Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Литературный обзор 11
Молекулярная организация и подвижность в модельных биологических мембранах 11
Постановка задачи 17
Глава 2 Исследование подвижности молекул методами импульсного ЭПР 18
Изучение молекулярных движений методами спектроскопии ЭПР 18
Теоретическое описание импульсных экспериментов ЭПР 21
Глава 3 Экспериментальная часть 30
Объекты исследования и методы приготовления образцов 30
Описание экспериментальной установки и методик проведения экспериментов 33
Глава 4 STRONG Исследование подвижности спин-меченых липидов в модельной мембране по данным
переноса намагниченности по спектру ЭПР STRONG 38
Введение 38
Постановка задачи 39
Результаты 39
Обсуждение результатов 44
Заключение 47
Глава 5 STRONG Применение метода ESEEM для изучения движений дейтерированных (фрагментов)
молекул вблизи спиновых зондов STRONG 48
Введение 48
Постановка задачи 49
Результаты и обсуждение 49
Вращение метильных групп 49
Стекло орто-терфенила 54
Стекло вода/ДМСО 56
Заключение 59
Глава 6 Исследование движения воды в гидратной оболочке модельной мембраны 60
Введение 60
Постановка задачи
Результаты и обсуждение 61
Заключение 65
Глава 7 Исследование подвижности спин-меченого пептида Trichogin GA IV по данным стимулированного электронного спинового эха 66
Введение 66
Постановка задачи 67
Результаты 67
Обсуждение результатов 70
Заключение 75
Основные результаты и выводы 76
Список литературы 78
- Молекулярная организация и подвижность в модельных биологических мембранах
- Теоретическое описание импульсных экспериментов ЭПР
- Обсуждение результатов
- Исследование подвижности спин-меченого пептида Trichogin GA IV по данным стимулированного электронного спинового эха
Введение к работе
Актуальность работы
Хорошо известно, что жизненно важные процессы в биологических системах
определяются движениями молекул. Современные физические методы исследования позволяют
изучать движения в биологических системах в широком частотном и температурном диапазоне,
выделять динамику отдельных составляющих молекулы. Однако все методы имеют
ограничения, препятствующие получению полноценной информации о динамике
биологических молекул.
В биологических системах при повышении температуры вблизи 170-230 К наблюдается динамический переход, который заключается в резком увеличении амплитуды наносекундных ограниченных смещений атомов. Изучение природы данного перехода и характера движения биологических молекул привлекают значительный интерес в связи с появлением биологической активности молекул вблизи температуры динамического перехода (в том числе и биомембран).
Эволюция бактерий, а также ненадлежащее применение антибиотических лекарственных
препаратов приводит к появлению штаммов, устойчивых к воздействию антибиотиков.
Мембранно-модифицирующие пептиды являются перспективным направлением исследования,
поскольку бактерии не способны выработать устойчивость к воздействию пептидов на
клеточные мембраны. Предложены различные модели изменения структуры и
функционирования клеточных мембран под воздействием пептидов-антибиотиков, однако активность небольших пептидов не всегда может быть описана в рамках данных моделей. Помимо этого, в литературе фактически не обсуждаются динамические модели мембранно-модифицирующего воздействия пептидов.
Спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) сочетают в себе простоту и большой потенциал для решения широкого круга биофизических и химических задач: методы импульсного ЭПР раздвигают границы изучения времен корреляции движения до диапазона с~10-9-10-3 с, а в ряде случаев позволяет определить тип движения молекулы – изотропные и анизотропные вращения, ограниченные вращения. Развитые методы селективного спин-мечения молекул способствуют выяснению локализации движений в биологической системе, определению структуры ближайшего окружения спин-меченой молекулы. Представляется поэтому важным использование развитых в ЭПР подходов для изучения динамики молекул в биологических мембранах.
Цель работы
Основными целями исследования являются: расширение представлений о характере движений липидов в мембране, взаимосвязи подвижности гидратной воды и липидной мембраны вблизи температуры динамического перехода и выявление новых механизмов антимикробной активности пептидов. Для достижения поставленных целей были сформулированы следующие задачи:
-
Исследование влияния холестерина и степени гидратации мембраны на подвижность липидов, спин-меченых в различных положениях алкильной цепи.
-
Исследование возможности применения метода ESEEM для изучения молекулярных движений вблизи спиновых зондов и меток.
