Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1 Главный комплекс гистосовместимости человека (HLA-комплекс) 11
1.2 Номенклатура HLA 15
1.3 HLA-полиморфизм 18
1.4 HLA-полиморфизм и связь с заболеваниями 19
1.4.1 Ассоциация HLA с инфекционными заболеваниями 21
1.4.1.1 Иммуногенетика синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) 21
1.4.1.2 Иммуногенетика гепатита 24
1.4.1.3 Иммуногенетика малярии 25
1.4.1.4 Иммуногенетика туберкулёза 26
1.4.2 Ассоциация HLA с аутоиммунными заболеваниями 28
1.4.2.1 Ассоциация с органоспецифическими аутоиммунными заболеваниями 28
1.4.2.2 Ассоциация с системными аутоиммунными заболеваниями 30
1.4.2.3 Иммуногенетика ревматоидного артрита
1.5 Популяционный полиморфизм генов HLA 34
1.6 Этногеографическая характеристика казахской популяции 37
1.7 Заключение 38
ГЛАВА 2. Материалы и методы 40
2.1 Материалы и оборудование 40
2.1.1 Среды и растворы 40
2.1.2 Оборудование 40
2.2 Методы исследования 41
2.2.1 Выделение геномной ДНК 41
2.2.2 Электрофоретический анализ продуктов амплификации ДНК 41
2.2.3 Очистка ПЦР-продуктов 42
2.2.4 Очистка продуктов амплификации для ПЦР-секвенирования 42
2.2.5 Секвенирование и анализ последовательностей ДНК 43
2.2.6 Применение методов клонирования при определении HLA- генотипа 43
2.2.7 Компьютерный анализ последовательностей 44
2.3 HLA-генотипирование 46
2.4 Характеристика обследованных групп
2.4.1 Здоровые представители казахской популяции 47
2.4.2 Популяции для межпопуляционного анализа 48
2.4.3 Пациенты с диагнозом легочный туберкулёз (ЛТБ) 48
2.4.4 Пациенты с диагнозом ревматоидный артрит (РА) 50
2.5 Статистический анализ 51
ГЛАВА 3. Результаты исследований 54
3.1 Полиморфизм генов HLA II класса в казахской популяции 54
3.1.1 Распределение аллелей генов HLA-DRB1, -DQA1 и -DQB1 54
3.1.2 Идентификация новых HLA-аллелей 57
3.1.3 Гаплотипы HLA-DRB1-DQA1-DQB1 59
3.1.4 Генетические расстояния между казахской популяцией и другими этническими группами 62
3.2 Полиморфизм HLA-генов II класса и восприимчивость к легочному туберкулёзу 66
3.2.1 Ассоциации аллелей генов HLA-DRB1, HLA-DQB1 и HLA-DQA1 с легочным туберкулёзом. 66
3.2.2 Ассоциации гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1 с легочным туберкулёзом 71
3.2.3. Ассоциации аллелей HLA с мультирезистентным и монорезистентным легочным туберкулёзом. 72
3.3 Полиморфизм HLA-генов II класса и восприимчивость к ревматоидному артриту 75
3.3.1 Ассоциации групп аллелей генов HLA-DRB1, HLA-DQB1 и HLA-DQA1 с ревматоидным артритом 75
3.3.2 Ассоциации аллелей HLA-DRB1 04 и HLA-DRB1 13 с ревматоидным артритом. 78
3.3.3 Ассоциации генотипов HLA-DRB1 04 и HLA-DRB1 13 с ревматоидным артритом. 79
3.3.4 Ассоциации гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1 с ревматоидным артритом 80
3.3.5 Мета-анализ ассоциаций HLA-DRB1 с ревматоидным артритом 83
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 87
4.1. Межпопуляционный аспект HLA-полиморфизма. 87
4.2 HLA-полиморфизм и восприимчивость к легочному туберкулёзу . 91
4.3 HLA-полиморфизм и восприимчивость к ревматоидному артриту. 93
4.4 Заключение 98
Выводы 99
Список сокращений 100
Список литературы 101
- HLA-полиморфизм и связь с заболеваниями
- Электрофоретический анализ продуктов амплификации ДНК
- Идентификация новых HLA-аллелей
- HLA-полиморфизм и восприимчивость к легочному туберкулёзу
HLA-полиморфизм и связь с заболеваниями
Распределение антигенов HLA класса II в тканях ограничивается иммунокомпетентными клетками, такими как макрофаги, активированные Т-лимфоциты и В-лимфоциты. Существуют три типа HLA-молекул класса II: HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP, которые кодируются генами в различных регионах хромосомы 6. Каждый тип молекул содержит различное число аллелей для альфа и бета-цепей [1,2,3,6,7,33].
