Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 10
1.1. Физические основы метода. Ионизация. 10
1.1.1. Каскад соударений 11
1.1.2. Кластерные ионные источники 12
1.1.3. Матричный эффект 13
1.2. Устройство TOF-SIMS масс-спектрометра 14
1.2.1. Источник первичных ионов 14
1.2.2. Настройка параметров ионной пушки 15
1.2.3. Времяпролетный масс-анализатор. 16
1.2.4. Компенсация заряда 19
1.2.5. Профилирование по глубине 19
1.3. Получение и обработка ионных изображений 20
1.3.1. Инструментальная реализация 22
1.3.2. Статический предел SIMS 23
1.3.3. Пространственное разрешение и время анализа
1.4. Возможности метода при анализе различных классов органических соединений 25
1.5. Сравнение TOF-SIMS с другими методами масс-спектрометрии 26
1.5. Приготовление образцов 27
1.5.1. Криофиксация 28
1.5.2. Лиофилизация 28
1.5.3. Замораживание-травление 29
1.5.4. Анализ в замороженном состоянии 29
1.5.5. Замораживание-скалывание 30
1.5.6. Сравнение различных методов
1.6. Анализ модельных систем 30
1.7. Анализ тканей 31
1.8. Анализ бактерий и их сообществ 34
1.9. Анализ культур клеток 35
1.10. Усиление выхода вторичных ионов 38
1.10.1. Постионизация 38
1.10.2. Нанесение матрицы 38
1.10.3. Напыление металлов 39
1.10.4. Нанесение наночастиц 39
Глава 2. Экспериментальные методы 40
2.1. Времяпролетная масс-спектрометрия вторичных ионов 40
2.1.1. Жидкометаллическая ионная пушка 40
2.1.2. Дополнительная пушка для травления 41
2.1.3. Электронная пушка 41
2.1.4. Времяпролетный масс-анализатор и детектор 42
2.1.5. Вакуумная система 42
2.2. Пробоподготовка биологических и модельныхобразцов 42
2.2.1. Культивирование и химическая фиксация клеток глиобластомы 42
2.2.2. Химическая фиксация седалищных нервов травяной лягушки Rana temporaria 43
2.2.3. Криофиксация и секционирование ооцитов мыши 43
2.2.4. Приготовление упорядоченных липидных пленок методом Ленгмюра-Блоджетт 44
2.2.5. Приготовление неупорядоченных липидных пленок 44
2.3. Синтез наночастиц 45
2.3.1. Au тип I 45
2.3.2. Au тип II 45
2.3.3. Ag тип I 45
2.3.4. Ag тип II 2.3.6. Pb 46
2.3.7. Au/TiO2 46
2.3.8. SiO2 и Au/SiO2 (наночастицы типа ядро-оболочка) 46
2.3.9. Приготовление модельного образца 47
Глава 3 . Оценка параметров метода и его применимости для анализа биологических образцов 48
3.1. Оценка эффективности ионизации первичных ионов. Подбор оптимальных настроек
для различных типовых сценариев работы. Оценка погрешностей метода. 48
3.1.1. Оценка эффективности ионизации первичных ионов 48
3.1.2. Оценка погрешностей измерений выхода вторичных ионов 54
3.1.3. Фрагментация молекулярных ионов 56
3.2. Оценка влияния различных факторов на выход вторичных ионов. Количественный анализ 58
3.2.1. Оценка влияния параметров компенсации заряда 58
3.2.2. Влияние подложки на выход вторичных ионов 59
3.2.3. Усиление сигнала различными наночастицами 61
3.2.4. Построение концентрационной зависимости для модельных систем 67
3.2.5. Оценка изменений липидного состава в миелиновых мембранах, вызванных добавлением АТФ. Сравнительный количественный анализ 68
Глава 4. Определение морфологии и химического состава биологических тканей и клеток
4.1. Визуализация распределения вторичных ионов в реальных биологических образцах. 3D-анализ 72
4.1.1. Процедура ионного травления 72
4.1.2. Визуализация распределения цисплатина в клетках глиобластомы 74
4.1.3. Визуализация распределения серебра в клетках цианобактерий Anabaena sp PCC 7120 82
4.1.4. Исследование распределения A2E и окисленных форм A2E в липофусциновых гранулах 83
4.2. Разработка метода визуализации морфологии и состава одиночных клеток на примере GV-ооцитов млекопитающих 87
4.2.1. Протокол метода 88
4.2.2. Оптическая микроскопия ооцитов 88
4.2.3. Рельеф полученных препаратов и оценка его влияния на выход вторичных ионов 91
4.2.4. Сопоставление химического состава и структур ооцитов 94
4.2.5. Полезное пространственное разрешение 97
Основные результаты и выводы 100
Список используемых сокращений 101
Список литературы 102
- Матричный эффект
- Жидкометаллическая ионная пушка
- Оценка влияния различных факторов на выход вторичных ионов. Количественный анализ
- Разработка метода визуализации морфологии и состава одиночных клеток на примере GV-ооцитов млекопитающих
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Разработка химико-физических основ методов масс-спектрометрии, позволяющих определять молекулярный состав и локализацию биохимических компонент в биологических объектах, предоставляет возможность получить новые фундаментальные знания о живой природе. Внедрение и использование таких методов актуально для исследований в области прикладной медицины как для изучения патогенеза, так и в диагностике социально значимых заболеваний: таких как онкологические, нейродегенеративные и различные наследственные заболевания. Для решения подобных задач перспективным является метод времяпролетной масс-спектрометрии вторичных ионов (TOF-SIMS) - чувствительный аналитический метод для исследования поверхности. Достоинство TOF-SIMS состоит в возможности проведения экспресс-анализа широкого ряда органических молекул при субмикронном (до 80 нм) пространственном разрешении на исследуемой поверхности. Кроме этого, метод теоретически обеспечивает разрешение по глубине анализа до 10 нм (зависит от свойств исследуемого объекта). Сочетание таких характеристик позволяет определять состав и распределение биологических молекул в отдельных органеллах клетки, получать 3D изображение распределения химического состава объекта. Таким образом, TOF-SIMS можно использовать как своеобразный масс-спектрометрический микроскоп для получения 2D и 3D ионных изображений.