-
Изучение движения молекул воды в гидратной оболочке модельной биологической мембраны методом ESEEM.
-
Изучение подвижности пептида-антибиотика Trichogin GA IV в модельной мембране.
Научная новизна
Обнаружены вращения липидов в полярной и неполярной областях липидного бислоя, соответствующие -релаксационному процессу при температурах 120-225 К. Показана зависимость локальных движений липидов от степени гидратации мембраны, а также неравномерное влияние холестерина на движения липидов, спин-меченых в различном положении алкильной цепи.
Продемонстрирована возможность применения метода ESEEM к исследованию молекулярных движений вблизи спиновых зондов и меток на примере вращения метильных групп, движения молекул орто-терфенила и молекул воды в смеси вода/ДМСО.
Применение метода ESEEM позволило получить информацию о движении молекул воды в гидратной оболочке модельных биологических мембран. Обнаружен переход от ограниченного к изотропному движению молекул воды при 180-190 К, который коррелирует с литературными данными о динамическом переходе непосредственно в самой мембране.
Обнаружена корреляция между вращениями пептида-антибиотика Trichogin GA IV в миллисекундном диапазоне и его ориентацией в мембране. Предложена динамическая модель функционирования канала, образованного пептидом в мембране, объясняющая антимикробное действие трихогина.
Практическая значимость работы
Установлено, что холестерин по-разному влияет на подвижность вдоль алкильной цепи липида, что способствует пониманию механизмов липид-холестериновых взаимодействий в биологических мембранах.
Показана возможность применения метода ESEEM к исследованию молекулярных движений, что позволило получить уникальные данные о подвижности магнитных ядер в гидратных/сольватных оболочках (~0.4-1 нм) спиновых зондов и меток.
Получена принципиально новая информация о свойствах низкотемпературного динамического перехода в модельных биологических мембранах: динамический переход в гидрофобной части фосфолипидного бислоя сопровождается изменением характера движения молекул воды в ближайшей гидратной оболочке мембраны.
Предложена динамическая модель функционирования канала, образованного пептидом Trichogin GA IV в липидной мембране. Понимание принципов и механизмов воздействия антимикробных пептидов на мембраны важно в связи с разработкой применения данного класса веществ в качестве новых лекарственных препаратов.
Положения, выносимые на защиту
-
Модель маятниковых движений липидов, соответствующая процессу -релаксации в биологической мембране.
-
Метод исследования движений дейтерированных атомных фрагментов и молекул вблизи спиновой метки.
-
Корреляция между движением молекул воды в гидратной оболочке модельных мембран и движением липидов мембраны вблизи температуры динамического перехода.
-
Динамическая модель функционирования пептида-антибиотика Trichogin GA IV в липидной мембране.
Личный вклад соискателя
Все экспериментальные данные были получены лично соискателем. Автор участвовал в постановке задачи, получении и обсуждении результатов, принимал участие в подготовке публикаций по теме диссертационной работы.
Апробация работы
Результаты работы были представлены и обсуждались на следующих конференциях и симпозиумах: School for young scientists «Magnetic Resonance in chemical and biological physics» (Новосибирск, Россия, 2010), Asia Pacific EPR-ESR Symposium (о. Чеджу, Южная Корея, 2010), Всероссийская конференция с международным участием «Спектроскопия и томография электронного парамагнитного резонанса в химии и биологии» (Москва, Россия, 2011), VIII International Voevodsky Conference (Новосибирск, Россия, 2012), Asia-Pacific EPR/ESR Symposium (Иркутск, Россия, 2016), Xth EFEPR Conference (Турин, Италия, 2016).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 4 статьи в рецензируемых журналах из списка рекомендованных ВАК и 6 тезисов докладов конференций.
Структура и объем диссертации
Работа состоит из введения, семи глав, заключения и списка цитируемой литературы, состоящего из 134 наименований. Работа изложена на 88 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка и 3 таблицы.
