Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Значение шигеллёзпых возбудителей и их антигенов в механизме иммунного ответа и воспаления при шигеллёзной инфекции. 11
1.2. Роль антител и иммунных комплексов в иммунном ответе. 19
1.3. Диагностическая значимость лабораторных методов диагностики шигеллёзов 25
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 36
ГЛАВА III. Клиническая характеристика обследованных больных дизентерией флексиера и зонне 43
ГЛАВА IV. ЗАКОНОМЕРНОСТИ ДИНАМИКИ НАКОПЛЕНИЯ О-АНТИГЕНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (ПО ДАННЫМ РПГА) И СЛИЗИСТОЙ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА (В РИФ) У БОЛЬНЫХ ДИЗЕНТЕРИЕЙ ФЛЕКСНЕРА И ЗОННЕ.
4.1. Частота выявления О-антигенов возбудителя ( в РПГА ) при дизентерии Зонне и Флекснера и их диагностическая значимость 51
4.2. Характеристика специфической О - антигенемии ( по данным РПГА) у больных дизентерией Зонне и Флекснера 4.3. Особенности и длительность персистснцин шигеллёзных антигенов в слизистой толстого кишечника у больных дизентерией Зонне и Флекснера. 59
Глава V. ХАРАКТЕРИСТИКА СПЕЦИФИЧЕСКОГО О-АНТИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА ПРИ ШИГЕЛЛЁЗАХ И ЕГО ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.
5.1. Содержание специфических О-антител Ig A, Ig М и IgG изотипов в сыворотках больных острой дизентерией Зонне и Флекснера
5.2. Диагностическая значимость выявления сывороточных антител к липоиолисахаридам при дизентерии Зонне и Флекснера 85
ГЛАВА VI. ХАРАІСТЕРИСТИКА ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ И ИХ ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ У БОЛЬНЫХ ДИЗЕНТЕРИЕЙ ФЛЕКСНЕРА И ЗОННЕ.
6.1. Содержание циркулирующих иммунных комплексов у больных дизентерией Зонне и Флекснера 90
6.2. Частота выявления специфических антигенов в составе ЦИК у больных дизентерией Зонне и Флекснера 100
ОБСУЖДЕНИЕ 114
ВЫВОДЫ. 131
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ. 133
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1
- Значение шигеллёзпых возбудителей и их антигенов в механизме иммунного ответа и воспаления при шигеллёзной инфекции.
- Клиническая характеристика обследованных больных дизентерией флексиера и зонне
- Частота выявления О-антигенов возбудителя ( в РПГА ) при дизентерии Зонне и Флекснера и их диагностическая значимость
- Содержание специфических О-антител Ig A, Ig М и IgG изотипов в сыворотках больных острой дизентерией Зонне и Флекснера
- Содержание циркулирующих иммунных комплексов у больных дизентерией Зонне и Флекснера
Введение к работе
Актуальность темы.
В настоящее время достигнуты значительные успехи в борьбе с инфекционными заболеваниями. Однако, изучение шигеллёзов является актуальным в связи с их высокой распространённостью, неизученностыо ряда вопросов патогенеза и иммуногенеза, необходимостью разработки ранних и высокочувствительных методов их диагностики.
Данные многочисленных клинических исследований свидетельствуют о различиях в тяжести течения шигеллёзов в зависимости от нозологии, клинического варианта и тяжести заболевания, а, именно, о более выраженной степени интоксикации и тяжести поражения кишечника у больных дизентерией Флекспера по сравнению с больными дизентерией Зонне, политическим вариантом по сравнению с гастроэнтероколитическим /12,17,30,34,51 /.
За последние годы отмечен рост тяжёлых форм дизентерии Флекснера, протекающих с осложнениями и приводящих к летальным исходам, основными причинами которых являлись перитониты и инфекциошю-токсический шок /11,21,35,48,49,52/.
Получены убедительные доказательства этиологической роли энтеробактерий - в первую очередь шигелл, а также сальмонелл и иерсиний в генезе хронических заболеваний кишечника /23/. С данными результатами согласуется и факт длительного сохранения воспалительного процесса в толстом кишечнике больных острой дизентерией в периоде реконвалесценции, освещенный в многочисленных работах авторов/16,29,41,167/.
Современные исследования свидетельствуют, что в основе поражения кишечника и развития синдрома интоксикации у больных дизентерией лежит активация пшгеллами и их антигенами клеток иммунной системы - моноцитов, нейтрофилов и лимфоцитов, к выработке провоспалнтельных медиаторов - цитокшюв, простагландинов, кисло родных радикалов и др., уровень которых повышался в крови и слизистой оболочке толстого кишечника в острый период заболевания /25,36,54,141,167,168/. Опыты in vitro свидетельствуют о том, что индукция выработки данных медиаторов может осуществляться самими шигеллами /172,177/, комплексами ЛПС-ЛПС-связывающий белок /84,161,181/, а также, в меньшей степени, иммунными комплексами, состоящими из ЛПС, О-антител IgG изотипа и комплемента /61,99,119,120,161/.