Поскольку выход вторичных ионов пропорционален площади фокуса, то улучшение
пространственного разрешения приводит к сужению диапазона эффективно
детектируемых ионов. Иными словами, для получения оптимальных результатов необходимо найти баланс между разрешением и исследуемым диапазоном масс. Кроме этого, выход вторичных ионов существенно зависит от типа используемых первичных ионов (масса, заряд, энергия иона). Важным ограничением метода TOF-SIMS, как и других методов, использующих бомбардировку частицами, является необходимость использования методик подготовки образца, характерных для проведения анализа в вакууме. Реализации потенциальных возможностей TOF-SIMS должно предшествовать решение проблем, связанных с особенностями биологических клеток и мягких тканей. Существенное значение здесь имеют: цель исследования, пробоподготовка образца и выбор параметров его бомбардировки. Вследствие небольшого разрешения метода по глубине (~ 10 нм) TOF-SIMS позволяет исследовать только наружную поверхность объекта. Поэтому актуальность данной диссертации определяется тем, что в работе разрабатываются методы 2D и 3D картирования биохимического состава клетки/ткани в сочетании с визуализацией морфологии методами зондовой оптической и электронной
микроскопии. Также на модельных и реальных биологических объектах демонстрируются возможности TOF-SIMS в морфобиохимическом анализе с использованием в качестве источника ионизации кластеров висмута и ионов атомарного висмута. Кроме этого, в диссертации развиваются ранее известные и предлагаются новые методы подготовки биологических образцов для TOF-SIMS анализа.
Цели и задачи исследования. Работа направлена на решение фундаментальной междисциплинарной проблемы химической физики, биологии и аналитической химии – проблемы визуализации биологических клеток/тканей и 2D и 3D картирования биохимического состава клетки/ткани. Для достижения данной цели были решены следующие задачи:
-
Определение эффективности ионизации и выхода вторичных ионов при бомбардировке первичными ионами кластеров Bi3+, ионами Bi3++ и одноатомными ионами Bi+ биологических объектов различных типов (липидные пленки, клетки глиобластомы, цианобактерии, седалищные нервы лягушки Rana temporaria). Определение эффективного латерального пространственного разрешения при масс-спектрометрическом картировании биологического образца этими ионами.
-
Разработка метода усиления выхода целевого сигнала вторичных ионов для модельных объектов – неупорядоченных липидных пленок.
-
Разработка методов 2D и 3D визуализации целевых ионов в модельных объектах таких как неупорядоченные липидные пленки и липидные пленки Ленгмюра-Блоджетт, а также в биологических системах - липофусциновые гранулы сетчатки глаза, седалищные нервы лягушки Rana temporaria, цианобактерии Anabaena, в раковых клетках глиобластомы, ооцитах млекопитающих на стадии зародышевого пузырька (GV).
Научная новизна. Для различных биологических объектов (липидные пленки,
клетки глиобластомы, цианобактерии, седалищные нервы лягушки Rana temporaria)
разработаны методики спектроскопического TOF-SIMS анализа и масс-
спектрометрического картирования объекта. Показано, что кластерные ионы Bi3+ обеспечивают наилучшую эффективность ионизации и являются оптимальным выбором для анализа в широком диапазоне значений зондируемой площади объекта. Ионы Bi3++ уступают в эффективности ионизации на 20-30%, и также могут быть использованы. Одноатомные ионы Bi+ обеспечивают выход ионов в 10-20 раз меньше, чем кластерные ионы, их применение для анализа биологических объектов не оправдано.
Обнаружен эффект усиления выхода молекулярного иона фосфолипида за счет структурирования поверхности слоем наночастиц. В ряду металлических Ag, Au, Pb,
полупроводниковых TiO2, диэлектрических SiO2 и гибридных Au/TiO2, Au/SiO2 типа ядро-оболочка наночастиц рассмотрено их влияние на сигнал вторичных молекулярных ионов за счет эффекта матрицы. На примере неупорядоченных липидных пленок, нанесенных на слой наночастиц, показано, что сигнал молекулярного иона фосфолипида может быть увеличен от 2 до 40 раз, в зависимости от типа наночастиц. Наибольшее усиление обеспечивали наночастицы с ядром SiO2 и оболочкой из золота.