Молекулярная организация и подвижность в модельных биологических мембранах
В случае, когда устранение несовпадения параметров пептида и мембраны путем изменения липидного окружения требует значительных энергетических затрат, изменить свою конформацию (локализацию) может сам пептид/белок. Так, один и тот же пептид в различных мембранах меняет угол наклона к поверхности липида: могут наблюдаться предельные ориентации – планарная и трансмембранная, а также пограничные. В случае значительного несовпадения размеров (небольшой пептид и «толстая» мембрана, несовпадение 1 нм) молекулы пептидов могут даже не встраиваться в липидный бислой. Возможно и изменение конформации пептида (изменение длины, шага и диаметра пептидной спирали), для встраивания в необходимое окружение – так проявляется полиморфизм пептидов (7). Если у цилиндрической молекулы пептида (белка) одна сторона гидрофобна, а противоположная – гидрофильна, то в мембране такие молекулы агрегируют, компенсируя гидрофильные области внутри бислоя. Такая агрегация может способствовать функционированию канала (когда необходимо образование специфической структуры) и часто наблюдается при формировании пор небольшими пептидами – аламетицин, грамицидин и другие (1). Для белков агрегация доменов необходима для их взаимодействия и функционирования. Изменение липидного состава мембраны влияет не только на локализацию молекул пептида в бислое (вследствие изменения гидрофобного несовпадения), но может изменить равновесие между агрегатами и мономерами пептида в мембране (20), (21).
Возрастающая устойчивость бактерий к антибиотикам приводит к необходимости поиска новых лекарственных препаратов (доклад ВОЗ 2014 г.). Антимикробные пептиды оказывают мембранно-модифицирующее воздействие на бактериальные клетки, поэтому выработать устойчивость к ним практически не возможно. Понимание процессов дестабилизации мембраны основано на изучении самоассоциации и локализации молекул пептида в мембране, характера липид-пептидных взаимодействий и изменения липид-липидных взаимодействий. Задача об организации и механизме действия ионных каналов (или пор) решена полностью лишь для нескольких пептидов (1). В настоящее время для пептидов предложено несколько моделей обр азования каналов или пор в мембранах: описано связывание молекул пептида с липидным бислоем, обуславливающее нарушение его структуры и/или транспорта полярных молекул. Все предложенные модели функционирования пептидов условно «статические», то есть, условие движения молекул пептидов не является необходимым для нарушения функционирования мембраны. Помимо влияния липид-липидных и липид-белковых взаимодействий, на подвижность липидов в мембране, существенное влияние оказывает и ближайшая гидратная оболочка бислоя (соотношение между ближайшей гидратной и объемной водой зависит от уровня гидратации h). Подвижность биомакромолекул (белков, мембран и др.) подавлена при низком уровне гидратации h 0.2: фазовые переходы сдвигаются в область высоки х температур, а времена корреляции движения увеличиваются (22), (23). Повышение h до 0.3 приводит к появлению движений остова гидратируемой биомолекулы, увеличивается подвижность молекул воды в ближайшем окружении молекулы (24), (25), (26). При h=0.4 в биомакромолекулах наблюдают динамический переход: по данным нейтронного рассеяния и Мессбауэровской спектроскопии, среднеквадратичное смещение атомов относительно положения равновесия - x2 в области низких температур возрастает линейно с повышением температуры. Это свидетельствует об ограниченном движении атом относительно положения равновесия (колебания или вращения). Выше некоторой критической температуры (170-230 К, зависит от типа биомолекулы), наблюдается резкое увеличение x2 , что интерпретируется как диффузионное движение. Однако результаты экспериментов НР и МС скорее содержат в себе «соотношение неопределенностей» – можно охарактеризовать время корреляции наблюдаемого движения, но выделить модель движения не всегда удается (27). Интерпретация данных экспериментов НР часто осложнена наличием метильных групп в составе молекулы. Известно, что вращение метильных групп размораживается вблизи 100-160 К, поэтому эффекты увеличения величины x2 в данном температурном диапазон относят именно к вращению метильных групп, а не изменению подвижности самой биомолекулы (28), (29).
Для биологических молекул наблюдается корреляция движения в биомолекуле и ее ближайшей гидратной оболочке – близки как температуры динамического перехода, так и характер поведения x2 , однако, для некоторых систем они могут отличаться (29), (30), (31). Взаимосвязь движения гидратной воды и биомолекул наблюдают и в экспериментах ДС: при низких температурах зависимость времени корреляции движения для гидратированной молекулы и воды имеют аррениусовскую зависимость - -релаксационный процесс, а с превышением некоторой критической температуры переходит в супер аррениусовскую зависимость - -процесс (32). Однако, характер температурной зависимости (то есть, тип наблюдаемого релаксационного процесса) существенно зависит от структуры исследуемой системы (липидная мембрана или гидратированная молекула ДНК, белка) и уровня ее гидратации (33). Возможность определения характера движений в данном методе исследования, как и в методах НР и МС, ограничена. Схожее поведение температурной зависимости вязкости и -процесса позволяет отнести низкочастотную релаксацию к коллективному движению молекул – течению вязкой жидкости. Природа высокочастотного -процесса до конца не установлена, но полагается, что он характерен для локальных движений молекул, возможно, -гетерогенной подвижности системы (34).
