Влияние углеводов, представленных на поверхности клеток-мишеней, на цитолитическую активность естественных киллеров человека Абакушина, Елена Вячеславовна

Введение к работе

Актуальность темы исследования. Естественные киллеры (ЕК-клетки) являются эффекторами врожденного иммунитета и выполняют в организме специализированную цитотоксическую функцию, направленную на уничтожение опухолевых и вирус-инфицированных клеток. ЕК-шгетхи не нуждаются в предварительной сенсибилизации для поражения мишеней и обладают способностью самостоятельно распознавать поврежденные клетки, подлежащие элиминации. Механизм этого распознавания пока не изучен. Тем не менее, в настоящее время установлено, что реактивность ЕК-клеток регулируется балансом между поступающими с поверхности клетки-мишени позитивными сигналами, индуцирующими эффекторные функции, и негативными сигналами, которые препятствуют клеточному лизису. В процессе распознавания участвует ряд поверхностных рецепторов ЕК-клеток. Лигандами для таких рецепторов являются различные молекулы, многие из которых еще не идентифицированы, хотя известно, что в качестве негативного сигнала для ЕК-клеток выступают молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) класса I на поверхности клеток-мишеней. Было найдено несколько типов ингибиторных рецепторов ЕК-клеток, соответствующих разным аллелям этих молекул. Позитивные сигналы в различных моделях опосредуются разными структурами на поверхности клеток-мишеней, в то же время универсального активирующего сигнала пока не найдено.

В распознавании ЕК-клетками клеток-мишеней участвуют углеводы, представленные на клеточной поверхности мишеней. Литературные данные свидетельствуют о существенной роли поверхностных сахаридов в распознавании опухолевых клеток естественными киллерами. Показано как позитивное, так и негативное влияние различных олигосахаридов на опосредованную ЕК-клетками цитотоксичность. Однако, до сих пор не ясно, какие углеводные составляющие гликопротеинов или гликопипидов приводят к изменению функциональной активности естественных киллеров. Неизвестно также, с какими рецепторами ЕК-клеток взаимодействуют углеводы поверхности клеток-мишеней.

Гетерогенность природных гликоконъюгатов, особенно гликопротеинов, осложняет их применение в качестве инструментов для исследования углеводсвязывающих молекул. Отмечающийся в литературе значительный разброс

данных объясняется различиями применяемых методик. Традиционный подход с использованием синтетических олигосахаридов для ингибировшшя опосредованной ЕК-клетками цитотоксичности в такой сложной системе, как смесь эффекторов и мишеней, не может дать полной информации о том, какие именно компоненты, каких клеток и в какой степени вовлечены в межклеточное взаимодействие. Поэтому возникает объективная необходимость изучения роли олигосахаридов поверхности клетки-мишени в регуляции эффекторной функции ЕК-клеток с помощью новых модельных систем. Таким образом, поиск новых подходов для изучения влияния олигосахаридных структур, представленных на поверхности клеток-мишеней, на цитотоксическую активность ЕК-клеток человека является актуальной проблемой.

Цель исследования. Целью данной работы явилось исследование влияния углеводов, представленных на поверхности клеток-мишеней, на цитотоксическую активность естественных киллеров человека с помощью новой модельной системы, включающей модификацию поверхности клетки-мишеші с использованием липофильных неогликоконъюгатов.

Задачи исследования:

1. Подобрать оптимальные условия для встраивания липофильных неогликоконъюгатов (время, температуру, концентрацию, содержание липидного компонента) в клетки линий К562 и Raji с учетом клеточной жизнеспособности.

2. Изучить механизм ассоциации гликоконъюгатов с плазматической мембраной и оценить время жизни этих молекул на поверхности клеток-мишеней.

3. Оценить пространственную доступность олигосахаридов, встроенных в плазматическую мембрану клеток-мишеней, для взаимодействия с ЕК-клеткаші.

