Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 11
1.1. Физико-химические методы исследования структуры биополимеров 11
1.2. Введение в импульсный ЭПР 13
1.3. Импульсные последовательности ЭПР-спектроскопии 17
1.3.1. PELDOR 17
1.3.2. DQC 18
1.3.3. SIFTER 20
1.3.4. Стимулированное эхо 21
1.3.5. RIDME 22
1.4. Парамагнитные спиновые метки 23
1.4.1. Нитроксильные радикалы 23
1.4.2. Триарилметильные радикалы 27
1.4.3. Способы введения меток в биомолекулу (SDSL) 30
1.5. Подходы для структурных ЭПР-исследований при комнатной температуре 33
1.6. Заключение 36
Глава 2. Электронная спиновая релаксация тритильных радикалов 38
2.1. Введение 38
2.2. Экспериментальная часть 40
2.3. Результаты и обсуждение 43
2.3.1. Стационарные ЭПР-спектры 43
2.3.2. Электронная спиновая релаксация в жидкости 49
2.3.2.1. Зависимость релаксации от вязкости растворителя 49
2.3.2.2. Зависимость релаксации от дейтерирования радикала и растворителя 49
2.3.2.3. Зависимость релаксации от полярности растворителя 50
2.3.2.4. Зависимость релаксации от структуры радикала 51
2.3.2.5. ЭПР-спектры в замороженном растворе 52
2.3.2.6. Механизм релаксации в жидкости 53
2.3.3. Электронная спиновая релаксация в трегалозе 55
2.3.3.1. Температурная зависимость времени релаксации 55
2.3.3.2. ESEEM-измерения при комнатной температуре 57
2.3.3.3. Механизмы релаксации в трегалозе 58
2.4. Заключение 63
Глава 3. Особенности взаимодействия тритильных меток с нуклеиновыми кислотами 64
3.1. Введение 64
3.2. Экспериментальная часть 66
3.3. Результаты и обсуждение 69
3.3.1. Стационарные спектры ЭПР при 298K 69
3.3.2. Влияние природы радикала на распределение по расстояниям 71
3.3.3. Влияние природы линкера на распределение по расстояниям 73
3.3.4. ЭПР-исследования при 180 ГГц 75
3.3.5. ЭПР-исследования при 260 ГГц 77
3.3.6. Сопоставление ЭПР-результатов с молекулярной динамикой 79
3.4. Заключение 81
Глава 4. Исследование спин-меченных нуклеиновых кислот при комнатной температуре 82
4.1. Введение 82
4.2. Экспериментальная часть 84
4.3. Результаты и обсуждения 87
4.3.1. Иммобилизация спин-меченного ДНК-дуплекса 87
4.3.2. Времена фазовой релаксации при комнатной температуре 92
4.3.3. Дипольные ЭПР-измерения при комнатной температуре 94
4.4. Заключение 102
Результаты и выводы 103
Список литературы 104
Благодарности 119
Приложение 120
- Нитроксильные радикалы
- Механизмы релаксации в трегалозе
- Сопоставление ЭПР-результатов с молекулярной динамикой
- Дипольные ЭПР-измерения при комнатной температуре
Нитроксильные радикалы
Типичными спиновыми метками являются нитроксильные радикалы (Рисунок 3, A). Данный вид радикалов является наиболее развитым в синтетическом плане. Нитроксильные радикалы имеют небольшую структуру, которая может подвергаться к видоизменению для придания определенных свойств. ЭПР-спектр таких радикалов состоит из трех линий (Рисунок 3, B), чувствительный к различным параметрам среды, таким как pH [88], полярность [89], вязкость, концентрация кислорода [90], движение окружающих молекул [91–93] и т.д. И это представляет собой уникальный инструмент для изучения многообразных молекулярных систем. В биологических молекулах спиновые метки позволяют изучить несколько важнейших свойств: подвижность и структуру.