Выделение механизма подвижности молекул ниже и выше температур динамического перехода, а также в различных релаксационных процессах, возможно при использовании методов, чувствительным к характеру движения молекул. Наиболее распространенные методы – спектроскопии ЯМР и ЭПР, методы молекулярной динамики. Сравнение результатов ДС с данными ЯМР и МД по подвижности липидных мембран показали, что при высоком уровне гидратации -процесс для полярной области липидов по характеру температурной зависимости времен корреляции движения близок к вращению липидных полярных головок (35). Для неупорядоченных сред – стеклующиеся смеси воды с криопротекторами, динамическое поведение молекул воды ниже температуры стеклования описывалось -процессом, механизм которого, согласно данным ЯМР – ограниченное скачковое вращение (36). Подобные исследования и сравнения проводят и для гидратированных биомолекул – белков и ДНК (37). Однако, в условиях наблюдения динамического перехода (уровень гидратации h 0.4), в ЯМР исследованиях наблюдается гетерогенность движения молекул воды – подвижности ближайшей гидратной и объемной воды существенно различаются. Выделение движений только гидратной воды оказалось не простой задачей, и лишь в 2016 году при исследовании подвижности бычьего сывороточного альбумина это удалось сделать (25).
Динамический переход наблюдают в водорастворимых белках и молекулах ДНК (29), (37), (38), в биомембранах (28), (29), (36), а также и в гидратной оболочке биомолекул (29), (39). Появление специфических движений биомолекул (и связанное с ними изменение активности молекул) побуждает к активному исследованию причин динамического перехода и характера изменения молекулярного движения. Для понимания природы динамического перехода необходимы знания, как о подвижности отдельных составляющих биологических молекул, так и о взаимосвязи подвижности ее составляющих. В связи с этим, основной экспериментальной задачей является исследование подвижности биомолекул с максимально возможного ракурса: развитие и использование различных методов исследования биомолекул с различной структурой и окружением.
Теоретическое описание импульсных экспериментов ЭПР
Рассмотрим влияние ядерного квадрупольного взаимодействия в наиболее распространенной ситуации изотопного замещения: Н (1=1/2, квадрупольный момент ядра равен нулю)2Н (1=1, константа квадрупольной связи e2qQ/h 0.2 МГц (73), (74)). Во временной области влияние ЯКВ проявляется в изменении амплитуды, фазы и частоты модуляции, скорости затухания различных гармоник (75), (76). В частотном спектре это проявляется в зависимости формы линии модуляционных гармоник от величин электрон-ядерного диполь-дипольного и ядерного квадрупольного взаимодействий, а также взаимной ориентации тензоров СТВ и ЯКВ.
Движение ядер приводит к модуляции СТВ с неспаренным электроном и изменению градиента электрического поля на квадрупольном ядре, что в свою очередь приведет к изменению формы линии спектров ESEEM [6], [7]. Наиболее просто из экспериментальных данных извлечь информацию о движении ядер из анализа изменения ЯКВ, так как оно определяется геометрией дейтерированого фрагмента и характером его движения (77). Для получения спектра в отсутствие движений необходимо провести усреднение по всем возможным ориентациям в в выражении [6]. Это даст Пейковский дублет, характеризующийся анизотропией тензора ЯКВ. Такой спектр, полученный в эксперименте ESEEM, аналогичен спектру 2Н ЯМР для пространственно некоррелированных систем (зависимость от угла ці вырождается и в =в). В случае коррелированного расположения магнитных ядер относительно спинового зонда/метки, в расчетах необходимо учитывать угол у/ между осями аксиальной симметрии тензоров СТВ и ЯКВ (78), (79). Для ядер дейтерия времена корреляции молекулярных движений определяются обратной величиной характерного расщепления в спектре тс fe2qQ h 10-5с, а модель движений может быть получена из характера изменения формы линии (77), (80), (81), (82). В случае простой системы внутримолекулярную динамику удается описать в рамках теории обмена атома по фиксированным положениям: задают геометрию молекулы (фрагмента молекулы), исходя из которой, рассчитывают резонансные частоты отдельных атомов щ. Далее, используя теорию химического обмена, зная время корреляции движения тс и cot , достаточно легко рассчитать изменения спектров за счет движения.