Для 3D визуализации распределения целевых ионов развита методика ионного травления липофусциновых гранул сетчатки глаза, клеток цианобактерий Anabaena, участвующих в процессе биосинтеза наночастиц серебра, культуральных раковых клеток гиобластомы после действия фармакологического противоопухолевого препарата цисплатина. Показано, что флуорофор A2E, а также продукты его фотоокисления находятся внутри липофусциновых гранул. Доказано, что биосинтез наночастиц серебра происходит внутри клеток цианобактерий Anabaena. В клетках глиобластомы сигнал платины распределен достаточно равномерно, лишь в 1.5 раза выше в области ядра, чем в области цитоплазмы. Выявлено около 50 ионов липидов в мембране клетки глиобастомы.
Разработана новая методика пробоподготовки единичных биологических клеток для TOF-SIMS, сохраняющая состав и структуру образца, которая позволяет проводить параллельно измерения методами оптической, сканирующей электронной и атомно-силовой микроскопии для одного образца на одном держателе. Впервые получены ионные изображения ооцитов мыши в стадии зародышевого пузырька при параллельном исследовании морфологии поверхности.
Показано, что полезное разрешение при TOF-SIMS анализе среза ооцита в заливочной среде Epon в зависимости от интенсивности ионного пика лежит в пределах от 200 нм до 1-2 мкм. Для ионов PO3- полезное пространственное разрешение составляет 0.4 мкм. Данное полезное разрешение для ооцита в Epon позволяет выявить существенные детали структуры ооцита млекопитающих, характерный размер которого составляет около 80 мкм.
Теоретическая и практическая значимость работы. Практическая значимость
работы определяется возможностями TOF-SIMS для морфобиохимического анализа
клеток и тканей. Были доработаны существующие методики, а также разработан новый
подход, позволяющие проводить картирование состава различных биологических
объектов: тканей, культуральных и изолированных клеток, препаратов. Эти методы были
успешно использованы как для получения фундаментальных знаний о составе и структуре
биологических объектов (ооциты млекопитающих, липофусциновые гранулы,
цианобактерии, липидные мембраны клеток и тканей), так и для решения прикладных
медицинских задач (распределение лекарственного препарата цисплатина внутри клеток опухоли глиобластомы).
Методы исследования. В работе использован широкий круг физико-химических и аналитических методов исследования: времяпролетная масс-спектрометрия вторичных ионов, оптическая, атомно-силовая и сканирующая электронная микроскопия. Упорядоченные липидные пленки были приготовлены методом Ленгмюра-Блоджетт. Применялся набор методик, типичных для подготовки биологических образцов к анализу в вакууме: химическая фиксация, криофиксация, лиофилизация. Ряд ранее известных методов и протоколов был модифицирован для решения задач работы.
Положения, выносимые на защиту:
Определение эффективности ионизации и выхода вторичных ионов для биологических объектов различных типов (липидные пленки, клетки глиобластомы, седалищные нервы лягушки Rana temporaria) при ионизации первичными ионами кластеров Bi3+, ионами Ві3++ и одноатомными ионами Ві+. Нахождение полезного латерального пространственного разрешения при масс-спектрометрическом картировании биологического образца этими ионами.
Разработка метода усиления выхода целевого сигнала вторичных ионов для модельного образца - неупорядоченных липидных пленок с использованием наночастиц.
Разработка методов 2D и 3D визуализации целевых ионов в модельных объектах, таких как неупорядоченные липидные пленки и липидные пленки Ленгмюра-Блоджетт, а также в биологических системах: липофусциновые гранулы сетчатки глаза, седалищные нервы лягушки Rana temporaria, цианобактерии Anabaena, в раковых клетках глиобластомы.
Контроль изменения состава и 2D/3D визуализация целевых ионов: а) в липофусциновых гранулах сетчатки глаза, подвергнутых фотоокислению; б) количественные изменения липидного состава в седалищных нервах Rana temporaria под действием аденозинтрифосфата (АТФ) или аденозина, приводящие к изменению эластичности липидного бислоя; в) в клетках цианобактерий Anabaena после биогенеза наночастиц серебра; г) в раковых клетках глиобластомы после терапии цисплатином.
Новый метод подготовки единичных биологических клеток (GV ооцитов млекопитающих) для TOF-SIMS анализа, позволяющий сохранить состав и морфологию образца. Разработанный метод позволяет дополнить TOF-SIMS измерения группой других методов анализа (оптическая микроскопия, сканирующая
электронная микроскопия, атомно-силовая микроскопия) по принципу «один образец – один держатель».
Степень достоверности полученных результатов. Достоверность результатов определяется фактом применения современных аттестованных методов спектрального и физико-химического анализа. Разработанные методики измерений, использованные в работе, показали высокую воспроизводимость результатов.
Апробация результатов. Основные результаты исследований, представленные в
диссертации, докладывались и обсуждались на международных и российских научных
конференциях: 56-я научная конференция МФТИ «Современные проблемы
фундаментальных и прикладных наук», (Москва–Долгопрудный, 2013); VI Троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине» (ТКМФ-6), (Троицк, 2014); 57-я научная конференция МФТИ «Актуальные проблемы фундаментальных и прикладных наук в современном информационном обществе» (Москва–Долгопрудный, 2014); 19 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2015); 58-я научная конференция МФТИ «Актуальные проблемы фундаментальных и прикладных наук в современном информационном обществе» (Москва–Долгопрудный, 2015); 59-я научная конференция МФТИ «Актуальные проблемы фундаментальных и прикладных наук в современном информационном обществе» (Москва–Долгопрудный, 2016); VIII Всероссийская конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2016).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Работ, опубликованных в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК – 6.