Во многих биологических системах в температурном диапазоне 100 - 230К наблюдается динамический переход, заключающийся в увеличении амплитуды наносекундных ограниченных смещений атомов. Такие смещения атомов называются либрациями. Исследовать либраци-онное движение биомолекул можно косвенно, поместив в исследуемую систему спиновый зонд, например, нитроксильный радикал [94-96]. Такой зонд в матрице подвергается малоугловому колебанию за счет движений молекул в его окружении.
Спектр нитроксильного радикала в Х-диапазоне состоит из трех линий из-за сверхтонкого взаимодействия (СТВ) электрона с ядром азота (IN = 1). Центральная позиция в спектре (II, Рисунок 3) в основном определяется только анизотропией g-тензора, поскольку вклад СТВ анизотропии практически равен нулю. Поэтому эта линия в спектре обладает наименьшей анизотропией и шириной линии. Для спектральной позиции III (Рисунок 3, С), оба вклада анизотропии влияют на спектральную форму, из-за этого данная линия в спектре ЭПР является наиболее анизотропной и широкой. Теоретическое изучение либраций сводится к исследованию времен электронной спиновой релаксации нитроксильного зонда на различных спектральных позициях. В либрационной модели одновременные независимые либрационные движения нитроксильного радикала происходят вокруг трех взаимно перпендикулярных осей: х, y и z [91,97]. Теория релаксации Редфилда показывает, что для быстрых и малоугловых либраций время фазовой релаксации (Гт) описывается следующим выражением [93]: где w - среднеквадратичное колебание частоты углового резонанса (как пример, выражение (18) для либраций вдоль оси Х), тс - время корреляции, - среднеквадратичная амплитуда либраций, mi - проекция ядерного спина 14N (I = 1), и - полярные координаты направления магнитного поля в молекулярной системе координат. Сравнение значений Тт, измеренных в положениях магнитного поля с различной степенью анизотропии, позволяет определить параметр движения: 2 с. При этом анизотропия сверхтонкого взаимодействия для нитроксиль-ных радикалов является значительно большей, чем g- анизотропия в Х- и Q- диапазонах частот. Таким образом, значение w2 является практически независимым от микроволновой частоты в этом частотном диапазоне [98]. Модельный расчет позволяет оценить W (разница \1Тт при различных спектральных положениях) в Х-диапазоне [96]: L где (III) – это положение магнитного поля в эхо детектируемом спектре с mI = - 1; (II) позиция магниного поля с mI = 0 (Рисунок 3, C).
В структурной ЭПР-спектроскопии нитроксильные радикалы нашли широкое применение за счет компактной структуры, что позволяет их вводить в практически любое положение биомолекулы (смотрите главу 1.4.3). Для применения дипольной ЭПР-спектроскопии необходимо, чтобы времена электронной фазовой релаксации составляли порядка микросекунд. В настоящее время наиболее часто используемой спиновой меткой является MTSSL (Рисунок 3, A) [79,99,100]. Максимальное значение времени Tm для таких меток достигается при температуре ниже 75K (Рисунок 3, D). Поскольку в диапазоне температур 75 – 180K (c максимумом примерно на 140K) происходит размораживание движений CH3 групп, что приводит к уменьшению значений Tm за счет модуляции электрон-протонных сверхтонких взаимодействий [101].