Времена электронной и ядерной спин-решеточной релаксации существенно отличаются, поэтому спектры ESEEM имеют гораздо меньшее разрешение (то есть, ширина индивидуальных линий больше), чем спектры твердотельного 2Н ЯМР. В связи с этим детали анизотропного движения или динамика молекул со сложной геометрией зачастую может быть лишь качественно описана в эксперименте ESEEM. Для описания динамического состояния сложных молекул можно считать, что движения частично (или полностью) усредняют ядерное квадрупольное взаимодействие; это приводит к возможности использования усредненной -эффективной константы ЯКВ для описания формы линии спектров. При таком предположении считается, что движения происходят за времена меньшие, чем обратная константа ЯКВ.
Не смотря на низкое разрешение спектров ESEEM, у данного метода есть преимущество - амплитуда модуляционных эффектов пропорциональна величине диполь-дипольного взаимодействия (следует из [8]). Для ядер дейтерия существенный вклад в форму линии ESEEM будут давать только те ядра, которые расположенные не далее 1 нм от места локализации неспаренного электрона - фактически это пространственная ограниченность метода (83). Это является преимуществом метода ESEEM перед методами ЯМР или НР, наиболее часто используемыми для наблюдения динамики окружения гидратируемых/сольватируемых молекул. Данные методы содержат информации о подвижности всех ядер (2Н и 1Н соответственно), поэтому для наблюдения движений ближайшей гидратной воды используют низкие уровни гидратации, что в свою очередь приводит к подавлению динамики биомолекул.
В системах, где величины диполь-дипольного и квадрупольных взаимодействий сравнимы («ближние» ядра - e2qQ/h A± , ге_7 0.2-0.4 нм (83)), интерференция данных взаимодействий может значительно усложнять форму линии спектров ESEEM. В таком случае полезным оказывается сравнительный анализ основных - са± и комбинационных ((со+ ±а _) и др.) гармоник: из [6] следует, что форма линии комбинационной гармоники (а + +а _) зависит преимущественно от ЯКВ, зависимость от СТВ - во втором порядке и данная величина лишь сдвигает ее от удвоенной Зеемановской частоты (84). С целью повышения спектрального разрешения комбинационных гармоник используют трех- и четырех- импульсные эксперименты ESEEM: двумерный - Hyperfine Sublevel Correlation – HYSCORE, его упрощенный одномерный четырех-импульсный вариант (85) (86), (87). Проявление молекулярных движений в спаде сигнала электронного спинового эха Амплитуда сигнала стимулированного ЭСЭ описывается выражением (88): 2т T -i Aco(t)dt + i JAco(t)dt \ , [9] Гехр .2 M, V(r,T) = exp V о Г+г где z/ft - флуктуации гамильтониана вследствие ориентационных движений спиновой метки, а угловые скобки означают усреднение по всем реализациям процесса Аса. Кинетика спада сигнала эха зависит от конкретного процесса изменения частоты (спектральной диффузии). В Таблице 2.1 представлены результаты расчета кинетики спада сигнала эха для различных моделей спектральной диффузии в области медленных и быстрых процессов (64), (66), (69), (89), (90).