Личный вклад автора. Результаты экспериментов, обсуждение полученных данных и выводы, представленные в работе, были сделаны либо автором, либо при его непосредственном участии. Все эксперименты TOF-SIMS, интерпретация результатов выполнены автором диссертации лично.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, формулировки основных результатов и выводов, списка сокращений и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 111 страницах, содержит 11 таблиц, 32 рисунка и библиографию из 149 наименований.
Матричный эффект
Считается, что при попадании первичного иона на поверхность образца, происходит упругое соударение, и атомы поверхностного слоя образца приходят в движение, сталкиваясь, в свою очередь, с другими покоящимися атомами. Первоначально распределение направлений движений атомов будет совпадать с направлением движения первичного иона, однако через некоторое количество соударений движение станет изотропным. Некоторые атомы могут достигнуть поверхности образца и покинуть его, если их энергия достаточно высока, чтобы преодолеть поверхностную энергию связи. Таким образом, примерно 95% частиц, выбитых с поверхности образца, приходят из первых трех слоев вещества [4]. При условиях, характерных для SIMS, время жизни каскада соударений составляет 10-11- 10-12 c. Большая часть ионов, представленных на масс-спектре имеет единичный заряд [5].
Частицы, выбитые с поверхности образца, могут быть атомами, фрагментами молекул, целыми молекулами или даже кластерами этих частиц, что соответствует другим методам масс-спектрометрии. Однако ввиду высокой энергии первичных ионов, близлежащие к поверхности молекулы сильно фрагментируются, что приводит к появлению на масс-спектрах интенсивных фрагментарных пиков.
Кластерными называются ионы, содержащие несколько и более атомов. Примерами кластерных ионов могут быть: SF5, C60, Aun, Bin (где n = 3, 5, 7). Использование многоатомных ионных источников позволяет значительно повысить выход вторичных ионов (число вторичных ионов на один первичный ион). Так при изменении первичного иона с Au+ на Au3+ при анализе органического полимера (Irganox 1010) увеличение выхода молекулярного иона составило 45 раз [6]. Ключевым моментом является тот факт, что усиление выхода ионов не связано с пропорциональным увеличением площади повреждаемой поверхности [6, 7].
Несколько факторов могут объяснить нелинейный эффект усиления. Так, при бомбардировке образца кластерными ионами, каскады соударений перекрываются, в результате возникают многочисленные нелинейные эффекты, которые приводят к увеличению эмиссии вторичных ионов различных органических и неорганических соединений [8]. Степень фрагментации молекул исследуемого образца также зависит от типа первичных ионов: чем больше масса кластера, тем меньше степень фрагментации [9]. Наибольшую фрагментацию обеспечивают одноатомные ионные источники: Ga+, Au+, Bi+.
Вторым фактором является способность кластерных ионов оставлять большую, по сравнению с одноатомными ионами, часть энергии в поверхностных слоях образца. Однако что именно можно считать поверхностными слоями? Исследования, проведенные для одноатомного ионного источника Cs+ на монослоях Ленгмюра, показали, что 90% вторичных ионов попадают на детектор с глубины 10 нм, а количеством ионов с глубины более 15-20 нм можно пренебречь [10]. В кластерных ионных источниках количество энергии на атом меньше, ниже и скорость кластера (при той же энергии). Следовательно, кластерные ионные источники передают больше энергии верхним слоям образца. На месте попадания первичного иона в образец образуется кратер. Размер кратера и глубина проникновения первичного иона зависят от массы первичного иона, его энергии и материала исследуемого образца. Так глубина проникновения одноатомного иона Bi+ c энергией 25 кэВ в тетраглимовой пленке составляет 26 нм, кластерного иона Bi3+ с той же энергией 14 нм, а иона C60+ c энергией 20 кэВ 3 нм [11]. Таким образом, более тяжелые кластерные источники (например, C60+) при той же энергии обеспечивают больший выход вторичных ионов, чем более легкие (Au3+ или Au4+) [12].
Наконец, есть результаты, указывающие на более эффективное протонирование (присоединение протона) первоначально нейтральных молекул при бомбардировке кластерными ионами [13, 14]. Накопление доступных протонов на поверхности образца объясняется различиями в механизмах разрыва связи при использовании многоатомных ионов по сравнению с одноатомными [13, 15].
Кластерные ионные источники можно разделить на две группы. Первая группа – это жидкометаллические ионные источники (LMIS). В LMIS используются металлы или сплавы с низкой температурой плавления. Наиболее распространенными кластерными ионами первого типа являются Aun+ и Bin+. Их главными достоинствами являются высокая интенсивность и субмикронное пространственное разрешение. Для неорганических образцов разрешение может достигать 25 нм, тогда как для органических оно ограничено 100-200 нм. Ко второму типу можно отнести неметаллические кластерные ионы: SF5+, C60+, Arn. Они обеспечивают гораздо больший выход вторичных ионов, но их пространственное разрешение ограничено: 30 мкм для кластеров аргона и 1-2 мкм для C60+ [1, 16].