В нитроксильных радикалах, у которых метильные группы заменены на спироцикличе-ские фрагменты, (Рисунок 3, A) высокие времена спиновой релаксации достигаются даже в диапазоне температур 75 - 130K [15]. В этом случае происходит подавление механизма, связанного с движением метильных групп. Недавно в работе [102] было показано, что спирозаме-щенные радикалы также могут быть применимы как спиновые метки для измерения расстояний при комнатной температуре. Это становится возможным, при использовании лиофилизации в водном растворе дисахаридов трегалозы. Лиофилизация является способом сушки веществ, при котором исследуемый образец сначала замораживается, а затем при пониженном давлении происходит сублимация воды. Трегалоза при этом образует достаточно жесткую матрицу, предотвращающую движения как биомолекулы, так и спиновых меток. Это способствует увеличению времени электронной спиновой фазовой релаксации. В нашей работе [103] были измерены времена электронной фазовой и спин-решеточной релаксации для серии свободных нитро-ксильных радикалов (Таблица 1) в стеклообразной трегалозе при комнатной температуре. Были исследованы нитроксильные радикалы пиперидинового, пирролинового, имидазолинового и имидазолидинового ряда с различными объемными заместителями около нитроксильного центра с целью оптимизации структуры спиновой метки для дипольных ЭПР-исследований при комнатной температуре. Однако для всех нитроксильных радикалов наблюдалось практически одинаковое значение времени фазовой релаксации ( 700 нс), при этом время спин-решеточной релаксации варьировалась в пределах 12 – 30 мкс (Таблица 1).
Механизмы релаксации в трегалозе
Одним из основных свойств трегалозы является ее способность оставаться в твердом состоянии даже при комнатной температуре [155]. Молекулы в стеклообразной трегалозе демонстрируют быстрые стохастические ограниченные движения в наносекундной шкале (также их называют стохастические молекулярные либрации), которые были ранее изучены с помощью ЭПР-спектроскопии [94,103,156,157]. Молекулярные движения в застеклованном состоянии матрицы вызывают модуляцию анизотропных взаимодействий, которые влияют на значения времен фазовой релаксации. Температурная зависимость 1/Tm для тритильных радикалов в тре-галозе может быть обусловлена тремя основными механизмами релаксации: (i) модуляция СТВ на группах -CH3 (-CD3) TAM радикалов, (ii) модуляция анизотропии g-тензора и (iii) модуляция анизотропии СТВ со всеми окружающими ядрами. При этом оба вклада (ii) и (iii) индуцируются либрациями TAM радикалов. Сравнение результатов, полученных для FD, FH и OX063D в протонированной и дейтерированной матрице, позволяет оценить вклад всех этих механизмов при различных температурах и магнитных полях (Х- и Q-диапазоны).
Температурная зависимость \1Тт для FH и FD демонстрирует локальный максимум при 150К (Рисунок 16). Это явно указывает на доминантный вклад модуляции анизотропии СТВ, вызванный вращением метильных групп TAM радикалов. Аналогичное явление было ранее показано в застеклованной матрице вода/глицерин [120]. Отсутствие метильных групп в структуре радикала OX063D (Рисунок 10) позволяет исключить вышеупомянутый эффект и исследовать механизм Тт, вызванный стохастическими молекулярными либрациями.
Для исследований либрационного движения методом ЭПР, как правило, в изучаемую матрицу вводят парамагнитные спиновые зонды. До настоящего времени активно применяли нитроксильные радикалы, имеющие большую анизотропию g-тензора и тензора сверхтонкого взаимодействия. Эти вклады приводят к анизотропно-широкому спектру ЭПР, который крайне чувствителен к небольшим движениям окружающих молекул. Применяя селективные импульсы к спектральному положению (II и III, Рисунок 3) с различной степенью анизотропии, можно исследовать анизотропию релаксации спина электрона и извлечь информацию о динамике окружающих молекул (Формулы 18-19).