Несмотря на то, что ЛПС является мощным индуктором выработки провоспалнтельных медиаторов иммунными клетками хозяина и отвечает за большую часть провоспалительной активности грамотрицательных бактерий /124/, патогенетическая роль величины накопления ЛПС антигенов шигелл в кишечнике и крови в определении тяжести колита и выраженности интоксикации у больных шигеллёзами в зависимости от нозологии, клинического варианта, тяжести течения и наличия бактериологического подтверждения диагноза, а также в длительном сохранении воспалительного процесса в толстом кишечнике больных неизвестна.
Современные исследования свидетельтвуют о том, что ирогивошигеллёзные секреторные IgA-O-антитела играют главную роль в защите от шигеллёза /157/. Между тем, роль сывороточных О-антител в защите при этом заболевании остаётся неясной /78,80/.
Многочисленные исследования in vitro свидетельствуют о том, что противошигеллёзпые О-антитела IgA- u IgM- изотипов обладают высокой опсонической активностью в отношении шигелл, участвуя в реакциях клеточно-опосредованного иммунитета- аптителозависимой клеточной цитотоксичности лимфоцитов кишечника и периферической крови( IgA О-антитела), а также фагоцитозе шигелл нейтрофилами и макрофагами в сочетании с комплементом и/или лизоцимом (IgA- и IgM- О-антитела) /94,100,137,138,169,185/.
Кроме того, показано, что специфические IgG- u IgM- О-антитела играют ведущую роль в защите людей и лабораторных животных от эндотоксинемии и грам-отрицательной септицемии. Антитела к ЛПС оказывали защитный эффект путём усиления клеточно-опосредованного клиренса бактерий и эндотоксина из циркуляции /69,108,197/, а также снижения токсических эффектов эндотоксинов, в частности, выработки провоспалительных цитокинов- IL-1, IL-6, TNF-ot/9,161,197/. Кроме того, антитела (IgG- изотипа) оказывали иммуномодулирующий эффект, значительно увеличивая выработку цитокинов с противовоспалительными свойствами, а именно, - антагониста интерлейкин -1 рецептора ( IL-1-ra ) и растворимых рецепторов фактора некроза опухолей "альфа" ( sTNF-ars ) /61,63/.
Учитывая вышесказанное, представляется актуальным определение уровня сывороточных и фиксированных в кишечнике О-антигенов, количества сывороточных О-антител различных изотипов, ЦИК и их антигенного состава и сопоставление их со степенью выраженности морфологических изменений в толстом кишечнике.
Цель исследования - оценить клинико-патогенетическое и диагностическое значение уровня специфических О-антигенов, О-антител и циркулирующих иммунных комплексов у больных дизентерией Флекснера и Зонне.
Задачи исследования.
Исследовать уровень О-антигена шигелл в сыворотках больных острой дизентерией в динамике заболевания.
Определить содержание О-антигена шигелл и степень выраженности морфологических изменений в слизистой толстого кишечника у больных в разные периоды острой дизентерии.
Определить количество противошигеллезных О-антител IgA-, IgM- u IgG- изотипов у больных острой дизентерией в динамике заболевания.
Изучить уровень ЦИК и их антигенный состав при дизентерии в разные периоды болезни.
5. Определить диагностическую значимость выявления О-антигена шигелл в крови и слизистой толстого кишечника, О-антигена шигелл в составе ЦИК, специфических О-антител IgA, IgM и IgG-изотипов. Основные положения, выносимые на защиту.
1.Наибольшее содержание О-антигенов шигелл в кишечнике (при дизентерии Зонне и Флекснера) и крови (при дизентерии Флекснера) имеет место у больных средне-тяжёлым и тяжёлым течением шигеллёзов, колитическим вариантом.
Накопление О-антигена в кишечнике больных дизентерией Флекснера при среднетяжелом течении выше, чем при дизентерии Зонне.
В периоде реконвалесценции (независимо от вида шигеллёзов) и при затяжном течении дизентерии Флекснера персистенция О-антигенов возбудителя в слизистой толстого кишечника сохраняется на фоне воспалительных явлений.
2.Уровни противошигеллезных IgA- и IgM-O-антител у больных дизентерией Флекснера в остром периоде заболевания более низкие при средне-тяжёлом течении по сравнению с легким, колитическом варианте по сравнению с гастроэнтероколитическим. При дизентерии Зонне выявленная закономерность касается лишь тяжести течения.
Тяжёлое течение дизентерии Флекснера сопровождается снижением синтеза системных противошигеллезных О-антител всех изотипов и низкими показателями уровней ЦИК.
Шигеллёз Флекснера по сравнению с шигеллёзом Зонне характеризуется более низкими уровнями IgA- и IgM-O-антител на протяжении всего заболевания.
3.Показана диагностическая ценность методов обнаружения антигенов шигелл в мазках-отпечатках со слизистой прямой кишки и антигенов шигелл в ЦИК (в РИФ), а также иммуноферментного анализа для выявления сывороточных противошигеллёзных О-антител IgA-, IgM-и IgG-изотипов для подтверждения диагноза острых и затяжных форм шигеллёзов. Научная новизна полученных результатов. - Принципиально новым является комплексное изучение закономерности накопления О-антигенов в крови, слизистой толстого кишечника, содержания ЦИК и их антигенного состава, динамики уровня сывороточных О-антител IgA,- IgM- u IgG-изотипов у больных дизентерией Флекснера и Зонне.