Для процессов быстрой спектральной диффузии (время корреляции движения тс«Т, т) случайные изменения частоты в течение временных интервалов (0, т) и (т+Т, 2т+Т) становятся независимыми, поэтому спад сигнала эха не зависит от времени Т и будет линеен по времени т для любой модели движения. В случае медленной спектральной диффузии (тс«Т, т) скорость спада значительно зависит от модели движения: в показателе экспоненты могут возникнуть перекрестные слагаемые, отражающие корреляцию изменения резонансной частоты во временных интервалах (0, т), (т, т+Т) и (т+Т, 2т+Т). Так изменение частоты в спектре (следовательно, скорости движения спиновой метки) при обмене в спектре по двум положениям будет линейно по временам т и Г, однако на временах Т»т спад сигнала эха не должен иметь зависимости от времени т. Случаи ограниченного гауссового и лоренцева контуров приведут к одинаковой насыщающейся зависимости от времени Т, но будут различаться по характеру зависимости от времени т. Модели, которые не ограничивают контур изменения резонансной частоты, имеют линейную зависимость скорости анизотропной релаксации от времени Т, однако при диффузии спиновой метки в угловом пространстве спад сигнала эха пропорционален ехр(-Ат2), а в случае неограниченных вращений спиновой метки - имеет линейную зависимость от т (при условии Т»т) в показателе экспоненты. Таким образом, двумерный анализ кинетики спада в экспериментах стимулированного спинового эха позволяет выделить модель спектральной диффузии, а в случае медленных движений определить параметры движения (коэффициент вращательной диффузии, угловую скорость).
Обсуждение результатов
В случае отсутствия переноса насыщения по спектру ЭПР, инвертированная намагниченность стремится восстановиться за счет спин-решеточной релаксации, поэтому в спрямленных координатах кривая инверсии-восстановления имеет линейную зависимость (угол наклона которой равен 7;-1). Отклонение от линейной зависимости на начальном участке связано с перераспределением насыщения как внутри, так и между компонентами СТС. Перенос намагниченности между компонентами СТС происходит за счет изменения проекции спина ядра азота и последующим восстановлением к равновесному значению (эксперимент ПН). Для кинетических кривых передачи насыщения по спектру при временах Т 100 мкс можно отметить минимум, который характеризуется своей величиной (эффектом переноса намагниченности между компонентами СТС) и временем (за которое происходит переворот спина ядра азота). В случаях отсутствия переноса намагниченности между компонентами СТС, отклонение на начальных участках кривых ПН могут быть связаны с частичным возбуждением спинов на частоте регистрации импульсом накачки (в частотной области возбуждающий импульс имеет «крылья», которые поворачивают намагниченность не только в центральной, но и в других компонентах спектра). При данных экспериментальных условиях эффекты «перекрытия» импульсом накачки и наблюдения в частотной области не превышают 10%.
Поскольку после действия инвертирующего импульса намагниченность стремится равномерно разойтись по всему спектру ЭПР, кинетические кривые инверсии-восстановления и переноса намагниченности должны сходиться к одной асимптотической кривой (полная сходимость кинетических кривых). Различные степени сходимости кинетических кривых могут означать широкое распределение по временам корреляции. Может оказаться так, что для части спиновых меток время корреляции движения тс гораздо больше, чем время спин-решеточной релаксации - они не дадут вклад в эффекты передачи насыщения, в то время как другая доля спин-меченых молекул принимает участие в структурной релаксации и «переносит» намагниченность по спектру. В таком случае в эксперименте будет наблюдаться частичная сходимость кинетических кривых ИВ и ПН.
Релаксация магнитного ядра и связанные с ним процессы переноса намагниченности между компонентами СТС могут происходить по механизмам спин-спинового взаимодействия: ядерное диполь-дипольное взаимодействие, влияние флип-флоп переворотов протонов, кросс-релаксация спина ядра азота через электронный спин. Однако эти процессы приводят лишь к небольшому сдвигу локального поля на ядре, которого недостаточно, чтобы происходило изменение оси его квантования (97).
Единственным объяснением эффекта переноса насыщения как внутри, так и между компонентами сверхтонкой структуры спектра ЭПР является ориентационное движение радикала. Движение радикала должно происходить быстрее, чем релаксация ядерной подсистемы, иначе ядро успеет адиабатически подстроиться под новое магнитное окружение и эффект переквантования не проявится. Модель мгновенных скачков на большие углы ( /3) хорошо описывала кинетики восстановления провала и миграцию насыщения по спектру ЭПР, поэтому в данной главе была выбрана данная модель вращательного движения (34). Для оценки времени вращательной подвижности было использовано время R – такое значение, при котором кривые ИВ и ПН сходятся на одну логарифмическую единицу. Такой способ определения времени вращательной подвижности дает погрешность не более 100% от истинного значения для различных моделей движения (54).