В отличие от нитроксильных радикалов, ТАМ радикалы имеют незначительную анизотропию g-тензора и СТВ [119,120]. Поэтому анизотропный вклад в 1/Тт в высоких магнитных полях становится более зависимым от g- тензора, который можно описать как: где ge - это g-фактор электрона, - магнетон Бора, - постоянная Планка, g gzz - gxx и С учитывает все поле-независимые вклады в 1/Тт (включая СТВ анизотропию). Таким образом, для ТАМ радикалов сравнение Тт, измеренных в двух принципиально разных магнитных полях, например Х- и Q-диапазоны, позволяет определить параметр движения с: ТАМ радикал может иметь как асимметричный, так и симметричный ЭПР-спектр (приложение 1) в высоком магнитном поле в зависимости от химической структуры радикала. Ширина и форма линии в спектре ЭПР для ТАМ радикалов в основном задается анизотропией g-тензора. Поэтому небольшие изменения в химической структуре ТАМ радикала могут привести к значительным изменениям в ЭПР-спектрах и главным значениям g-тензора. В приложении 1 показаны ССИ-спектры для OX063D в метаноле и трегалозе при 80К в Х- и Q-диапазонах. Наблюдаемая ширина линии для OX063D в трегалозе и метаноле разная. Это означает, что изме нения в значениях g-тензора могут быть связаны не только с изменением химической структуры радикала, но и с природой окружающих молекул растворителя. Более того, полученные ЭПР-спектры имеют симметричный вид, что указывает на наличие ТАМ радикалов с различной локальной структурой, т.е. имеется небольшой разброс в главных значениях g-тензора. Поэтому мы провели моделирование полученных ЭПР-спектров (смотрите экспериментальную часть) в трегалозе и по формуле 23 оценили коэффициент перед 2 с, который составил:
Температурная зависимость W для TAM зондов была получена путем вычитания 1/Tm в Q- и X-диапазонах. Полученные результаты были сопоставлены со спирозамещенным нитро-ксильным радикалом (Таблица 1, радикал №4). Либрационное движение нитроксильных радикалов ранее исследовалось в трегалозе [157], однако подвижность молекул сильно зависит от остаточной воды в стеклообразной трегалозе. Поэтому мы приготовили образцы в трегалозе с нитроксильными радикалами аналогичным способом, как для TAM зондов. Релаксационные кривые для нитроксильных зондов были измерены в положении II и III (Рисунок 3) в спектре ЭПР. Температурная зависимость W была рассчитана по формуле: 1/Tm(III) – 1/Tm(II). Полученная зависимость W для нитроксильных зондов имеет более интенсивную форму за счет большой анизотропии СТВ и g-тензора, модулированной молекулярными либрациями, чем для OX063D (Рисунок 18, A). Наблюдаемая форма температурной зависимости W и начальная температура, при которой начинаются либрации, хорошо согласуются для OX063D и нитро-ксильного зондов. Это указывает на то, что подвижность молекул в стеклообразных матрицах не зависит от размера и природы введенных парамагнитных зондов.
Температурная зависимость параметра 2 c была рассчитана для OX063D как W/1,31016, а для нитроксильного зонда как W/91016 (Рисунок 18, B). Однако полученные температурные зависимости 2 c для TAM и нитроксильных зондов не совпадают. Это не удивительно, поскольку простая либрационная модель не учитывает различия в молекулярном размере зонда и межмолекулярных взаимодействиях спинового зонда и молекул трегалозы. При этом как для нитроксильного, так и для тритильного зондов наблюдаются одинаковые тенденции роста 2 c при увеличении температуры. Поэтому мы провели сравнение полученных результатов для нитроксильных и TAM зондов, умножив рассчитанные данные для ТАМ радикалов (Формула 24) на константу 3,5 для того чтобы они соответствовали данным нитроксильного зонда (Рисунок 18, C). Данное действие оказалось чрезвычайно эффективным и привело к отличному совпадению температурных зависимостей 2 c, полученных с применением TAM и нитроксильных радикалов. Применение такого коэффициента показывает, что у триарилме-тильных и нитроксильных зондов наблюдается одинаковый механизм подвижности в стеклообразной трегалозе.