Показано, что у больных шигеллёзами острый период болезни характеризовался накоплением О-антигенов шигелл в кишечнике и крови, повышением синтеза сывороточных IgA,- IgM- u IgG-O-антител и уровня ЦИК, показатели которых зависели от тяжести, варианта течения, наличия бактериологического подтверждения диагноза и этиологии заболевания. Накопление О-антигенов в кишечнике больных дизентерией Флекснера при среднетяжелом течении выше, чем при дизентерии Зонне. - Впервые установлено, что у больных бактериологически подтвержденными шигеллёзами, колитическим вариантом, средне-тяжёлым и тяжёлым течением имело место наибольшее накопление О-антигенов шигелл в кишечнике и крови на фоне низких уровней противошигеллёзных IgA- и IgM-O-антител, что,по-видимому, приводит к нарушению клеточно- опосредованного иммунитета и задержке элиминации антигенов возбудителей.- Впервые установлено, что при тяжёлом течении дизентерии Флекснера синтез системных противошигеллёзных О-антител всех изотипов и уровни ЦИК снижены. - Впервые показано, что для дизентерии Зонне характерен более высокий по сравнению с дизентерией Флекснера уровень противошигеллёзных IgA- и IgM-O-антител.
Установлено, что определение О-антигенов шигелл в мазках-отпечатках со слизистой толстого кишечника больных шигеллёзами может служить диагностическим тестом при дизентерии.
Практическая значимость полученных результатов.
Выявленные незавершённость воспалительного процесса и персистенция антигенов шигелл в толстом кишечнике на фоне клинического выздоровления в периоде реконвалесценции и при затяжном течении дизентерии требуют изменить тактику наблюдения и лечения больного на этом этапе.
Установлена высокая чувствительность, специфичность и диагностическая ценность методов обнаружения антигенов шигелл в мазках-отпечатках со слизистой прямой кишки и антигенов шигелл в ЦИК (в РИФ), а также иммуноферментного анализа для обнаружения сывороточных противошигеллёзных О-антител изотипов IgA-, IgM- u IgG. Комплексное применение этих методов позволяет значительно улучшить диагностику шигеллёзной инфекции.
Связь работы с научными программами, планами, темами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с научно-исследовательской программой «Последипломное образование медицинских кадров 2002 - 2005 гг.», гос. регистрация № 01200216501.
Личный вклад соискателя. Автор лично проводила клиническое обследование, исследование О-антител и О-антигенов шигелл в сыворотках в РПГА; ректороманоскопии с изучением мазков-отпечатков в РИФ, определение количества О-антител IgA-, IgM- и IgG- изотипов иммуноферментным методом; определение уровня ЦИК по методу Дижона и антигенов шигелл в составе ЦИК в РИФ; выполнила работу по анализу, количественной оценке и статистической обработке материалов.
Внедрение результатов исследования. Материалы исследования внедрены в практику работы городской клинической инфекционной больницы №3 г. Москвы, практику работы лаборатории и преподавания на кафедре инфекционных и тропических болезней с эпидемиологией РГМУ им. Н.И.Пирогова МЗ РФ и кафедре инфекционных болезней РМАПО МЗ РФ.
Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на совместной конференции кафедры инфекционных болезней РМАПО МЗ РФ и кафедры инфекционных, тропических болезней и эпидемиологии РГМУ им. Н.И.Пирогова МЗ РФ 17.06.2003.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, изданных в отечественной печати.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах и состоит из введения и 6 глав (обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения), выводов, практических рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 26 таблицами, 11 рисунками и описаниями клинических наблюдений. Библиографический указатель включает 202 ссылки (в т.ч. на 58 отечественных и 144 зарубежных публикаций). І.Обзор литературы. І.І.Значение шигеллёзных возбудителей и их антигенов в механизме иммунного ответа и воспаления при шигеллёзной инфекции.
