легких. Практическая значимость работы заключается в экспериментальном обосновании способа , модуляции клеточного иммунного ответа в культуре МНК, который может быть основой новой клеточной технологии лечения туберкулеза.
Основные положения, выносимые на защиту
Зрелые аутологичные ДК стимулируют продукцию IFN-y и цитотоксического фактора перфорина мононуклеарными клетками пациентов, больных туберкулезом легких в ответ на специфический антиген ESAT-6.
Рекомбинантный человеческий IL-18 играет адъювантную роль в развитии антиген-специфического иммунного ответа при совместном культивировании зрелых аутологичных ДК и мононуклеарных клеток.
Апробация материалов диссертации
Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
Ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна - 2005» Новосибирск, 2005
Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006)
Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006)
III Международная конференции "Фундаментальные науки медицине" (Новосибирск, 2007)
Межрегиональной научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Омск, 2007)
Семинарах экспериментального отдела ГУ НИИ КИ СО РАМН (Новосибирск, 2006, 2007)
7. Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 1 статья в издании, рекомендованном ВАК.
Самостоятельность выполненной работы.
Результаты, представленные в данной работе, получены лично автором на базе лаборатории молекулярной иммунологии ГУ НИИ КИ СО РАМН и Центра коллективного пользования СО РАМН.
Большую признательность автор выражает научному руководителю
работы профессору, д.м.н. СВ. Сенникову за подробное конструктивное
обсуждение полученных результатов, а также всем сотрудникам лаборатории молекулярной иммунологии за благожелательное отношение в ходе выполнения работы.
Большую признательность автор выражает сотрудникам лаборатории профессора, д.м.н. Кожевникова B.C. за доброжелательное отношение и помощь при получении данных с помощью прибора FACSCalibur, а также сотруднику Новосибирского НИИ туберкулеза к.м.н. Лаушкиной Ж.А. за помощь в формировании выборки пациентов, больных туберкулезом легких.
![Динамика плазменно-растворимых антигенов системы HLA при трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток больным гемобластозами [Электронный ресурс]](/i/i/4353/180098.png "Динамика плазменно-растворимых антигенов системы HLA при трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток больным гемобластозами [Электронный ресурс] Голубенко Рамиля Ахметовна")