Исследование молекулярной динамики матрицы с использованием TAM зондов имеет несколько существенных преимуществ. Во-первых, высокая чувствительность за счет узкой линии в спектре ЭПР. Это позволяет использовать более низкие концентрации зондов (или меньшие мольные доли) по сравнению с нитроксильными радикалами, и, таким образом, уменьшается возмущение свойств матрицы, вызванное спиновыми зондами. В этой работе концентрация TAM зондов была примерно на один порядок меньше, чем для нитроксильных радикалов. Второе преимущество TAM зондов – высокая точность измерений за счет длительного времени фазовой релаксации. Время Tm нитроксильных зондов является крайне чувствительным к окружающим магнитным ядрам, особенно к метильным группам матрицы [158]. Относительно небольшой размер нитроксильного радикала позволяет ядрам трегалозы приближаться к неспа-ренному электрону на 0,25 нм, тем самым создавая дополнительные дипольные сверхтонкие взаимодействия, которые приводят к уменьшению значения Tm. TAM радикалы имеют намного больший размер, чем нитроксильные радикалы, и их радикальный центр более «экранирован» от окружающей матрицы, поэтому ядра атомов трегалозы могут приближаться к ТАМ зонду не ближе, чем на 0,6 нм [148]. Именно поэтому для ТАМ радикалов дипольные сверхтонкие взаимодействия с ядрами матрицы примерно на один порядок меньше, чем у нитроксильного зонда, что приводит к более слабому влиянию на Tm. Третье преимущество ТАМ радикалов становится актуальным в случае большой подвижности молекул матрицы. Маленькое значение анизотропии у TAM зондов позволяет медленнее уменьшаться Tm по сравнению с нитроксиль-ными зондами. Следовательно, нитроксильные радикалы являются более чувствительными к низкоамплитудным либрациям за счет их большей анизотропии, тогда как TAM зонды являются предпочтительными для исследования молекулярных движений при высоких температурах.
Для всех изученных TAM радикалов (FH, FD и OX063D) значение 1/Tm в трегалозе при комнатной температуре сильно зависит от g-анизотропии, модулированной молекулярными либрациями. Изменения в 1/Tm позволяют оценить по формуле 22 относительный вклад g-aнизотропии в механизм релаксации, который составляет 6-10% в X-диапазоне и 45-55% в Q-диапазоне. Таким образом, все независящие от магнитного поля механизмы (в основном за счет СТВ анизотропии) составляют 90-94% и 45-55% в X- и Q-диапазонах, соответственно. СТВ анизотропии у TAM радикалов возникают за счет электрон-протонных взаимодействий с внутримолекулярными магнитными ядрами и с удаленными ядрами растворителя. Проведенные измерения для FD, FH и OX063D в протонированной и частично дейтерированной трега-лозе позволяют сделать вывод об этих вкладах при комнатной температуре. В соответствии с полученными результатами дейтерирование Финляндского радикала приводит к увеличению значения Tm на 20% в X-диапазоне при комнатной температуре. В то время как дейтерирование гидроксильных групп трегалозы не приводит к существенным изменениям времн фазовой релаксации.
Сопоставление ЭПР-результатов с молекулярной динамикой
Для объяснения полученных экспериментальных данных ЭПР были проведены расчеты спин-меченных ДНК-дуплексов методом молекулярной динамики (расчеты были проведены к.ф.-м.н. А. А. Ломзовым, ИХБФМ СО РАН). Было показано, что введение спиновых меток в ДНК-дуплекс практически не меняет конформацию дуплекса. При этом тритильные спиновые метки могут гидрофобно взаимодействовать с концевым спаренным основанием дуплекса (Рисунок 26, дуплекс I). Конформации ТАМ-меченного ДНК, когда обе тритильные метки взаимодействуют с концевыми спаренными основаниями дуплекса («закрытая» структура ДНК), хорошо описываются экспериментальным распределением по расстояниям, полученным импульсным ЭПР (Рисунок 26, дуплекс I).
В отличие от тритильных радикалов, нитроксильные спиновые метки имеют маленький размер и слабое гидрофобное взаимодействие с концевым спаренным основанием дуплекса, поэтому нитроксильные метки свободно вращаются относительно дуплекса. Данный эффект проявляется как в PELDOR-измерениях, так и в молекулярной динамике.
