Введение к работе
Актуальность проблемы
Вегетан - новый эффективный иммуностимулятор растительной природы, полученный в Институте иммунологии Минздравмедпрома РФ. Он оказывает сильное иммуностимулирующее действие при парентеральном введении различным животным. Описаны условия применения вегетана, при которых реакция антнтелообразования на гетерологнчные антигены повышалась в 10-100 раз. В культуре лимфоцитов вегетан индуцирует пролиферацию D лимфоцитов и их дифферениировку в Ig-секретлрующие клетки. Митогенный эффект вегетана сильнее, чем липополисахарида из E-coli (ЛПС), но при этом он имеет очень широкий диапазон нетоксических митогенных концентраций.
Испытания на животных показали, что вегетан обладает сильным иммуностимулирующим действием и его лечебный эффект при целом ряде тяжелых заболеваний домашних и сельскохозяйственных животных не вызывает сомнений. Для широкого применения такого мощного препарата естественно прежде необходимо детально изучить его структуру и механизмы влияния на иммунную систему. Такие исследования "интенсивно ведутся в Институте иммунологии.под руководством профессора Р.И. Атзуллаханова.
Вегетан - это полимер с заряженными карбоксильными
группами. В связи с этим было сделано предположение, что он имеет
сходный механизм действия с водорастворимыми линейными
полннонами-иммуностимуляторамн . Эти вещества с успехом
применяют для поликлональной стимуляции иммунитета (Diamantstein
Т. et а!..1973, 1975; Земсков В.М., 1973; Петров P.B.VХаитов P.M. и
соавт. 1974-1977). Полиионы используют и в качестве
иммуноадыовантов для активации специфического иммунного ответа на антиген. Известно, что полиноны активируют миграцию нммунокомпетентных клеток в периферические лимфоидные органы, а также взаимодействие Г и В лимфоцитов в ходе антителогенеза. Полиионы усиливают хелперную функцию макрофагов. Кроме того, они могут выступать в роли ко-факторов пролиферации лнмфоидных клеток. Установлено, что ответ лнмфоидных клеток на полиноны определяется их способностью модифицировать ионпроводящие свойства плазматической мембраны (Атауллаханов Р.И. и соавт. 1984). Полиной индуцирует быстрое увеличение пассивных потоков К+, Naf, Са++, что сопровождается активацией транспорта этих катионов мембранными АТФазами (Петров Р.В., Хаитов P.M., Атауллаханов Р.И. 1984). Методом локальной фиксации потенциала patch-clamp было показано, что эта проводимость имеет неканальную природу (Мальцев В.А. с соавт, 1989-1991), В настоящей работе меюдом patch-clamp были исследованы изменения ионной проводимости плазматической мембраны лимфоцитов при их активации Вегетаном. Влияние вегетана
ни клеточную мембрану сравнивали с эффектами других известных активаторов В клеток, и 0 частности, с влиянием на мембрану В лммфошггов Л ПС и липопептида (В-клеточный активатор, синтетический аналог липопротеина из бактериальной стенки), а также с действием ФГА на мембрану Т лимфоцитов.
Цель и задачи исследования Целью настоящей работы было изучение изменений ионной проводимости плазматической мембраны В лимфоцитов под влиянием нового иммуностимулятора вегетана и сравнение его действия с эффектами других известных активаторов В лимфоцитов -"ПС и липопептида, а также Т клеточного активатора ФГА. В процессе проведения работы решались следующие задачи:
1. Изучение базовых характеристик ион-проводящей
системы мембраны В-лимфоцнгов: оценка суммарной 'ионной
проводимости и вольт-амперных характеристик мембраны,
идентификация ионных каналов, определение их количества,
измерение электрического потенциала мембраны и электрической
емкости мембраны покоящихся В лимфоцитов.
-
Изучение быстрых (минуты) эффектов вегетана на мон-проводящие свойства мембраны В лимфоцитов.
-
Изучение медленных (часы, десятки часов) эффектов вегетана на ион-проводящие свойства мембраны В лимфоцитов.
4. Сравнение действия вегетана на нонпроводяшне
свойства мембраны с эффектами известных активаторов В лимфоцитов
(ЛПС, лилонпітид) и Т лимфоцитов (ФГА).
Научная ucsuuia
Впервые показано, что новый иммуностимулятор
вегетан, а также синтетический аналог бактериального липопротеина,
липопептид, значительно увеличивают, калиевую проводимость
плазматической мембраны В лимфоцитов. Показано, что рост
проводимости связан не только с увеличением размера клетки, но и с
многократным повышением поверхностной плотности калиевых
каналов. Эти каналы подробно охарактеризованы и
фармакологически идентифицированы. Впервые выявлена и оценена корреляция между площадью поверхности мембраны лимфоцитов и се калиевой проводимостью в разные сроки активации клеток. Зарегистрированы и подробно описаны Са ^-активируемые К+-каналы в мембране активированных В клеток. Впервые на Т лимфоцитах крови человека и В лимфоцитах мыши при работе в натнвной конфигурации метода patch-clamp была показана гиперполярнзация мембраны в ответ на увеличение внутриклеточной концентрации кальция.
Научно-практическая значимость
Полученные результаты вносят существенный вклад в
современные представления о сопряжении рецепции активирующего
лигпнда с суммарной К+-проводимостыо мембраны лимфоцита, Са++-
сигналом и электрическим потенциалом мембраны. Исолсдовины
основные электрофизиологические характеристики мембраны до и
после активации новым иммуностимулятором всгетаном.
Сопоставление размеров клеток с величиной суммарной К+-проводимости в процессе трансформации В лимфоцита в лнмфобласт под влиянием вегетана показало, что вегетан значительно увеличивает К+-проводимость, но этот эффект является не сигналом, запухающим процесс активации, а ее следствием. Сравнение действия вегетана с действием ЛПС и липопептида на В лимфоциты и действием ФГА на Т лимфоциты свидетельствует о том, что многократное увеличение К+-проводимости является универсальным признаком бласттрансформации лимфоцитов. Кроме того, обнаружены и охарактеризованы кальций-активируемыс калиевые каналы, описанные ранее для возбудимых клеток. Их наличие и мембране лимфоцитов, объясняет механизм сопряжения Са++-сигнала с мембранным потенциалом и ,в частности, типерполяризашпо мембраны ' лимфоцитов при активации. Отработанные автором способы изучения Са++-активируемых К+-каналов могут с успехом применяться в электрофнзиологичсских исследованиях.
Апробация работы Основные результаты исследований были обсуждены на Всесоюзном симпозиуме "Ионные каналы в биологических мембранах" (п.Планерское, 1990г.) и на совместной межлабораторной научной конференции лабораторий активации иммунитета . и искусственных антигенов Института иммунологии Минздрава РФ и лаборатории физической биохимии систем крови Гематологического Научного Центра РАМН, от 10.П.1993 г.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из яведен)ія, обзора литературы,
описания материалов и методов, трех і лав собственных исследований,
выводов и списка литературы Материалы диссертации изложены
на страницах машинописного текста, иллюстрированы 20
рисунками и 1 таблицей. В списке использованной литературы
указаны источника.