Молекулы класса II состоят из двух трансмембранных полипептидов, альфа-цепи и бета-цепи (Рисунок 1). Бета-цепь является гораздо более полиморфной, чем альфа-цепь. По этой причине в настоящее время исследования HLA-генов класса II направлены в основном на изучение полиморфизма бета цепи (HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQB1 и HLA-DPB1) [34]. Классические гены HLA, экспрессирующие высокополиморфные молекулы, характеризуются полигенностью и кодоминантностью, когда в одной клетке экспрессируются материнские и отцовские гены [1,2,3,6,7]. Сочетание полигенности и полиморфизма каждого из генов, главная функция которых -представление пептидов антигенов клеткам собственной иммунной системы, гарантирует, что каждый человек будет иметь возможность представить широкий спектр пептидов и что каждая из популяций и человечество в целом будет состоять из лиц, представляющих пептиды (то есть имеющих возможность ответить на них адаптивным иммунным ответом) практически безграничного спектра [35].
HLA-комплекс первоначально был идентифицирован благодаря своей ведущей роли в отторжении трансплантата [36]. Признано, что высокополиморфные гены HLA класса I и II являются одними из важнейших компонентов адаптивного иммунного ответа. Различные гены HLA вовлечены в этиологию заболеваний, включая, такие сложные аутоиммунные заболевания, как диабет 1 типа, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, болезнь Ходжкина; а также в чувствительность к таким инфекционным заболеваниям, как малярия и СПИД [3,8,9,10,11,12].
Актуальная версия специализированной базы данных последовательностей HLA (3.21.2015-07 из IMGT/HLA Database ), номенклатурного комитета по HLA-системе Всемирной Организации Здравоохранения представлена на сайте http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla. По действующей номенклатуре на июль 2015 года общее количество идентифицированных аллелей для классических генов HLA составило 13412 [37]. Номенклатурный Комитет по факторам системы HLA (WHO) устанавливает руководящие принципы для обозначения как существующих, так и новых генов, аллелей и серологических специфичностей HLA [38]. В таблице 1 представлено актуальное распределение аллелей по локусам классических генов HLA (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla). Таблица 1. Распределение аллелей по классическим генам HLA (от 31.07.2015)
Обозначение HLA-специфичности включает название гена, локуса и числа. Число обозначает конкретный вариант гена, аллель, например, DRB1 07:01. Название гена и номер аллеля разделяются друг от друга значком " ". Серологические методы HLA-типирования не позволяют определять тонкие различия между HLA-молекулами, что необходимо для идентификации аллеля, это можно сделать только на молекулярном уровне. На серологическом уровне можно выявить только выраженные различия между HLA-молекулами. Это низкий уровень разрешения HLA-тиипирования (2 цифры, группа аллелей).
Типирование различных аллелей на высоком уровне разрешения обеспечивает возможность установления до 4 и более цифр для конкретизации названия аллеля: первые две цифры обозначают группу аллелей, которая соответствует определенному антигену, две последующие цифры обозначают аллель, 5 и 6 цифры указаны для дифференциации вариантов аллелей (Таблица 2).