Моделирование методом молекулярной динамики для дуплекса VII показало две возможные конформации ТАМ меток: (a) ТАМ метки могут взаимодействовать с концевым основанием дуплекса; (b) ТАМ метки могут свободно вращаться относительно ДНК. Такие конформации приводят к Гауссовым распределениям с максимумами около 4,58 ± 0,14 нм и 5,01 ± 0,51 нм, при этом интегральный вклад в суммарное распределение по расстояниям составляет 30% и 70%, соответственно. Первый максимум на 4,58 нм хорошо согласуется с распределением по расстояниям для дуплексов I и VI, где использовался пиперазиновый линкер, но поскольку таких конформаций составляет всего около 30%, ориентационной селективности в PELDOR при 180 ГГц и 260 ГГц выявить не удалось.
Анализ МД расчетов для дуплекса VIII показал множество стабильных конформаций, которые в сумме дают широкое распределение, согласующееся с проведенными ЭПР-измерениями (Рисунок 26).
Таким образом МД расчеты согласуются с данными получеными методом ЭПР. В результате показано, что спиновые метки на основе TAM радикалов могут гидрофобно взаимодействовать с ДНК, что приводит в случае пиперазинового линкера к узкому распределению по расстоянию. В случае длинного линкера ТАМ метки свободно вращаются и/или гидрофобно взаимодействуют в различных положения с ДНК-дуплексом, приводя к широкому распределению.
Дипольные ЭПР-измерения при комнатной температуре
Узкая синглетная линия в ЭПР-спектрах (Рисунок 28) для TAM меток способствует применению одночастотных дипольных ЭПР-методов, таких как DQC, SIFTER. Однако у этих методов есть недостаток, связанный со сложностью корректировки базовой линии в отличие от PELDOR. Поэтому сначала мы протестировали двухчастотный дипольный метод ЭПР - PEL-DOR при комнатной температуре (более подробно о методе в главе 1.3.1). В случае с дуплексом II время фазовой релаксации на нитроксильном радикале составляет около 600 нс (Таблица 7), что является слишком коротким значением для измерения расстояний около 4 нм. Для дуплекса I, имеющего две ТАМ метки, частота наблюдения обычно располагается на линии сателлита С (Рисунок 32). Поскольку на сателлите появляется дополнительная анизотропия СТВ, это приводит к уменьшению времени фазовой релаксации, так в случае с трегалозой Тт = 1,7 мкс (Таблица 7). Данное значение релаксации является достаточным, чтобы зарегистрировать временную зависимость длительностью около 2,1 мкс (Рисунок 32). Однако за счет слабого сигнала на линии сателлита не удается измерить временную зависимость в более длительном диапазоне времен, и, более того, для этого требуется много времени (более 20 часов). Поэтому одно-частотные ЭПР-методы являются более перспективными.
На рисунке 32 показаны полученные временные зависимости и соответствующие им распределения по расстояниям для дуплекса I в растворе вода/нуклеосил при физиологической температуре (37С) методом DQC. Полученные результаты находятся в отличном согласии с PELDOR-экспериментом при 80K в замороженном растворе (1:1) D2O-глицерин-D8. При этом средние расстояния между метками и среднеквадратичные отклонения являются практически одинаковыми (Таблица 8). Таким образом, это позволяет заключить, что слабое электростатическое взаимодействие между ДНК-дуплексом и силикагелем, не влияет на структуру ДНК-дуплекса и положение ТАМ спиновых меток.
