Сканирующая ближнепольная и двухфотонная микроскопия нано- и биообъектов Астафьев Артем Александрович

Введение к работе

Актуальность темы.

Возможность детектирования и изучения малых объектов чрезвычайно важна для многих научных дисциплин, включая биологические науки и науки о материалах. Для этих целей традиционно использовались различные методы оптической микроскопии. Тем не менее, во многих случаях пространственное разрешение оптических микроскопов оказывается недостаточным для детектирования субмикронных объектов. В последние годы получили интенсивное развитие две новые методики сканирующей оптической микроскопии. Первая методика, которая называется сканирующая оптическая микроскопия ближнего поля, позволяет получать пространственное разрешение значительно выше дифракционного предела Вторая методика - это сканирующая многофотонная флуоресцентная микроскопия, развитие которой тесно связано с использованием лазерных импульсов фемтосекундной длительности. Благодаря малому времени импульса можно эффективно осуществить многофотонное поглощение при незначительной энергии светового импульса. Это позволяет избавиться от нежелательного фона и увеличить контрастность изображения. Данная работа посвящена разработке и применению этих методик для изучения двух объектов.

Первым из изучаемых объектов были липофусциновые гранулы из ретинального пигментного эпителия (РПЭ) сетчатки глаза человека. Это структуры субмикронного размера, откладывающиеся в клетках РПЭ с возрастом и состоящие из сложной смеси белков, липидов и неорганических веществ. Известно, что липофусциновые гранулы играют большую роль в фотоокислительных процессах в сетчатке глаза, вызывая под действием света разрушение сетчатки, ведущее к ухудшению и даже потере зрения. Считается, что одним из основных источников фототоксических свойств липофусцина является содержащиеся в нём жёлтые флуорофоры, в частности наиболее известный из них - пиридиновый бис-ретиноид, называемый А2Е и его изомер (строение показано на Рис. 1), которые образуют активные формы кислорода при облучении синим светом. Тем не менее, механизм фототоксического действия липофусцина остаётся не до конца понятным.

Вторым изучаемым объектом являлись композиты, состоящие из наночастиц благородных металлов (золота и серебра), нанесённых на мезопористую плёнку ТЮ₂, сформированную из наноразмерных кристаллов ТЮ₂. Наноструктуры Ti0₂/Ag и ТЮ₂/Аи обладают плазмонным резонансом в видимой области. Усиление электромагнитного поля вблизи металлических наночастиц в металл-полупроводниковых нанокомпозитах может приводить к образованию «горячих точек», которые обладает значительной флуоресценцией. Механизм фотопроцессов в таких наноструктурах не изучен, хотя усиление электромагнитного поля вблизи металлических наночастиц в этих системах может быть использовано для фотокатализа или для детектирования слабых оптических сигналов.

он он

Рис. 1 Структурная формула молекул А2Е (слева) и изо-А2Е

Цели и задачи работы

1. Разработать и реализовать методики ближнепольной и двухфотонной флуоресцентной оптической микроскопии: собрать оптическую схему экспериментальной установки, обеспечить синхронизацию работы сканирующей платформы с системой регистрации оптического сигнала, создать программное обеспечение для управления сканированием и обработки экспериментальных данных.

2. Методами сканирующей оптической ближнепольной и атомно-силовой микроскопии изучить структуру одиночных липофусциновых гранул и распределение в них различных флуорофоров.

3. Методами двухфотонной сканирующей микроскопии исследовать оптические свойства нанокомпозитных Ti0₂/Ag и TiCVAu систем в зависимости от параметров возбуждающего импульса (поляризации и длины волны) и характеристик образца, чтобы сделать вывод о механизме усиления поля и появления «горячих точек» в таких системах.

4. Обнаружить усиление рамановского рассеяния для молекул, нанесенных на нанокомпозиты металл-Ті0₂ и проследить влияние концентрации высаженного металла на величину рамановского сигнала.