HLA-DRB1 07: 01: 01:01 Обозначение локуса (гена) Г руппа аллелей Аллель Вариант аллеля Пятая и шестая цифры добавляются для обозначения вариантов аллелей, которые содержат молчащие замены в кодирующей последовательности, не меняющие аминокислотной последовательности [39]. Так, например, аллель DRB1 14:01 имеет два варианта последовательностей ДНК, поэтому чтобы их различить эти два варианта обозначают, соответственно, как DRB1 14:01:01 и DRB1 14:01:02. После номера аллеля, в случае отсутствия его экспрессии, указывают «N». Отсутствие экспрессии, возможно, свидетельствует о серологических "пробелах" по сравнению с молекулярным типированием. Так, например, аллель DRB1 01:39N не экспрессирует белок и, следовательно, не обнаруживается серологически (пустая или нулевая аллель), но на уровне ДНК он может быть обнаружен. В какой степени это имеет клиническое значение неизвестно, необходимо продолжение исследований. Номера с пятого по седьмой обозначают различия последовательностей во вне кодирующей области (в интроне, например, HLA-DRB1 07:01:01:01).
Использование молекулярно-биологических методов (в основном, благодаря ДНК-секвенированию), позволяет каждый день обнаруживать все новые варианты HLA-генов: новые аллели и их подтипы, причем для некоторых из которых нет серологических эквивалентов.
В настоящее время База данных Комитета IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla) еженедельно пополняется новыми аллелями HLA. В указанной базе данных хранится информация о нуклеотидных последовательностях аллелей, утвержденных Номенклатурным Комитетом. Обновленный список аллелей регулярно публикуется в журналах Tissue Antigens, Human Immunology и European Journal of Immunogenetics [11]. 1.3 HLA-полиморфизм Целесообразность исследования HLA-полиморфизма в человеческих популяциях обусловлена необходимостью расшифровки биологических механизмов, которые участвуют в адаптивном иммунном ответе у человека. Тем не менее, лишь немногие мировые популяции исследованы с помощью HLA-типирования.
Распределение частот конкретных аллелей и гаплотипов колеблется среди различных групп населения и этнических групп. На сегодняшний день число зарегистрированных аллелей растет в геометрической прогрессии, поскольку новейшие молекулярно-биологические методы позволяют наиболее точно идентифицировать HLA-последовательности [11,40]. Большинство новых аллелей обнаруживаются лишь однократно, у большинства из них идентифицированы лишь экзоны, то есть кодирующие домены, хотя для других вариантов HLA-генов известны нуклеотидные последовательности и других областей [41].
Под популяцией принято понимать сообщество лиц, способных к воспроизводству, населяющее определенный географический регион. Совокупность генов и их аллельный полиморфизм составляет генофонд данной популяции. Различные группы населения Земли отличаются друг от друга по составу их генофонда. Изменения генофонда популяций могут происходить в результате исторических и природных событий. В образовании новых популяций, как правило, большую роль играют следующие факторы: мутации, естественный отбор, дрейф генов, миграция населения [42,43]. В результате этих естественных процессов разные популяции могут иметь различное частотное распределение аллелей полиморфных генов. Такие различия между популяциями особенно характерны для HLA-аллелей. Информация о распределении HLA-аллелей в конкретных популяциях представляет не только научный интерес точки зрения этнологии и эволюции человека, но также важно и для развития медицины, в частности таких направлений как трансплантация органов и иммуногенетика заболеваний.
Электрофоретический анализ продуктов амплификации ДНК
Геномную ДНК для проведения типирования HLA аллелей выделяли из венозной крови с помощью наборов «WizardGenomic DNA Purification kit» (фирмы Promega) и QIAamp Blood Mini Kits (фирмы Qiagen) согласно инструкциям производителя. Концентрация ДНК для выполнения типирования SSO – методом составляла 20 нг/мкл и SBT-методом - 50 нг/мкл. Количественная и качественная оценка выделенной ДНК осуществлялась с помощью метода спектрофотометрии (спектрофотометр Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific). Качество ДНК должно было соответствовать нормативному соотношению оптических плотностей – 1,6-1,8; при длинах волн 260/280 nm.