Шигеллёз относится к инвазивным заболеваниям слизистой оболочки толстого кишечника человека. Этиологическим фактором заболевания являются шигеллы -грамотрицательные микроорганизмы, принадлежащие к семейству Enterobacteriacea. Работы последних лет внесли новые данные в схему патогенеза бактериальной дизентерии. In vitro было показано, что Sh. flexneri, в отличие от сальмонелл, неспособны проникать через апикальный полюс кишечных эпителиальных Сасо-2 или Т-84 клеток человека/139/. Проникновение происходит только на базалыюй стороне этих клеток. На лабораторных моделях заражения лигированных петель подвздошной кишки кроликов /154,155,192/ и внутригастралыюго заражения обезьян макак Sh. flexneri /179/ установлено, что раннее проникновение шигелл в слизистую толстого кишечника происходит через М клетки пейеровых бляшек (РР ), выполняющие функцию неселективного транспорта антигенов из просвета толстого кишечника к антигенпрезентирующим клеткам лимфоидных фолликулов. После проникновения через эпителиальный барьер инвазивные шигеллы исчезали из фагоцитарной вакуоли М клеток и вскоре трапслоцировались к фагоцитирующим клеткам, ассоциированным с фолликулярными структурами РР /154,155/. В результате инфицирования патогенами макрофагов активировался процесс апоптоза, который приводил к гибели клеток/77,200,201/. Инициация программы клеточной смерти шигеллами в макрофагах индуцировала освобождение ими больших количеств предшественника IL-la и зрелого IL-lp in vitro/177/ u in vivo в лабораторных моделях шигеллёзной инфекции /178/ и у больных шигеллёзом людей /167,168/. Из макрофагов шигеллы диссеминировали в близлежащие энтероциты путём межклеточного распространения или после трансцитоза, или лизиса макрофагов инвазировали энтероциты через их базолатеральный полюс /192/.Выделение больших количеств IL-1 в результате инфицирования и апоптоза макрофагов стимулировало ранний воспалительный ответ, сопровождающийся иммиграцией большого количества лейкоцитов, особенно ПЯЛ, которые , взаимодействуя с антигенами шигелл и подвергаясь активации в очаге воспаления, значительно усиливали каскадный эффект воспаления /154,155/. Мигрируя через эпителиальный слой в просвет кишечника, ПЯЛ повреждали межклеточные соединения эпителиального барьера , позволяя шигеллам инвазировать базолатеральный полюс эпителиальных клеток и завершали таким образом процесс инвазии эпителия патогеном/155/.In vitro показано, что инфицирование эпителиального клеточного монослоя шигеллами является многоэтапным процессом , включающим: 1) адгезию бактерий к клеточной поверхности; 2) проникновение путём индуцированного фагоцитоза; 3) исчезновение из фагосомы, которое завершает процесс проникновения; 4) внутриклеточное размножение ; 5) межклеточное распространение . Факторы вирулентности шигелл принимают непосредственное участие в патогенезе шигеллёза. К основным факторам вирулентности шигелл относят белки, ассоциированные с внешней мембраной, кодируемые плазмидой в 220 кв, отвечающей за инвазивпый фенотип бактерий /107,136/ и ЛПС/127/.Плазмида вирулентности шигелл содержит два главных локуса- регион инвазии и IcsA. Регион инвазии содержит гены, кодирующие четыре секретнруемых Гра белка , среди них Іра В (62 Кда), 1ра С(42 Кда) и Іра Д (38 Кда) считаются инвазинами шигелл Флекснера, т.е. секретирусмыми белками, которые при контакте с поверхностью эукариотической клетки запускают фагоцитарный процесс /136/ и затем осуществляют лизис мембраны вакуоли /107/, т.е. являются главными эффекторами в процессе проникновения. Антигены инвазии шигелл также значительно усиливают апикальный захват бактерий М клетками /154/ и участвуют в адгезии шигелл к эпителию /150/. Кроме того, Іра белки отвечают за лизис мембраны фагосомы макрофага и индукцию их апоптоза шигеллами /200/. Наконец, Іра белки обуславливают индукцию деграпуляции нейтрофилов при их контакте с шигеллами /172/. IcsA белок отвечает за внутриклеточное и межклеточное распространение шигелл /65/. IcsA белок локализуется во внешней мембране на одном полюсе бактерии, где он катализирует полимеризацию актина клетки хозяина.
Роль ЛПС, как фактора вирулентности шигелл определяется его способностью усиливать адгезию бактерий к эпителию толстого кишечника и участвовать в его колонизации /114/, оказывать большое влияние на внутриклеточное и межклеточное распространение шигелл после инвазии ими эпителиальных клеток /175,176/, отвечать за большую часть провоспалителыюй активности грам-отрицательных бактерий /124/.
Моноциты играют центральную роль в опосредовании физиологических эффектов эндотоксина. Показано, что связывание ЛПС с моноцитами происходит через участок липида А, который отвечает за большую часть биологических эффектов липополисахарида /73/. Недавние исследования /196/ позволили выяснить механизм действия липида А. Первоначально ЛПС через участок липида Л связывается с высоким аффинитетом с 60 КД гликопротеином плазмы, называемым ЛПС-связывающим белком. В дальнейшем комплексы ЛПС-ЛПС-связывающий белок переносят ЛПС к растворимой форме CD14 (pCD14) и вновь образованный комплекс ЛПС- pCD14 затем связывается с клеточным рецептором моноцитов-55 КД гликопротеином, называемым CD 14 рецептор, ведя к клеточной активации /163/.
Установлено, что большинство ответов лейкоцитов и эндотелиальных клеток человека на ЛПС опосредованы CD14 путём/84, 181,182/.
ЛПС индуцировал такие патологические реакции со стороны макроорганизма, как лихорадка, воспаление /149/ с острофазовым ответом /121/,лейкоцитоз, нейтропению /105/, диссеминировашюе внутрисосудистое свёртывание /82/, респираторный дистресс-синдром взрослых /151/ и множественные органные нарушения /83/, включая дисфункцию сердечнососудистой системы и падение кровяного давления, которые могут вести к летальному исходу. В настоящее время в значительной степени расшифрована роль различных медиаторов в опосредовании индуцируемых ЛПС эффектов. Показано, что генез гриппоподобных симптомов, таких как лихорадка , головная боль, тошнота, озноб, слабость, сонливость, миалгии, связан со стимуляцией выработки простагландинов и эндогенных пирогенов моноцитами, которые действуют на гипоталамус /71,173/. Повреждение эндотслиальных клеток во время воспаления, вызванного ЛПС, нарушает барьерную функцию эндотелиалыюй ткани в посткапиллярных венулах и больших сосудах и ведёт к повышению сосудистой проницаемости для жидкостей и макромолекул. ЛПС обладает прямым цитотоксическим действием на эндотелий /135/.