Одним из главных недостатков, затрудняющим анализ TOF-SIMS масс-спектров, является так называемый матричный эффект. Дело в том, что механизм формирования конкретного вторичного иона зависит от его химического окружения и от структуры образца. Зарядка поверхности также влияет на выход вторичных ионов. Матричный эффект может быть причиной различий в количественном выходе одного и того же иона из-за разного химического окружения на несколько порядков [2]. Например, выход вторичных ионов Al+ из Al2O3 в 100 раз больше, чем из чистого металла. Матричный эффект нужно учитывать как при планировании эксперимента, так и при обработке данных. Точный механизм усиления или ослабления сигнала до конца непонятен, однако было показано, что протонирование играет важную роль в образовании [M+H]+ ионов[17]. Молекулы с большей реакционной способностью захватывают протон с большей вероятностью, тем самым подавляя сигнал [M+H]+ ионов с меньшей реакционной способностью. С другой стороны, некоторые молекулы могут при ионизации становиться источником протонов для других молекул, тем самым повышая их выход. Например, холестерин образует ион [M-H]+, усиливая сигнал [M+H]+ ионов [18], в частности фосфолипидов.
Одним из возможных методов борьбы с матричным эффектом является лазерная постионизация образца, поскольку подавляющее большинство атомов и молекул образца, выбитых с поверхности первичными ионами, не несут заряд, и, как следствие, не разгоняются электромагнитным полем и не достигают детектора. Поэтому постионизация должна минимизировать влияние химического окружения. Модельные эксперименты подтвердили перспективность такого подхода: выход фрагментарного иона атропина в двух разных матрицах после проведения процедуры постионизации отличался в пределах экспериментальной ошибки [18].
Матричный эффект существенно затрудняет количественный анализ для TOF-SIMS, поэтому его влияние обязательно должно быть учтено при получении количественных данных. Основное уравнение SIMS можно представить в виде [2]: /jj = 1р х Ум X а+ X См X Г, (1) где /$ - ток вторичных ионов М в матрице (химическом окружении) А, /Р - ток первичных ионов, Ум - выход вещества М, а+- вероятность ионизации вещества М, См -концентрация М в поверхностном слое, Т - коэффициент переноса систем масс-анализатора и детектора. Упрощенно уравнение (1) можно записать как: /jj = S& X См, где S& - коэффициент чувствительности М в матрице А. Данный коэффициент определяется эмпирически методом калибровки. При количественном анализе необходимо также учитывать, что некоторые ионы (Н, С, холестерин и др.) выходят, как в положительных, так и в отрицательных масс-спектрах. Электроотрицательные элементы, как правило, имеют больший выход отрицательных ионов, в то время как электроположительные элементы имеют больший выход положительных ионов. Выход положительных и отрицательных ионов может отличаться на несколько порядков.
Жидкометаллическая ионная пушка
Различные типы тканей были исследованы при помощи TOF-SIMS: срезы мозга, мозжечка, почек, мышц ноги мышей и крыс, биопсии почек, печени и мышц человека, жировая ткань (в том числе и с поверхности стенки аорты) и т.д. При помощи химического картирования возможно установить распределение биологических молекул в разных областях препарата. Большая часть подобных исследований посвящена изменениям в липидном составе, что объясняется двумя факторами. Во-первых, липиды хорошо детектируются из-за достаточно низкой молекулярной массы, а во-вторых распределение и функции липидных молекул в клеточных мембранах стали предметом пристального интереса в области биологии [59]. Липиды участвуют в многочисленных клеточных процессах, включая экзоцитоз и эндоцитоз, и в процессе передачи сигнала. В последнее время принято считать, что липиды играют важную роль в ряде клинических заболеваний, в частности болезнях Альцгеймера и Паркинсона.
Исследования тканей с помощью TOF-SIMS масс-спектрометрии можно условно разделить на две группы в зависимости от площади исследуемой поверхности. При исследовании малых областей (площадь 500500 мкм2 и менее) используется сфокусированный пучок ионов. Плотность дозы облучения при этом может достигать высоких значений (в том числе превышающих статический предел). При анализе больших площадей лимитирующим фактором становится время измерений. Для увеличения выхода ионов и уменьшения времени эксперимента пространственное разрешение может быть ухудшено за счет использования расфокусированного пучка ионов. За счет использования движения образца относительно ионной пушки можно исследовать биологические образцы очень большого размера. Так Брюнелем и др. [60] было получено изображение среза всего тела мыши размером 28 84 мм2 с разрешением 768 256 пикселей. Размер одного пикселя составил 109 мкм, а время анализа - 12 часов.
Срезы мозга крыс и мышей стали модельной системой для анализа липидов. Сьовалл и др. [61, 62] обнаружили сульфогликосфинголипиды и холестерин в белом веществе среза мозга крысы, а также глицерофосфолипиды (фосфатидилхолины и фосфатидилинозиты) в сером веществе. Позже Бенабделлах и др. [31] подтвердили полученные данные при исследовании сагиттальных срезов мозга крысы методами TOS-SIMS и MALDI. В качестве первичных ионов использовались ионы Bi32+ с энергией 50 кэВ, размер пикселя составил 87,5 мкм, а площадь анализа 22.4 22.4 мм2. В данной работе была установлена взаимосвязь между пространственной и химической информацией, что является важным для определения физиологических функций различных анатомических структур. Мозолистое тело (corpus callosum) - сплетение нервов, соединяющее левое и правое полушария мозга. Нервные волокна в этой части мозга покрыты миелиновой оболочкой, что обеспечивает максимальную проводимость электрического сигнала. Поэтому данная область хорошо определяется на ионных изображениях, благодаря высокому выходу ионов холестерина и витамина Е.