Амплифицированные фрагменты ДНК анализировали методом электрофореза в 2% агарозном геле, приготовленном на TАE-буфере. Для визуализации ДНК в агарозный гель вносили бромистым этидий (к/к 1 мкг/см3). Электрофорез продуктов амплификации проводили в аппарате для горизонтального электрофореза PowerPac, (Bio-Rad), при напряжении 8 В/см. Документирование полученных результатов проводили, с помощью системы документирования гелей Gel Doc, (Bio-Rad). Размеры амплифицированных молекул анализируемых образцов ДНК определяли путем сопоставления их электрофоретической подвижности в геле с подвижностью маркеров – фрагментами ДНК известной молекулярной массы. В качестве маркера молекулярных масс использовали "DNA Ladder 1kb", (Ferments).
Очистку продуктов для ПЦР-секвенирования проводили спиртовым осаждением: к 10 мкл образца добавляли 40 мкл полученной смеси из (3М NaOAc рН 4.6, 95 % C2H5OH). Перемешивали, инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Далее к осадку добавляли 150 мкл 75 % этанола, перемешивали и осаждали центрифугированием при 15600 g в течение 30 мин при температуре 40С. Супернатант выбрасывали, осадок подсушивали при 56С в течение 2 мин. Растворяли в формамиде, с последующим инкубированием при комнатной температуре. Далее денатурировали при 95С в течение 2 мин., после охлаждали во льду и загружали в автоматический генетический анализатор. 2.2.5 Секвенирование и анализ последовательностей ДНК
Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК проводили с использованием набора для термоциклического секвенирования Big DyeTM Terminator v.3.0 Cycle Sequencing (Applied Biosystem), согласно инструкции изготовителя. Электрофорез ДНК осуществляли на автоматическом генетическом анализаторе ABI PRISM 3170 xl Genetic Analyzer, (Applied Biosystems).
Несмотря, на высокую дискриминационную способность, в практике часто встречаются один или более нуклеотидов в комбинации аллелей, которые не позволяют предельно точно определить нуклеотидную последовательность, а, следовально, и наименование аллеля. Данная проблема чаще всего характерна для образцов гомозиготных по группе аллелей, но гетерозиготных по внутригрупповому делению, а также для неизвестных аллелей HLA. Поэтому с целью определения точного аллельного полиморфизма для образцов гомозиготных по группе аллелей, образцы типировали с применением методов клонирования.
Суть данного типирования заключалась в следующем: геномную ДНК выделяли из периферической крови с использованием набора для экстракции геномной ДНК фирмы PROMEGA Wizardgenomic DNA Purification Kit согласно протоколу изготовителя. Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере "PTC-0240 DNA EngineTetrad2 Cycler" (BioRad, USA). Второй экзон гена DRB1 амплифицировали с использованием группо-специфичных праймеров. Постановку ПЦР проводили следующим образом: 50 L ПЦР - смесь состояла из: ПЦР буфер (Литех), 0.25 mМ каждого дНТФ, 0.5 М каждого праймера, 2,0 единицы Taq ДНК-полимеразы (Литех) и от 50 до 100 нг ДНК. После первоначального шага денатурации 94C в течение 5 мин, образцы были подвергнуты 10 температурным циклам, каждый из которых состоял из следующих шагов: денатурации при 94C за 30 сек, отжига праймеров при 65C за 50 сек, после чего следовало 20 температурных циклов: отжиг праймеров при 62C в течении 50 сек и эллонгации при 72C за 1 мин. Последний этап - длительная эллонгация в течении 5 мин при 72C. ПЦР-продукты детектировали 2% агарозном геле с добавлением этидия бромида (0,2 мг/мл), для постановки электрофореза использовали по 50 L каждой пробы. После проведения препаративного электрофореза, бэнды с ПЦР-продуктами были вырезаны из геля, затем экстрагировали ДНК из геля с помощью QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Лигирование проводили использованием набора для клонирования Promega s pGEM- Easy Vector System (Promega, Madison, WI), в соответствии с инструкциями производителя. После всех манипуляций 4,5 мкл полученной смеси были трансформированы в компетентные клетки Escherichia coli (XL-Blue), отбор трансформантов проводился с помощью бело-голубой селекции на среде Luria Bertani (LB), в чашках Петри с добавлением ампициллина, X-gal и isopropyl--galactosidase. Колонии были отобраны, и подвергнуты лизису в 1Х ТЕ-буфере при 990С в течении 15 мин. Далее с полученными лизатами была поставлена ПЦР с использованием М13 - праймеров (прямой и обратный). Определение нуклеотидной последовательности аллелей проводили на 96-капиллярном генетическом анализаторе 3730xl Genetic Analyzer (AppliedBiosystems), с помощью набора BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing Kit (Applied Biosystems, USA). Идентификацию аллелей проводили используя международную базу данных EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/) (Рисунок 3) и программу SBT-INTERFACE (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gv/mhc/sbt.cgi?cmd=main) (Рисунок 4).