Эффекты переноса насыщения в дегидратированных образцах незначительны при всех исследованных температурах, кинетические кривые ИВ и ПН сходятся частично и лишь температурах выше 180 К. Частичная подвижность спин-меченых липидов в дегидратированных образцах может быть связана с неполной дегидратацией, так как удалить воду, водородносвязанную с полярными головками липидов, сложно. Это может привести к возможности движений липидов с временами корреляции движения c Т1, что приводит к малым эффектам переноса намагниченности в дегидратированных образцах. Данные ДС и ДСК свидетельствуют о замедлении релаксационных процессов в мембране при понижении h: быстрый и локальный -процесс, наблюдаемый для полярных головок липидов, при h 0.75 переходит в коллективный, но медленный -процесс c 10-3 c (8), (23), (35).
В гидратированном липиде значительные эффекты переноса намагниченности 10-15% наблюдались при температурах выше 120 К. Наличие холестерина в составе фосфолипидной мембраны не единообразно влияет на вращательную подвижность спин-меченых липидов: для спин-метки в полярной головке движения подавлены; при погружении в бислой приблизительно на треть наблюдается неоднородное движение - часть молекул совершает движения, а часть молекул не движется (спин-метка в 5-ом положении алкильной цепи липида); а в глубине мембраны (10-ое положение углерода) и амплитуда и скорость движений спин-меток возрастает (см. Рисунок 4.4). Под отсутствием движений здесь следует понимать не полную неподвижность молекулы, а как и в случае дегидратированного образца – движения спин-меченого липида становятся настолько медленными, что не проявляют себя в экспериментах по переносу насыщения. Неравномерные по глубине мембраны эффекты влияния холестерина на подвижность липидов в различных положениях алкильной цепи объясняются локализацией стерина в бислое. Известно, что жесткое ядро расположено от полярной головки до приблизительно 7-10го положения углерода, а гидрофобный хвост заглублен в мембрану (1), таким образом, в полярной области холестерин «сжимает» мембрану и снижает подвижность липидов, а в глубине - усиливает. В мембранах одного липидного состава для различных спин-меченых липидов скорости вращательной подвижности отличаются, причем вблизи поверхности мембраны амплитуда движений несколько меньше, чем в глубине мембраны. Это позволяет предположить, что методом переноса насыщения наблюдаются маятниковые движения липидов в мембране: в полярной области головки молекул липида «зажаты», а в области неполярных хвостов имеется бльшая свобода движения (схематически движение изображено на Рисунке 4.5).
Частичная подвижности меток в 5-ом положении в холестеринсодержащей мембране может быть связана с образованием неоднородности в латеральной упаковке липидов (98), (99). Вероятно, часть спин-меченых липидов попадают в более плотные области, где медленные движения подавлены, а другая часть – в локально разрыхленные области, где подвижность липидов выше. липидная мембрана без холестерина холестеринсодержащая мембрана
Аналогичные неоднородные эффекты влияния холестерина на миллисекундные неограниченные вращения липидов ранее были обнаружены методом ЭСЭ и объяснены как конденсирующий и «антиконденсирующий» эффекты холестерина (15), (62). Необходимо отметить, что для метки в 5-ом положении было установлено полное подавление медленных вращений. Это не противоречит полученным результатам - методы ЭСЭ и переноса насыщения позволяют изучать движения на различные углы и с различными временами корреляции, поэтому они расширяют информацию о динамике молекул в исследуемой системе.
Скорость движения спин-меченых липидов при температурах 150-225 К лежит в диапазоне 105-106 Гц (Рисунок 4.4). По данным метода переноса насыщения по спектру ЭПР, время корреляции вращения липидов в мембране, меченых в полярной головке, близка к временам -релаксационного движения полярных головок липидов в мембранах (см. Рисунок 4.4). В модельных мембранах размораживание вращений полярных головок, соответствующее локальному -процессу, происходит при 170 К (23), (35).
Исследование подвижности спин-меченого пептида Trichogin GA IV по данным стимулированного электронного спинового эха
Вращение метильных групп хорошо изучено в биомакромолекулах (106), (107), полимерах (108), (109), небольших молекулах, адсорбированных в порах (81), (ПО). Для всех изученных систем температурная зависимость константы скорости молекулярного движения описывалась законом Аррениуса с предэкспоненциальным фактором к0 10п-1012 с"1. Энергия активации значительно зависела от размера исследуемой молекулы, места положения метильной группы в молекуле, окружения. Так как целью данной работы является качественный результат - показать возможность наблюдения молекулярных движений методом ESEEM, механизм движения метильных групп полностью установлен не был (например, имеется ли корреляция движения соседних метильных групп у общего атома углерода и др.).