Помимо витамина Е и холестерина было обнаружены и другие молекулярные ионы липидов. Однако не всегда предоставляется возможность однозначно их идентифицировать. Например, ион с m/z 796.8 может быть либо ионом фосфатидилэтаноламина С40:4 вида [М+Н]+, либо фосфатидилэтаноламина С38:1 вида [M+Na]+, либо фосфатидилхолина С34:2 вида [М+К]+. Для установления точной структуры подобного иона нужна тандемная масс-спектрометрия.
Кроме этого в исследовании была затронута тема сравнения возможностей режима имиджинга для MALDIOF и TOF-SIMS. В целом MALDI обеспечивает более высокий выход ионов при размере пикселя более 50 мкм, однако наилучшее пространственное разрешение ограничено 10 мкм (см. таблицу 1). Ионные изображения, полученные методами MALDI и SFMS, по большинству ионов совпали, кроме изображения вышеупомянутого иона с m/z 796.8, которое получилось практически негативным по отношению к альтернативному методу ионизации. Это является иллюстрацией того, что матричный эффект проявляется по-разному при различных методах ионизации.
Найгрен и др. [21, 63, 64] исследовали срезы мозжечка крыс. Была установлена локализация холестерина, фосфатидилхолинов, галактоцерамида. Распределение липидов между разными типами клеток носило гетерогенный характер. Были обнаружены богатые холестерином зоны размером 10-20 мкм с низким сигналом Na+ и K+. Галактоцерамид C18 оказался солокализован с холестерином, а выход галактоцерамида С24 наблюдался в зоне с высоким сигналом натрия и калия. При этом галактоцерамид был обнаружен в маленьких точках размером 0.8-1.5 мкм.
При исследовании срезов мозга певчей птицы зебровой амадины [65] было обнаружено увеличение сигнала пальмитиновой и олеиновых кислот и уменьшение сигнала фосфолипидов в области мозга, отвечающей за пение песен. Также был обнаружен холестерин в белом веществе. Другим обширным направлением стало исследование болезней, приводящих к изменению метаболизма и концентрации определенных биомолекул в пораженных органах и тканях. Химические изображения позволяют понять, как изменилось распределение того или иного вещества по сравнению с контрольным образцом. Наибольших успехов в этом направлении удалось добиться группе французских исследователей (Брюнель, Тубул, Лапревот и др.).
Например, исследования срезов мозга человека показали, что в определенных слоях у больных, страдавших болезнью Альцгеймера, по сравнению с контрольной группой наблюдается увеличение содержания холестерина [66]. При исследовании проб биопсии печени было обнаружено накопление и локализация моноацилглицеридов, диацилглицеридов, триацилглицеридов, жирных кислот и холестерина у больных неалкогольным стеатозом печени по сравнению со здоровыми пациентами. Также было обнаружено значительное уменьшение сигнала витамина Е на пробах больных пациентов [67, 68].
Болезнь Фабри - редкое генетическое заболевание, связанное с нарушением метаболизма гликосфинголипидов и накоплением их в тканях и жидкостях тела. При помощи TOF-SIMS и MALDIOF масс-спектрометрии были исследованы образцы тканей кожи и почек пациентов [69]. Была установлена локализация липидов, в частности солокализация гликосфинголипидов и холестерина.
Оценка влияния различных факторов на выход вторичных ионов. Количественный анализ
Бомбардировка первичными ионами, а также десорбция других заряженных частиц (вторичные ионы и вторичные электроны) приводит к образованию положительного заряда на поверхности образца. В случае если образец обладает диэлектрическими свойствами, то заряд может сохраняться и накапливаться, изменяя траектории как первичных, так и вторичных ионов, что приводит к падению интенсивности регистрируемых ионов. Для компенсации этого заряда поверхность образца облучается потоком электронов с энергией около 10 - 20 эВ. Учитывая столь малую энергию электрона, повреждением, наносимым им поверхности образца, можно пренебречь. Тем не менее, чрезмерное увеличение плотности потока должно приводить к уменьшению SIY [25]. Изменение выхода вторичных ионов в зависимости от плотности потока электронов исследовалась на примере вышеописанных липидных пленок Ленгмюра-Блоджетт. Интенсивность тока электронов определялась током нагрева эмиттера электронной пушки. На рис. 7 представлена зависимость выхода иона молекулы дистеарилфосфатидилхолина от тока нагрева электронной пушки. Велечины SIY для каждого значения тока нагрева эмиттера, нормированы на величину SIY, полученную при отключенной электронной пушке (отсутствии компенсации заряда). Рис 7. Зависимость выхода вторичных ионов липида от тока нагрева электронной пушки.
Учитывая, что липидные пленки, нанесенные на кремниевые подложки, нельзя отнести к сильным диэлектрикам (для которых характерно падения сигнала в сотни и тысячи раз, вплоть до полного прекращения регистрации ионов), влияние электронной пушки не должно быть значительным. Более того, во время экспериментов не наблюдалось сколь либо значительных признаков накопления заряда на поверхности образца, поэтому максимальное усиление сигнала достигает лишь 45% . Эффект усиления будет выражен тем больше, чем сильнее диэлектрические свойства образца и чем больше интенсивность потока первичных ионов, заряжающих образец. Для данного типа образцов наибольший выход регистрируемых ионов достигается при токе нагрева электронной пушки 1,0 - 1,5 А. Дальнейшее увеличение тока нагрева, а соответственно и плотности потока электронов, вызывает повреждение образца, что сопровождается уменьшением полезного сигнала. Однако для многих диэлектрических образцов даже при токе нагрева 2,0 А не удается скомпенсировать зарядку поверхности. Поэтому оптимальной стратегией в данном случае будет использование минимального потока электронов, при котором зарядка поверхности не наблюдается.