Идентификация новых HLA-аллелей
Наиболее частым в DQA1 локусе был аллель DQA1 03:01 (13,1%), затем DQA1 01:02 (10,2%), DQA1 01:03 (9,6%), DQA1 02:01 (9,6 %) и DQA1 05:01 (9,6%). Другие аллели встречались с частотой от 0,3% до 9,0%.
Для межпопуляционного анализа по гену DRB1 было дополнительно проведено HLA-типирование изолированной группы казахов, проживающих в Восточном Казахстане (регион Тарбагатай). Распределение частот аллелей в HLA-DRB1 локусе в казахской популяции из Тарбагатайского района приведены в таблице 8. В целом, у 157 представителей казахской популяции Тарбагатая было выявлено 35 аллелей гена HLA-DRB1, наиболее распространенными аллелями являются DRB1 13:01 (8,0%), DRB1 15:01 (7,6%), DRB1 03:01 (7,6%), DRB1 01:01 (5,4%), DRB1 13:03-102 (4,8%) и DRB1 09:01 (4,8%).
На основании полиморфизма гена DRB1 двух групп казахов было выявлено, что изолированная группа из Тарбагатая отличается от основной группы по распространенности аллелей, так например аллель DRB1 07:01 среди казахов Тарбагатая встречалась с частотой 1,9%, а в основной группе казахов частота данной аллели составила 13,1%.
В ходе выполнения работы были установлены новые аллели, обозначения которым были официально присвоены номенклатурным Комитетом Всемирной организации здравоохранения [230]. Новые аллели получили следующие обозначения: DRB1 03:56, DRB1 03:57, DRB1 13:102, DRB1 13:02:04, DRB1 13:103, DRB1 11:04:06 и DRB1 14:12:02 [231]. Семь новых аллелей HLA DRB1 локуса были обнаружены в пробах от здоровых представителей казахской национальности. HLA-DRB1 аллели идентифицированы с помощью метода клонирования локус-специфических ампликонов [175,176,177,232]. Новые аллели DRB1 были выделены в результате секвенирования продуктов ПЦР, полученных с помощью амплификации групповыми DRB1 03/08/11/12/13/14-специфическими праймерами, амплифицирующими фрагмент ДНК между от 1 и 2 интроном гена DRB1 [175,233]. Секвенирование обеих нитей ДНК проводили с использованием праймеров M13, Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), определение нуклеотидной последовательности проводили на генетическом анализаторе 3730xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems). (Applied Biosystems, Foster City, CA). Новые аллели были официально подтверждены Номенклатурным комитетом Всемирной организации здравоохранения [230,231]. В таблице 9 приведены новые последовательности и их сравнение с наиболее близкими аллелями. Пять из новых аллелей представляют собой одиночные нуклеотидные замены, три из которых приводят к изменениям аминокислот и две являются молчащими заменами (сайлент-замены). Остальные аллели, отличаются от наиболее близкого аллеля двумя нуклеотидными заменами, которые приводят к двум аминокислотным заменам в последовательности аллеля DRB1 03:57, но не аллеля DRB1 13:02:04.
Примечание: aНаиболее близкие последовательности были получены из IMGT/HLA sequence database (www.ebi.ac.uk\imgt\hla\). bНумерация от первого кодона белка. Измененный кодон, номер и последовательность аллеля, наиболее близкого к новому. Изменение нуклеотида выделено жирным шрифтом. cИнвентарный номер новых HLA-DRB1 аллелей (экзон 2)- Сайлент (silent) -аминокислота не меняется.