С активацией токсинами шигелл местного и генерализованного васкулита связывают и осложнения тяжёлого течения шигеллёза, вызванного S.dys.THnoMl и S. flcxneri: ДВС-синдром, гемолитико-уремический синдром, гангрену и перфорацию толстого кишечника /21,49,52,62,103,116Д22/.ЛПС активировал сосудисто-тромбоцитарное звено гемостаза и свёртывающую систему крови /182,188/.
Современные исследования свидетельствуют о том, что шигеллёз является острым воспалительным заболеванием кишечника индуцированным инвазивными шигеллами и опосредован адгезией лейкоцитов к эндотелию и поступлением их в ткани кишечника /155/.
Главными механизмами повреждения слизистой толстого кишечника при шигеллёзе считают индукцию выработки провоспалительных цитокинов в воспалённой слизистой кишечника /62,103,167,168,178/ и дегрануляцию нейтрофилов /154,155,172/ с освобождением токсических компонентов -протеолитических ферментов /66,143,193/, кислородных радикалов /190/ и
Установлено,что в поздней стадии шигеллёза ( 30 день болезни ), несмотря на то, что заболевание клинически разрешилось, процесс репарации слизистой кишечника переходил в персистирующую хроническую фазу, характеризуемую длительной инфильтрацией мононуклеарными клетками, секретирующими различные цитокины (IL-1, TGF-pi-3,IL-4,IL-10, IL-6) /167/.
Выработка провоспалительных цитокинов и индукция дегрануляции нейтрофилов могли быть результатом взаимодействия иммунных клегок как с самими шигеллами /172,177/, так и индуцированы комплексами ЛПС-ЛПС-связывающий белок /84,161,181/, а также иммунными комплсксами-JinC+IgG-O-аіггитела + комплемент/61,99,119,120,161,191/. У больных шигеллёзами, вызванными Sh.sonnei,Sh.flexneri и Sh.dys.l иммунологическими /51,109/ и морфологическими /30/ методами. показана активация клеток крови-лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов, а также эритроцитов и тромбоцитов, которые связывали эндотоксины шигелл /30/. Установлено, что степень активации иммунных клеток коррелировала с тяжестью течения заболевания и уровнем эндотоксинемии и была максимальна в острый период болезни. На высоте интоксикации у больных острой дизентерией отмечалось значительное увеличение выработки активных форм кислорода нейтрофилами, активация процессов иерскисного окисления липидов плазмы, снижение антиоксидашной защиты, возрастание уровней простагландинов ( PGE и PGF2), простациклина и трохмбоксана ( метаболитов простагландинов), а также ферментов- маркёров органных повреждений (АЛАТ,АСАТ,ЛДГ) /25,36,54/.Отмечалось повышение уровней IL-1 ,IL-6,TNF-a,C-peaKTiiBiioro белка в крови /25,141,168/.Вместе с тем, системная активация, в отличие от местной, была низкой по величине /167,168/.
Более тяжёлое течение шигеллёза Флекснера по сравнению с шигеллёзом Зонне отмечено многими авторами /11,21,48,49,52/ и является, по-видимому, следствием выраженного накопления шигелл и их эндотоксинов в кишечнике, что ведёт к тяжёлому колиту и выраженной эндотоксинемии с развитием интоксикации.
Современные работы с внутривенным введением ЛПС Е. coli людям-добровольцам показали снижение ответа лимфоцитов периферической крови на ФГА и подавление выработки IL-2 u IFN-y /71,174/,что свидетельствует об ингибирующем действии ЛПС на клеточное звено иммунитета.Кроме того, ЛПС вызывал угнетение антителыюго ответа как на ЛПС, так и на Т-зависимые антигены /145,187/.
Экспериментально показано, что провоспалительные медиаторы-простагландины (PG) и TNF-oc играют ведущую роль в опосредовании индуцированных ЛПС нарушений клеточного и гуморального иммунитета, вызывая апоптоз (TNF-a) и нарушение активации Т-, В- лимфоцитов и моноцитов, а также подавляя дифферснцировку В-лимфоцитов в антителообразующие клетки и синтез антител /25,55,112,153,174/. Между тем, сам ЛПС шигелл, в отличие от ЛПС E.coli, являлся сильным индуктором выработки IFN-y Т-клетками in vitro /165/.
В экспериментальной модели заражения лигированных петель подвздошной кишки кроликов Sh. flexneri in vivo показано, что шигеллы вызывали апоптоз макрофагов, CD4+ Т- лимфоцитов и экспрессирующих поверхностный IgA( s IgA+ ) В- лимфоцитов лимфоидных фолликулов слизистой кишки /202/.