В трегалозе также успешно удалось применить одночастотные методы ЭПР, такие как DQC и SIFTER, с помощью которых были зарегистрированы временные зависимости до 4 мкс с хорошим соотношением сигнал/шум. Полученные распределения по расстояниям отлично совпадают с PELDOR-исследованиями при комнатной температуре (Таблица 8, Рисунок 32), таким образом, это подтверждает правильность корректировки базовой линии в одночастотных методах. При этом результаты, полученные методами DQC и SIFTER при комнатной температуре, также находятся в отличном согласии с DQC и PELDOR-исследованиями при 80K в трегалозе (Таблица 8, Таблица 6). Таким образом, существующее движение ТАМ меток в трегалозе при комнатной температуре не влияет на распределения по расстояниям, полученные методами од-ночастотной дипольной ЭПР-спектроскопии. Более того, полученные распределения по расстояниям в трегалозе хорошо согласуются с PELDOR-измерениями в воде/глицерин (Таблица 8), подтверждая, что разработанный метод приготовления образцов в трегалозе позволяет сохранить естественную структуру ДНК-дуплекса.
Средние расстояния, полученные в трегалозе одночастотыми методами SIFTER и DQC составляют 4,36 нм и 4,43 нм, соответственно (Таблица 8). Небольшие отклонения связаны, скорее всего, с неопределенностью с базовой функцией (Рисунок 33). В случае одночастотных методов дипольной ЭПР-спектроскопии, базовая функция содержит как межспиновые расстояния соседних спинов, так и релаксационные компоненты. Поэтому пока не существует полного теоретического описания для этих базовых функций. Коррекция базовой функции в этой работе проводилась аналогично, как и в других ранее опубликованных работах [48,49,119]. В экспериментальных данных (Рисунок 33) для SIFTER и DQC наблюдаются различные глубины модуляций. Чтобы это учесть при анализе соотношения сигнал/шум, мы сначала поделили экспериментальные данные на базовые функции: гауссовская и полином второго порядка для SIFTER и DQC, соответственно (Рисунок 33). Затем сигнал/шум определялся стандартным отклонением между полученными временными зависимостями и полиномом девятого порядка. Таким образом, было показано, что соотношение сигнал/шум для SIFTER приблизительно в два раз лучше, чем для DQC-эксперимента. Такая тенденция хорошо согласуется с 4-кратным улучшением сигнала/шум при использовании SIFTER по сравнению с DQC, полученным в Q-диапазоне при 50K [119].
В этой работе в трегалозе при комнатной температуре также были исследованы ТАМ-меченные ДНК-дуплексы VII и VIII методом DQC, поскольку в SIFTER-эксперименте практически не наблюдался дипольный сигнал из-за маленькой глубины модуляции. Временные зависимости при 298K были записаны в более коротком временном диапазоне (4,0 мкс и 5,0 мкс) по сравнению с ЭПР-измерениями в воде/глицерин при 80K (9,5 мкс, Рисунок 22). Поэтому только r и значения (но не форма распределения) могут быть проанализированы в диапазоне расстояний 4 нм при 298K. Полученные средние расстояния (Таблица 8) в трегалозе для дуплекса VII при комнатной температуре (5,01 нм, Таблица 8) хорошо согласуются с измерениями при 80K в воде/глицерине (5,02 нм, Таблица 5). В случае дуплекса VIII полученные r и при комнатной температуре (5,41 ± 0,76 нм, Таблица 8) немного меньше, чем соответствующие значения при 80K в воде/глицерине (5,74 ± 0,89 нм, Таблица 5). Данное уменьшение значений r и объясняется более коротким временем регистрации дипольной эволюции сигнала при 298K, что накладывает ограничение (до 7 нм) на наибольшее доступное для измерения расстояния. Тем не менее, в работе наблюдается хорошее согласие между распределениями при 298K в тре-галозе и при 80K в замороженном растворе вода/глицерин. Таким образом, применение ТАМ спиновых меток в комбинации с трегалозой позволяет проводить структурные исследования одночастотными дипольными методами ЭПР при комнатной температуре вплоть до 7 нм.