Теоретически в качестве подложки для образцов в TOF-SIMS может использоваться любой материал, удовлетворяющий следующим критериям: ровная и плоская поверхность; достаточная электрическая проводимость. Ввиду ряда второстепенных свойств (оптические свойства, химическая чистота и отсутствие примесей, дешевизна производства и пр.) общепринятыми стали всего несколько типов подложек. Было проведено сравнение трех наиболее распространенных из них:
1. Серебряные подложки, изготовленные из пластин серебра. Ag, как известно, является хорошим проводником. Кроме того, серебро может обеспечивать усиление сигнала некоторых вторичных ионов (матричный эффект) [104].
2. Кремниевые подложки. Они обладают ровной зеркальной поверхностью, хорошо визуализующей находящиеся на поверхности объекты при оптической микроскопии в отраженном свете. Это особенно актуально, поскольку масс-спектрометр оснащен встроенной микрокамерой, через которую осуществляется навигация по образцу.
3. Кварцевое стекло, покрытое оксидами индия-олова. В случае комбинированных с оптической микроскопией исследований удобно использовать оптически прозрачные стеклянные подложки. Для улучшения проводимости стекло покрывается оксидами индия и олова 1п203 (SnO2)x.
Небольшое количество раствора фосфолипида в этаноле (25 мкл) было нанесено на подложку. Для обеспечения равномерной толщины пленки подложка центрифугировалась. Результаты исследования влияния подложки приведены в таблице 7. Чтобы уменьшить влияние толщины пленки, а также упорядоченности упаковки липидных молекул [58] на выход вторичных ионов из каждой серии экспериментов выбиралось максимальное значение.
Кремниевая подложка и ITO стекло показали близкий результат примерно в 5-6 раз меньше серебра. Как минимум три фактора могут объяснять столь серьезное различие. Во-первых, серебро обеспечивает наилучший сток заряда среди данных подложек. Во-вторых, нельзя исключать фактор пленки. Из-за различных свойств материала смачивание поверхности подложки происходит по-разному, что может приводить к образованию пленок с разными характеристиками (толщина пленки, упаковка молекул). Следует отметить, что при толщине пленки более 20 нм выход ионов практически не зависит от дальнейшего увеличения толщины [10]; а по оценкам АСМ толщина полученных пленок составляла сотни нм. Наконец, серебро или его оксиды, образовавшиеся на поверхности подложки, могли способствовать увеличению выхода молекулярного иона липидов.
Матричный эффект может существенно затруднять количественный анализ методом TOF-SIMS. Как было показано выше, на примере экспериментов с подложками для липидных пленок, даже замена подложки может оказать серьезный эффект на выход вторичных ионов. Следовательно, возможно подобрать условия таким образом, чтобы выход исследуемых ионов увеличился. Данная задача является особенно актуальной, так как недостаточный SIY тяжелых ионов (низкая чувствительность метода для ионов с высокой массой) является одним из главных недостатков метода, ограничивающих его применение в биологических исследованиях.
В таблице 5 приведен выход молекулярного и фрагментарных ионов фосфатидилхолина. Как уже обсуждалось выше, выход молекулярного иона на 2-3 порядка меньше. Это особенно критично для режима имиджинга, так как зачастую фрагменты не могут однозначно идентифицировать «родительский» ион. Количество ионов, доступных для анализа с одного пикселя пропорционально площади пикселя. Поэтому важно обеспечить достаточное количество ионов с одного пикселя при уменьшении пикселя (улучшении пространственного разрешения). Сделать это можно двумя способами: увеличив экспозицию первичных ионов или увеличив SIY (число выбитых ионов на один первичный). Возможности первого способа весьма ограничены, поскольку увеличение дозы облучения приводит к накоплению повреждений и, как следствие, падению SIY исследуемого иона (см. раздел 1.3.2).
Разработка метода визуализации морфологии и состава одиночных клеток на примере GV-ооцитов млекопитающих
Как уже упоминалось, ионные изображения, полученные в результате имиджинга ооцитов, можно совместить с различными видами микроскопии для лучшего понимания устройства и функционирования ооцита и его органелл. Однако набор исследуемых биомолекул несколько ограничен. В основном в фокусе исследований находятся липиды, аминокислоты и нуклеиновые кислоты (подробнее см. в разделе 1.4).
Несмотря на то, что ооциты мыши – сравнительно большие клетки, они существенно уступают в размерах ооцитам лягушки Xenopus laevis или нейронам Aplysia californica. Размер исследуемых ооцитов составляет 80 мкм, а размер NLB 10 мкм. Следовательно, для исследования распределения состава необходимо субмикронное пространственное разрешение. Использованное пространственное разрешение (размер пикселя) 200 нм близко к предельному для данного типа ионных источников. При таком размере пикселя выход молекулярных ионов недостаточен для получения контрастного изображения. Поэтому о распределении той или иной молекулы приходится судить по изображению распределения фрагментарных ионов. Это несколько затрудняет интерпретацию результатов, поскольку разные молекулы могут давать один и тот же фрагментарный ион. Список основных фрагментарных ионов, изображения которых были достаточно яркими и контрастными приведен в таблице 10 вместе с кратким описанием родительских ионов. В таблице приведены только те ионы, интенсивность которых достаточна для построения контрастных изображений.