Учитывая важную роль пейеровых бляшек в раннем IgA ответе слизистой на бактерии /134/, апоптоз иммунокомпетентных клеток пейеровых бляшек под влиянием шигелл может играть важную роль в подавлении местного гуморального иммунного ответа в острый период шигеллёза /15/ и отвечать за смерть лимфоцитов и макрофагов в слизистой и иммуносупрессию при шигеллёзе.
Работы последних лет выявили нарушение активации (или состояние «частичной активации») Т- и В- лимфоцитов периферической крови и кишечника у больных шигеллёзами на разных стадиях болезни /109,164,165,166,167,168/. Нарушение активации Т-лимфоцитов у больных шигеллёзом Флекснера и Григорьева-Шига выражалось в поляризации в Т-хелперный -2 фенотип с появлением большого количества клеток, синтезирующих IL-4 и IL-10 в слизистой толстого кишечника в периоде рсконвалесценции; в то же время концентрация IFK-y в кале и плазме больных была снижена вплоть до поздних сроков заболевания (45 день болезни).Кроме того, в острый период выявлена блокада синтеза белка лимфокинов Т-клетками кишечника, низкое содержание мононуклеарпых клеток, вырабатывающих TGF-p (фактор, играющий роль в переключении В-клеток пейеровых бляшек кишечника на экспрессию IgA-изотипа и терминальной диффсрспцировке s IgA+ В-клеток в антителосекретирующис клетки).Отмсчалось также позднее появление и/или снижение экспрессии молекул адгезии/активации на T-(CD28, ICAM-1,LFA-1) и В-(В7, CD23) клетках периферической крови, нарушение дифференцировки В-клеток кишечника и периферической крови в АОК, нарушение экспрессии рецепторов для лимфокшюв( IL-4R, IFN-yR и TGF-plR) В-лимфоцитами кишечника. У лиц, экспериментально зараженных шигеллами Зонне, напротив, выявлялся повышенный уровень IFN-y в крови /141/. Кроме того, активация Т-лимфоцитов кишечника больных шигеллёзом Флекснера сопровождалась снижением количества Т-лимфоцитов в слизистой и их метаболической активности /19/, а также дистрофическими изменениями лимфоцитов, плазматических клеток и макрофагов' /16/, что, по-видимому, является результатом апоптоза.
Учитывая важную роль лимфокинов Т-клеток в дифференцировке В-клеток в антителосекретирующие клетки в ответ на большинство « Т-независимых антигенов» нарушение активации Т- и В-лимфоцитов может играть важную роль в подавлении специфического гуморального иммунного ответа при шигеллезах /92,96/. Нарушение выработки IFN-y может вести к значительному подавлению бактерицидной активности и нарушению элиминации антигенов шигелл макрофагами, нейтрофилами, NK-клетками и эпителиальными клетками слизистой и персистенции воспалительного процесса в толстом кишечнике больных шигеллезами в периоде реконвалесценции.
1.2. Роль антител и иммунных комплексов в иммунном ответе.
Несмотря на то, что шигеллы Зонне /131/ и значительная часть шигелл Флекснера /169,170/ устойчивы к бактерицидному действию комплемента, О-антитела чрезвычайно важны в уничтожении шигелл, выступая в качестве опсонинов в процессе фагоцитоза /100,131,169,194/, а также участвуя в антителозависимой клеточной цитотоксичности /128,137,138,185/. Шигеллы в отсутствии специфических О-антител и комплемента вызывали угнетение хемилюминесценции нейтрофилов in vitro /131/. В отсутствии О-антител и комплемента в качестве опсонинов нейтрофилы человека проявляли лишь умеренно выраженную фагоцитарную и бактерицидную активность (антибактериальный индекс составлял 32-34 ) ( для Sh. flexneri u Sh. dys.l, соответственно )/100,128/; поданным других авторов /131,137,169/ нейтрофилы периферической крови человека были неспособны уничтожать шигеллы в отсутствии опсонинов. Моноциты и макрофаги человека, поглощая шигеллы, вообще не оказывали бактерицидного эффекта /77,128/ и подвергались процессу апоптоза /77,200,201/.
Лимфоциты кишечника лабораторных животных /137/, а также лейкоциты грудного молока человека /138/ в отсутствии О-антител проявляли лишь умеренно выраженную натуральную киллерную цитотоксичность; лимфоциты же периферической крови человека /128,137/, как и лимфоциты селезёнки мыши /185/, вообще не обладали антибактериальной активностью в отношении шигелл в отсутствии специфических О-антител и, подобно макрофагам, подвергались процессу апоптоза /112,198,202/. Лимфоциты и моноциты периферической крови больных острой дизентерией Зонне и Флекснера, взятые спустя 3 и 6 недель от начала заболевания, также не обладали антибактериальной активностью в отношении инфицирующих шигелл в отсутствии противошигеллёзных О-антител/128/.