Частоты трех-локусных гаплотипов DRB1-DQB1-DQA1 (Таблица 10) были вычислены с использованием программы Arlequin v.3.11. Для сравнения полученных данных HLA-типирования с данными по различным популяциям была использована всемирная база данных частот аллелей HLA для населения разных стран [182]. Самые частотные гаплотипы, выявленные у казахского населения, наблюдались также в большинстве европейских и азиатских популяций. Наиболее распространенными среди казахского населения оказались пять DRB1-DQA1 DQB1 гаплотипов: DRB1 07:01-DQA1 02:01-DQB1 02:01/02:02 (8,0%), DRB1 03:01-DQA1 05:01-DQB1 02:01 (3,4%), DRB1 13:01-DQA1 01:03 DQB1 06:03 (2,9%), DRB1 14:01-DQA1 01:04-DQB1 05:02 (2,9%), и DRB1 13:01 DQA1 03:01-DQB1 03:01 (1,6%). Трех-локусные гаплотипы DRB1-DQB1-DQA1 с частотой 1,0% у казахского населения представлены в таблице 10, где частота этих гаплотипов сравнивается с частотами соответствующих гаплотипов в различных группах населения всего мира. Оценка частот двух-локусных гаплотипов (DRB1-DQB1 и DQB1-DQA1) и параметры неравновесного сцепления (LD) для них приведены в таблице 11.
HLA-полиморфизм и восприимчивость к легочному туберкулёзу
Позиции 70-74 в третьей гипервариабельной области DR1 цепи РA-ассоциированных HLA-DRB1 молекул все содержат сходные аминокислотные последовательности QKRAA, QRRAA или RRRAA. Эта последовательность аминокислот называется называется общим эпитопом (“shared epitope” (SE)), и аллели риска, кодирующие эту последовательность, широко известны как SE-аллели. Эти специфические аминокислотные последовательности кодировали не только HLA-DRB1 04-аллели, но также и РА-ассоциированные HLA-DRB1 01-аллели (Грегерсен и соавт. 1987) [257,258]. Отношение шансов (OR) для одного SE-аллеля равен 4.37, в то время как наличие в генотипе двух SE-аллелей HLA-DRB1-гена равен 11,79 [295].
Частота аллеля DRB1 04:01 существенно различалась у пациентов и представителей контрольной группы, частота данного аллеля была выше в группе пациентов (Таблица 21). Среди остальных вариантов из группы аллелей DRB1 04 между пациентами и контролем существенных различий не выявлено, вероятно, в связи с тем, что частоты этих аллелей были довольно низкими. Если рассматривать частоты данных аллелей в сравнении с DRB1 04:01 можно предположить только тенденцию к нейтральности, но не к ассоциации с заболеванием. Стоит также отметить, что частота группы аллелей DRB1 15 является относительно высокой у здоровых участников исследования, но частота этой группы аллелей почти в два раза выше у пациентов с РА (P = 0.023). Однако после коррекции поправкой Бонферрони ассоциация РА с DRB1 15 подтверждена не была. В то же время высокая ассоциация РА с аллелем DRB 04:01 у казахов совпадает с высокой степенью ассоциации данного аллеля с развитием РА, полученная на других мировых популяциях.
Протективный эффект определенных HLA-DRB1-аллелей относительно ревматоидного артрита был описан в ряде работ, проведенных на пациентах в различных популяциях. Так, группа аллелей HLA-DRB1 03 имела протективный эффект против РА у иранцев [255], DRB1 07 - у словаков [296] и финнов [297]; DRB1 08 - у мексиканцев [298]; DRB1 11- у перуанцев [299], DRB1 13 - у турков [244]. В настоящем исследовании HLA-DRB1 13 был негативно ассоциирован с РА, и возможно, свидетельствует о его протективным эффекте в популяции казахов. DRB1 13, возможно, являясь протективным аллелем был выявлен у 47 участников из контрольной группы (29,9%), тогда как группа аллелей DQB1 02 была выявлена у 71 представителя из контрольной группы (45,2%). Защитное действие группы аллелей DQB1 02 ранее было описано для пакистанского населения [248]. Однако, в том же исследовании эффект DQB1 02 (P = 0.02) был менее выраженным, чем эффект от DRB1 13 (P = 0.001).