Кроме того, были обнаружены пики, вероятно соответствующие нуклеотидам: аденину (m/z 90.0, m/z 136.1), цитозину (m/z 110.0, m/z 112.1), и гуанину (m/z 150.0) [41], однако их интенсивность оказалась слишком мала для получения достаточно ярких и контрастных изображений. Следует отметить группу фосфатных ионов (PO2-, PO3-, HPO4-), обеспечивающих яркие и контрастные изображения и визуализирующие органеллы (например, NLB). Однако связать происхождение данных ионов с какими-либо конкретными биологическими молекулами весьма непросто, поскольку они присутствуют во многих соединениях: белках, фосфолипидах, РНК и т.д. Тем не менее, анализ солокализации фосфатных групп с другими характерными фрагментами может дать дополнительную информацию. Так сравнение распределения иона PO3- и ионов холина (см. рис 30В и 30Д соответственно) позволяет установить, что происхождение PO3- не связано с фосфатидилхолином.
Рис. 30. Изображение среза ооцита, полученное различными методами. А – СЭМ на вставке вынесено увеличенное изображение зоны NLB . Б, В, Д, Е – распределение различных ионов, полученное при помощи TOF-SIMS: Б – m/z 33 (HS-), В – m/z 79 (PO3-), Д – m/z 86 (C5H12N+), Е – m/z 30 (CH4N+). Г – АСМ изображение.
Изображения на рис. 30 позволяют сопоставить химический состав ооцита (см. рис. 30Б, В, Д, Е), полученный методом TOF-SIMS и его морфологию, исследованную при помощи различных методов микроскопии (см. рис. 30А, Г). На рис. 30Б (распределение ионов HS-) видно ослабление сигнала ( 2.5 раза) из области, которая повторяет контуры ядра на микроскопических изображениях. На рис. 30В (PO3-) наблюдается значительное (чуть менее, чем вдвое) усиление сигнала с области NLB и прилегающей к нему ядерной мембраны. Аналогичным образом распределены по клетке и другие фосфатные ионы.
Довольно специфично распределение фосфатидилхолина в ооците, которое удалось визуализировать по двум наиболее интенсивным фрагментарным ионам m/z 86 (см. рис. 30Д) и 184. Распределение представлено в виде набора «горячих» точек. Большинство таких точек располагаются на мембране ооцита. Вероятно, эти точки вызваны остатками мембран кумулюсных клеток. Наибольший интерес вызывают две «горячие» точки внутри ядра в непосредственной близости от NLB. Сигнал фосфолипида там примерно вдвое выше, чем в цитоплазме ооцита. Также следует отметить, что каких-либо морфологических особенностей в зоне «горячих» точек липида не наблюдается.
Рис. 30Е визуализирует распределение характерного фрагмента многих аминокислот CH4N+. Его распределение также совпадает с распределением других фрагментов аминокислот с m/z 18 и 70: просматривается контрастный контур NLB. При этом сигнал из зоны NLB примерно в 2-2.5 раза превышает уровень сигнала из цитоплазмы. Высокий уровень сигнала аминокислот в NLB достаточно предсказуем, поскольку ядрышко-подобное тельце богато белками. В режиме имиджинга пик с m/z 70 является суперпозицией пиков C3H4NO+ и C4H8N+ из-за большей по сравнению со спектроскопией длительностью импульса первичных ионов. Первый пик можно связать с сигналом фрагмента нуклеотида урацила, тогда как второй – с фрагментом аминокислоты пролина. Интенсивность иона C4H8N+ в несколько раз выше (см. рис. 31). Таким образом, распределение ионов с m/z 70 в режиме имиджинга визуализирует в основном распределение пролина, а не урацила, повторяя распределение других характерных для аминокислот ионов: m/z 18 и 30.
В разделе 3.1.1 было рассчитано полезное пространственное разрешение для модельной системы - фосфолипидной пленки, приготовленной методом Ленгмюра-Блоджетт. Аналогичным способом, зная выходы вторичных ионов (SIY) и среднюю площадь, повреждаемую одним первичным ионом а, можно вычислить минимальную сторону квадрата, площадь которого достаточна для регистрации четырех ионов (L). Данные для некоторых ионов приведены в таблице 11.
На рис. 32 показан другой способ определения полезного пространственного разрешения, применяемый в микроскопии. В качестве примера расчета L ионного изображения было выбрано распределение ионов PO3-. На ионном изображении нужно выбрать характерную особенность. В случае биологических ионов удобно использовать в качестве характерной особенности мембрану ооцита, поскольку она дает резкий перепад интенсивности иона при переходе от фонового сигнала вне ооцита к сигналу с цитоплазмы. При этом толщина мембраны клеток составляет 7-8 нм, что много меньше размера пикселя (200 нм). Таким образом, характерный размер перехода и будет полезным пространственным разрешением. Он определяется как расстояние по оси абсцисс между 16 и 84% от интенсивностей перехода между областью вне ооцита ( 50 ионов с пикселя) и областью внутри цитоплазмы ( 250 ионов). Полученное расстояние составляет 0.4 мкм.