Показано, что для оптимальной опсонизации шигелл для фагоцитоза и уничтожения нейтрофилами и макрофагами и максимальной активации окислительного метаболизма фагоцитов требовались специфические О-аптитела в сочетании с комплементом и/ или лизоцимом /100,131,169/.Одни лишь специфические О-антитела ( IgGJgM или секреторные IgA ), как и одни лишь компоненты комплемента или лизоцим слабо повышали фагоцитоз и уничтожение шигелл, а также не обеспечивали достаточной стимуляции окислительного метаболизма фагоцитарных клеток. Современные исследования свидетельствуют о том, что IgA-0-антитела слизистых играют главную роль в защите хозяина от шигеллёза /157/. В моделе лёгочной инфекции у мышей показано, что мопоклональныс димерные IgA антитела, направленные к полисахаридному эпитопу Sh. flexneri 5, защищали бронхоальвеолярный эпителий лабораторных животных от инвазии Sh.flexneri. Защита была серотипепецифической и зависела от локальной концентрации IgA. Защита проявлялась в отсутствии гистопатологических повреждений, значительном снижении бактериальной инвазии и снижении синтеза IL-6 в крови мышей. Данная работа подтверждает более ранние исследования, в которых секреторные иммуноглобулины А защищали глаза морских свинок от инфицирования вирулентным штаммом шигелл Флексиера /171/. Одним из механизмов защиты, опосредованных IgA-O-антителами, является предотвращение адгезии и инвазии или механизм иммунной эксклюзии /152/.
Данный механизм основан на агглютинации шигелл и увлечении их в слой слизи в кишечнике, так как О-антиген участвует в адгезии шигелл к слизистой кишечника и её колонизации /114/. Между тем, современные исследования патогенеза дизентерии позволяют предположить и другой механизм функционирования IgA-O-антител. Показано, что на ранней стадии инфекции шигеллы инвазируют кишечную ткань через М клетки, которые доставляют бактерии прямо в лимфоидные фолликулы, где шигеллы инфицируют резидентные макрофаги и лимфоциты /154,192/. Таким образом, инициальное взаимодействие между шигеллами и клетками лимфоидной ткани кишечника является критическим в патогенезе дизентерии. В отсутствии IgA- О-антител шигеллы вызывают апоптоз резидентных макрофагов пейеровых бляшек и сопутствующее освобождение IL-lp, медиатора, инициирующего острый воспалительный ответ во время шигсллёза /200,201/. Кроме макрофагов, процессу апоитоза in vivo подвергались CD4+T- лимфоциты и В-лимфоциты пейеровых бляшек, которые также могли быть источником выработки провоспалительных цитокинов и хемокшюв /202/. Между тем, покрытые IgA микробы на слизистых оболочках индуцировали окислительный метаболизм и бактерицидную активность моноцитов и макрофагов через Fca рецепторы фагоцитов /94/. Таким образом, опсонизированпые секреторным IgA шигеллы, присутствующие в просвете кишечника, могут проникать в эпителий кишечника через М клетки и стимулировать опосредованный Fca рецепторами фагоцитоз и бактерицидную активность резидентных макрофагов. Кроме того, секреторные IgA- О-антитела опосредовали антителозависимую клеточную цитотоксичность, значительно и специфично повышая натуральную киллерную цитотоксичность лимфоцитов кишечника лабораторных животных и индуцировали антибактериальную активность лимфоцитов периферической крови человека и лимфоцитов селезёнки мышей в отношении Sh. flexneri u Sh. sonnei /137,138,185/. Важно, что лимфоциты из пейеровых бляшек (как и из эпителия, Lamina propria, мезентериальных лимфоузлов) проявляли натуральную киллерную и антителозависимую клеточную цитотоксичность /185/, причём величины антителозависимой и натуральной киллерной цитотоксичности интраэпителиальных лимфоцитов коррелировали с резистентностью лабораторных животных к инфицированию вирулентными Sh. sonnei /137/, подтверждая важную роль исхода взаимодействия шигелл с лимфоцитами кишечника в патогенезе дизентерии. Таким образом, кроме функционирования в качестве первой линии защиты, IgA- О-антитела, участвуя в реакциях клеточно-опосредованного иммунитета, могут играть роль в снижении тяжести течения заболевания, ограничении инфекции в пределах Lamina propria кишечника и предотвращении системной диссеминации шигеллёзной инфекции. Кроме того, IgA- О-антитела ( в сочетании с лизоцимом ) могут быть активными опсопинами для шигелл на слизистых кишечника, опосредуя их фагоцитоз полиморфноядерными лейкоцитами, что показано на примере E.coli /100/.Одни лишь IgA- О-антитела ( в отсутствии лизоцима) были слабыми опсопинами для фагоцитоза шигелл нейтрофилами и макрофагами /100/. IgM- О-антитела не предотвращали развития заболевания в моделе шигеллёзного кератоконъюнктивита у морских свинок /171/. IgM- О-антитела менее эффективно опсонизировали Е. соїі для фагоцитоза и внутриклеточного уничтожения перитонеальными макрофагами мыши по сравнению с IgA- О-антителами /194/. Вместе с тем, специфические IgM- О-антитела сывороток доноров эффективно опсонизировали шигеллы для фагоцитоза нейтрофилами /169/. Комплемент и/ или лизоцим требовались для достижения максимальной опсонической активности IgM- О-антител для фагоцитоза шигелл нейтрофилами, что объясняется недостатком у нейтрофилов рецепторов для IgM /199/. Существовала прямая связь между титрами IgM- О-антител в сыворотках доноров и их способностью усиливать фагоцитоз и уничтожение шигелл. Таким образом, полиморфноядерные лейкоциты и сывороточные противошигеллёзные IgM-0-антитела, прибывая в зону воспаления толстого кишечника при шигеллёзс, могут принимать активное участие в элиминации шигелл из поражённой слизистой, облегчая течение заболевания и препятствуя системной диссеминации инфекции.