Однако для этой системы изменение формы линии спектров ESEEM можно удовлетворительно описать в рамках модели прыжков по фиксированным положениям. Предполагается, что ядра метильных групп находятся во внешнем потенциале с несколькими локальными минимумами. В таких потенциальных ямах молекула находится в течение времени тс, а затем совершают мгновенный перескок из одного фиксированного положения в другое. В простых системах можно моделировать спектр ЯКР, предполагая модель обмена по нескольким положениям, зная геометрию молекулы (подробно описано в (77), (80), (81)). В рамках такой модели при температурах ниже 90 К метильные группы неподвижны, выше 110 К - находятся в пределе быстрого движения по шкале ЯКР, где скорость вращения сравнима с обратной величиной константы квадрупольного расщепления с, а 100-110 К - переходная область (коалесценция). В области коалесценции энергию активации движения можно оценить из закона Аррениуса: к = к0 exp{-Eact IRT), асГ 13.8±1.1) кДж/моль. Вращение метильных групп наблюдали методом модуляции сигнала ЭСЭ (111), где энергия активации вращения была асГ(8.7±0.4) кДж/моль. Различия в энергии активации связаны с различной структурой нитроксильных радикалов (например, для радикала TEMPON Eact (9А±0Л) (112)), а также влиянием изотопного замещения - в дейтерированном фрагменте энергия активации выше приблизительно на 6.6 кДж/моль (113).
Применение метода ESEEM на примере вращения метильных групп продемонстрировало не только возможность применения данного метода для качественного описания движения, но и позволило определить энергию активации движения. Стекло орто-терфенила
В качестве ещё одной модельной системы был выбран комплементарно изотопно замещённый образец - протонированный нитроксильный радикал в дейтерированной матрице орто-терфенила. В частотной области расщепление линии на Ларморовской частоте прецессии ядер дейтерия хорошо разрешено не только в 4-х импульсном, но и в 3-х импульсном эксперименте - для сравнения на Рисунке 5.4 представлены спектры при 250 К. Величина расщепления ё составляет 0.119±0.005 МГц, что соответствует константе ЯКВ 0.202±0.011 МГц и близко к значению величины квадрупольного расщепления в молекуле бензола-й? 5 - 0.193 МГц (114). Отчетливо наблюдаемые сингулярности в 3-х импульсных спектрах во всем исследованном температурном диапазоне, совпадение расщепления спектров ё в 3-х и 4-х импульсном экспериментах, и близость экспериментально полученной константы ЯКВ к литературным данным свидетельствуют о незначительном вкладе СТВ в расщепление д. Однако, могут оказаться и очень близкие ядра дейтерия к спиновой метке (иногда -водородносвязанные). Вклад от таких ядер мал из-за их малого количества, а проявляется он в виде широкой подложки, но не в расщепление , так как СТВ с такими ядрами больше, чем ЯКВ (83). Температурные изменения формы линии подложки оказались незначительны.
Не простая геометрия молекулы орто-терфенила усложняет моделирование молекулярных движений - в застеклованном состоянии для молекул орто-терфенила наблюдали быстрые ограниченные колебания бензольных колец (115), -релаксацию ниже Tg (116), ограниченные движения с временами корреляции тс 10"7 с (64), (117), (118). Многие такие эффекты движения при наличии большого количества ядер и слабого разрешения в спектрах ESEEM (по сравнению с ЯМР) будут не видны. В данном случае подвижность молекул орто-терфенила можно охарактеризовать только быстрыми ограниченными движениями, которые приводят к частичному усреднению величины ядерного квадрупольного взаимодействия. При таком предположении считается, что движения должны происходить за времена меньшие, чем обратная константа ЯКВ ю-5 с, в таком случае движение эффективно усредняет ядерное квадрупольное взаимодействие. На Рисунке 5.5 показана температурная зависимость расщепления ё. С приближением к температуре стеклования величина ё уменьшатся, что указывает на увеличение подвижности молекул орто-терфенила. Данный результат согласуется с литературными данными о подвижности молекул орто-терфенила, однако не уточняет молекулярного механизма движений