Научная новизна

1. Создана экспериментальная установка для реализации метода двухфотонной флуоресцентной микроскопии. Разработано программное обеспечение в среде LabView, которое позволяет:

управлять сканированием и синхронизировать регистрацию спектров и кинетик люминесценции с движением сканирующей платформы

строить по полученному в процессе сканирования набору спектров и кинетик изображение сканируемой области образца и анализировать изменение спектральных и кинетических характеристик излучения в различных точках области образца.

2. Обнаружена неоднородность строения липофусциновых гранул. Измерены спектры флуоресценции двух типов флуорофоров. Определено распределение флуорофоров в единичной грануле с пространственным разрешением ЮОнм.

3. Установлены внутримолекулярные процессы переноса энергии в А2Е и определены характерные времена жизни электронных синглетных состояний S₂ и Si. Дана оценка вероятности образования нефлуоресцентного продукта реакции.

4. Обнаружено влияние поляризации и длины волны возбуждающего излучения на локальное усиление поля в «горячих точках» металл-полупроводниковых нанокомпозитов; установлено влияние количества высаженного металла на концентрацию «горячих точек»

5. Экспериментально продемонстрировано усиление рамановского рассеяния для молекул родамина В, адсорбированных на пористой пленке ТІ02 с фотодепонированными наночастицами золота или серебра.

Практическая значимость работы

Полученные результаты по липофусциновым гранулам из ретиналыюго пигментного эпителия (РПЭ) сетчатки глаза человека, вероятно, будут полезны офтальмологам и фармакологам для выработки методов лечения глазных болезней, связанных с фототоксическим действием липофусцина.

Образование «горячих точек» в наноструктурах Ti0₂/Ag и ТЮ₂/Аи, может быть использовано для детектирования слабых оптических сигналов, в частности, для детектирования рамановского сигнала единичных молекул.

Апробация работы

Основные результаты, вошедшие в диссертацию, были представлены в докладах на следующих научных конференциях:

1. А.А.Астафьев, А.Н. Петрухин «Исследование ретинальных липофусциновых гранул методами ближнепольной и атомно-силовой микроскопии», XXVII научная конференция Московского физико-технического института, Москва - Долгопрудный, ноябрь 2004

2. А.А.Астафьев, А.Н. Петрухин «Исследование ретинальных липофусциновых гранул методами ближнепольной и атомно-силовой микроскопии», III Всероссийская Школа-Симпозиум «Динамика и структура в химии и биологии», Москва, апрель 2005

3. Astafiev А.А., Petrukhin A.N., Sarkisov О.М., Dontsov A.E., Feldman T.B., Ostrovsky M.A. «The studies of single human retinal lipofuscin granules using atomic-force and near-filed optical scanning microscopy», ICONO 2005 poster session, St. Petersburg, May 11-15 2005

4. A.B. Айбушев, A.A. Астафьев «Двухфотонная люминесценция комплексов наночастиц диоксида титана с наночастицами золота и серебра», VI

Всероссийская Школа-Сипозиум «Динамика и структура в химии и биологии», Москва, апрель 2008

Публикации.

В основе диссертации лежат результаты, опубликованные в 3 статьях и 2 тезисах докладов на научных конференциях.

Структура диссертации.

Диссертация состоит из трёх глав, введения, заключения и списка цитируемой литературы.

Похожие диссертации на Сканирующая ближнепольная и двухфотонная микроскопия нано- и биообъектов

Исследование химически модифицированной поверхности кремния, нанокатализаторов и оптических структур методами сканирующей зондовой микроскопииЧукланов Антон Петрович

Сканирующая туннельная микроскопия и спектроскопия нанооксидов металловГришин, Максим Вячеславович

Получение и исследование металлических наночастиц на поверхности высокоориентированного пиролитического графита и диоксида кремния методами сканирующей зондовой микроскопииЛебедев, Денис Владимирович