Для дуплекса II была применена 5-импульсная последовательность RIDME при комнатной температуре для измерения расстояний между ортогональными спиновыми метками три-тил/нитроксил в воде/нуклеосил и трегалозе. Для оптимизации времени смешивания при комнатной температуре была записана серия экспериментов RIDME с Tmix = 5 и 15 мкс для образца с нуклеосилом и Tmix = 20 и 45 мкс для образца с трегалозой (Рисунок 35). Более короткие времена смешивания позволяют получить более длительную временную зависимость и лучшее соотношение сигнал/шум. В то же время большие времена смешивания позволяют получить большую глубину модуляции до 0,5, однако, в этом случае получается сложная базовая функция в RIDME-сигнале. В отличие от базовой функции в PELDOR, в котором доминируют вклады от межмолекулярных дипольных взаимодействий, базовая функция RIDME дополнительно содержит вклады от спиновой диффузии. Так, в случае трегалозы спиновая диффузия больше, что приводит к значительно более быстрому спаду сигнала RIDME, чем в дейтерово-де/нуклеосиле. Кроме того, чем выше значение Tmix, тем больше вероятность спиновой диффузии. Поэтому оптимальное время смешивания для эксперимента RIDME составляет приблизительно T1,B спина партнера, как это было недавно показано на ионах металла [74]. Таким образом, для RIDME-измерений при комнатной температуре достаточно оценить T1 нитроксильных меток.
Поскольку в эхо-детектируемом спектре образца в системе вода/нуклеосил сигнала ЭПР от нитроксильной спиновой метки не наблюдалось (за счет быстрой фазовой релаксации), напрямую времена релаксации измерить не удалось. Однако значение T1 для нитроксильного радикала можно непосредственно определить из глубины модуляции RIDME-сигнала. Глубина дипольной модуляции в эксперименте RIDME может быть описана формулой 16. Сначала мы протестировали этот подход для образца с трегалозой, где Т1 нитроксильной метки напрямую определяли в импульсном эксперименте «инверсия-восстановление» (Таблица 7). В эксперименте RIDME мы получили 33% при Tmix = 20 мкс, следовательно, T1,B составляет примерно 18 мкс для нитроксильной спиновой метки. Данное значение примерно на 20% выше, чем для экспериментально измеренного значения (15 мкс, Таблица 7). Для образца вода/нуклеосил мы получили 25% при Tmix = 5 мкс, следовательно, T1,B составляет около 7 мкс для нитроксиль-ных спиновых меток. Таким образом, времена смешивания Tmix = 20 мкс и Tmix = 5 мкс являются очень близкими к оптимальным значениям для образцов в трегалозе и воде/нуклеосиле. Поэтому ниже обсуждаться будут результаты, полученные с использованием этих параметров.
На рисунке 35 показаны RIDME-сигналы при комнатной температуре и соответствующие распределения расстояниям для исследуемого ДНК-дуплекса II. Полученные средние расстояния и среднеквадратичные отклонения суммированы в таблице 8. Временные зависимости RIDME в воде/нуклеосиле при комнатной температуре измерялись в интервале до 2,5 мкс за счет более короткого значения времени фазовой релаксации для ТАМ спиновых меток по сравнению с исследованиями при 298K и при 80K в трегалозе. Для того чтобы убедиться в правильности полученных распределений по расстояниям при комнатной температуре, мы сравнили результаты RIDME с данными PELDOR, измеренными при 80K в воде/глицерине (Рисунок 35). Распределение по расстояниям, полученное методом RIDME при комнатной температуре, содержит пик на 6,5 нм в отличие от данных PELDOR при 80K. Этот пик на 6,5 нм подвергается сильным изменениям при коррекции базовой функции, поэтому мы отнесли этот пик к артефакту. В то же время распределение по расстояниям до 5,5 нм изменяется несущественно при варьировании базовой функции. Причем в этом промежутке расстояний результаты, полученные дипольными ЭПР-методами: RIDME при 298K и PELDOR при 80K, находятся в хорошем согласии.