4. Проанализировать влияние модификации клеточной поверхности с помощью гликоконъюгатов на фенотип клеток-мишеней (экспрессию молекул CD45 и белков теплового шока).

5. С помощью разработанной модели оценить влияние различных олигосахаридов на цитотоксическую активность ЕК-клеток, полученных из периферической крови человека, с использованием клеток-мишеней линий К562 и Raji.

6. Оценить в данной модели эффекты гликоконъюгатов при использовании обогащенной ЕК-клетками культуры периферических мононуклеаров человека.

7. Оценить в данной модели влияние гликоконыогатов на цитотоксичность, опосредованную ЛАК-клетками (лимфокин-активированные киллеры) человека.

Научная новизна. До настоящего времени не было проведено широкого скрининга углеводов поверхности клеток-мишеней по их действию на функциональную активность естественных киллеров человека, что в немалой степени связано с отсутствием адекватных моделей для решения этой задачи. В данной работе была создана модельная система с использованием липофильных неогликоконыогатов для изучения роли олигосахаридов, представленных на поверхности клеток-мишеней, в процессе их распознавания ЕК-клетками.

В рамках указанной модели впервые проанализировано влияние девяти различных олигосахаридов, включая опухолеассоциированные, группоспецифические и ксеноантигены, сиалированные, сульфатированные и фукозилированные углеводы, на цитотоксичность, опосредованную ЕК-клетками человека. Проведенные исследования выявили позитивные эффекты трех олигосахаридов (Le^x, 3'HSOjLe^x и Le^Y), в то время как остальные сахариды не оказывали влияния или незначительно ингибировали цитотоксичность ЕК-клеток. Существенно, что указанные три олигосахарида содержат общий структурный мотив, а именно - трисахарид Le^x.

Практическая значимость. Разработанная модель направлена на изучение механизмов распознавания ЕК-клетками клеток-мишеней, что весьма актуально для экспериментальной иммунологии. В частности, данная модель может явиться эффективным средством не только для идентифицикации лигандов рецепторов ЕК-клеток (например, лектинов), но и для изучения вовлеченности углеводных структур в каскад событий, приводящих к цитотоксическому лизису клеток-мишеней. В то же время, данная модель может эффективно использоваться и в клинической иммунологии, поскольку характеристика углеводных структур, отличающих нормальные клетки организма от измененных, может обеспечить основу для развития новых подходов к иммунотерапии опухолей и инфекционных болезней человека. Наряду с этим, существенной практической значимостью обладают полученные в работе данные о роли структурного мотива Gaip(l-4)GlcNAcP(l-3)Fuca как сигнала для активации ЕК-клеток. Эти данные расширяют существующие представления о механизмах распознавания мишеней ЕК-клетками и открьшают новые возможности

направленной модификации поверхности опухолевых клеток с целью увеличения их чувствительности к цитотоксическому действию естественных киллеров.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на 3-ей и 4-ой Международных летних школах по иммунологии (Пушино, 1998, 2000), 2-ом Национальном конгрессе Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) (Москва, 1998), 10-ом Интернациональном конгрессе по иммунологии (Нью Дели, 1998), 6-ом конгрессе Британского общества иммунологов (Харрогейт, 1998), 2-ом съезде имигунологов России (Сочи, 1999), 3-ей, 4-ой и 5-ой научных конференциях: "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 1999, 2000, 2001), международной школе по иммунологии (Неаполь, 2000), 7-ой и 8-ой конференциях по человеческим лейкоцитарным антигенам дифференцировки (Харрогейт, 2000, 2001), курсе ФЕБО по молекулярной динамике мембранного биогенеза (Каргез, 2001) и на конференции отдела иммунологии Института биоорганической химии РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, список которых

приводится в конце автореферата.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материатов и методов, собственных исследовашш и обсуждения полученных результатов, выводов и библиографического списка цитируемой литературы.

Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, иллюстрирована 26 рисункаїїш и 6 таблицами. Библиография содержит 166 работ отечественных и зарубежных авторов.