В проведенном нами исследовании протективный эффект DRB1 13, возможно, можно связать с отсутствием аминокислотного мотива Q/R(K/R) RAA в положении 70-74, и наличием мотива DERRA [269]. Ранее описанные другие протективные аллели DRB1-гена, например, HLA-DRB1 01:03, DRB1 04:02, DRB1 12, DRB1 13:01, DRB1 13:02 и DRB1 13:04 имеют последовательность аминокислот (D/Q)ERAA в третьей гипервариабельной области, которая считается защитной [243,300]. На основании перечисленных данных была выдвинута гипотеза о защитном мотиве (DERAA) для HLA-DRB1- аллелей [301]. Наши результаты показали, что защитным эффектом среди вышеперечисленных аллелей в казахской популяции, возможно, обладает DRB1 13:01, что коррелирует с данными полученными в европейских популяциях [269]. Гаплотип DRB1 13-DQA1 05-DQB1 03 также обладал значительным защитным эффектом: он был выявлен у 15 субъектов из группы контроля по сравнению с 1 - в группе пациентов. Для HLA-DQB1; группа DQB1 03, участвующая в формировании гаплотипа, это вариант, который встречается в обеих исследуемых группах. Если сравнить протективный эффект аллеля и гаплотипа, в который входит DRB1 13, данные, представленные в таблицах 18, 21 и 23, свидетельствуют о том, что между ними нет никакого существенного различия. Совместное действие DRB1 13-DQB1 03 аллелей не обладает протективностью, как ожидалось, в связи с незначимостью DQB1 03. Обнаружение данного аллеля совместно с DRB1 13 может быть связано с неравновесным сцеплением с DRB1 13, что было подтверждено с помощью теста LD (D=0.072). Защитный эффект группы аллелей DQB1 02 в аллельном и гаплотипном формате статистически не различался (таблицы 20 и 22), из чего можно сделать вывод о том, что наблюдамый защитный эффект данного аллеля достигается только благодаря неравновесному сцеплению с DRB1 07, который имееет относительно высокую частоту (24,2%) среди здоровых представителей контрольной группы. Среди аллелей DQA1-локуса достоверной ассоциативной связи с ревматоидным артритом обнаружено не было.
В нашей работе мы также оценили риск развития РА у индивидумов с одновременном наличии в генотипе HLA-DRB1 04 и HLA-DRB1 13. Анализ показал эпистатическое взаимодействие между указанными HLA-вариантами, один из которых ассоциирован с чувствительность к развитию РА, а другой – с резистентностью. Аллель DRB1 04 является генетический фактором риска для РА. DRB1 13 в настоящем исследовании, обладает протективным фактором для РА.
Наше наблюдение показало что сочетание обоих вариантов гена DRB1 - 04 и 13 (DRB1 04/ 13) встречается очень редко в контрольной группе (1,9% случаев), и значительно чаще (6,1%) - у пациентов с РА. Действительно, сильного взаимодействия между DRB1 04 и HLA-DRB1 13 продемонстрировано не было. Однако, при наличии двух аллелей DRB1 04 наблюдается тенденция к более высокому риску развития РА, или наоборот наименьшая вероятность развития РА наблюдается при наличии в генотипе двух DRB1 13.
Таким образом, результаты, полученные в настоящем исследовании, демонстрируют существенную связь ревматоидного артрита с аллелями HLA-DRB1 04. Возможный протективный эффект DRB1 13 по отношению к данному заболеванию, обнаруженный в настощем исследовании, согласуется с данными, полученными ранее в различных популяциях. Найденная отрицательная связь РА с аллелем DRB1 13:01 должна быть подтверждена в будущих независимых исследованиях. Поскольку распределение HLA-аллелей в других этнических группах отличается от такового у казахов, защитная и ассоциативная роль DRB1-вариантов при РА в других популяциях также могут отличаться. Гаплотип DRB1 04-DQA1 03-DQB1 03 имеет достоверную ассоциативную связь с ревматоидным артритом.