Противошигеллёзные IgG-O-антитела не опосредовали бактерицидные функции в отношении шигелл. Так, IgG-O-антитела не опсонизировали шигелл для фагоцитоза нейтрофилами и макрофагами /169,194/, а также не опосредовали антитслозависимой клеточной цитотоксичности лимфоцитов кишечника в отношении шигелл /147/.
Факт, что шигеллёз- это локальная грам отрицательная бактериальная инфекция, сопровождающаяся эндотоксинемией /12/, предполагает участие сывороточных О-антител и в иммунологическом механизме клиренса ЛПС из циркуляции, предотвращающем развитие эндотоксического шока и других опосредованных эндотоксином системных осложнений.
Недавние работы позволили выяснить механизм системного защитного действия анти-ЛПС- антител.
Противоэшерихиозные IgM- u IgG- О- антитела значительно снижали захват ЛПС Е. Соїі моноцитами периферической крови человека /161/, путем стимуляции захвата эндотоксина клетками, лишёнными провоспалителыюго потенциала и представленными в большом количестве в периферической крови, в частности, эритроцитами через CR1 рецепторы /118,159,162/.
Кроме того, IgM- u IgG-O- антитела блокировали ировоспалительный захват ЛПС CD 14 рецептором моноцитов, одновременно увеличивая его кохмплемент-опосредованный опсонический захват данными клетками через CR1 рецептор/161/.
В литературе в настоящее время дискутируется вопрос в отношении связанных с изотипами различий в антибактериальных и защитных свойствах ЛПС-специфических антител IgM класса и различных субклассов IgG /38,160/. Работами авторов в лабораторных моделях грам-отрицателыюй бактериемии и эндотоксинемии in vivo показана защитная активность как специфических IgM-, так и IgG-O-антител /69,75,97,98,108,197/. Вместе с тем, исследование защитных свойств IgG-анти-ЛПС-антител в экспериментальных моделях in vivo показало неспособность антител этого изотипа полностью купировать эндотоксинемию и бактериемию, выработку провоспалительных медиаторов-TNF-a, IL-1, ІЬ-6,тромбоксапа В2 в крови и неспособность в полной мерс предотвращать развитие гемодинамических расстройств и пирогенной реакции /69,75,108,113,197/. Эти данные свидетельствуют о недостаточной эффективности IgG-O-антител (по-видимому, в силу их димерной структуры и умеренного аффинитета ) в осуществлении как нейтрализации свободного ЛПС, так и эффективной комплементопосредованной клеточной элиминации ЛПС из циркуляции. Показано, что защитные свойства моноклональных 0-антител в лабораторных моделях in vivo коррелировали со способностью О-антител осуществлять эффективное опсонофагоцитарное уничтожение патогена in vitro /98,158/. In vitro при использовании в качестве патогенов Ps.aeruginosa /160/, E.coli 018К5 /98/; Sh. flexneri /169,194/ показана значительно более высокая эффективность поликлоиальных и моноклональных О-антител IgM-изотипа по сравнению с О-антителами IgG-изотипов в комплемент-зависимом опсонофагоцитарном уничтожении патогенов. Данные in vitro также подтверждают неспособность IgG-O-антител эффективно нейтрализовать ЛПС /61,161,191/. Так, комплексы IgG-O-антител, ЛПС и комплемента, хотя и значительно снижали выработку TNF-a моноцитами по сравнению с комплексами ЛПС-ЛПС-связывающий белок, всё же выработка этого цитокина была значительной, прямо коррелировала с дозой ЛПС и значительно превышала соответствующую секрецию, индуцированную одним лишь ЛПС/161/. Кроме того, IgG-0-антитела к S.enteritidis значительно (в 4 раза; р<0,05) повышали люминол-зависимую хемилюминесценцию полиморфноядерных лейкоцитов в ответ на стимуляцию одноимённым ЛПС in vitro, т.е. вели к выработке потенциально токсичных кислородных радикалов нейтрофилами в ответ на ЛПС. Напротив, IgM-0-антитела на 46% (р<0,05) снижали индуцированную ЛПС люминолзависимую хемилюминесцеїщию ПЯЛ, т.е. вели к нейтрализации ЛПС /191/. Выражением умеренной способности IgG-0-антител осуществлять нейтрализацию и опсонофагоцитоз грам-отрицательных бактерий явился недавний расчёт необходимости очень высоких концентраций анти-018-ЛПС IgG в сыворотках ( более l,0u.gA\m) для обеспечения эффективной защиты от бактериемии и смерти лабораторных животных, заражённых гомологичным штаммом Е. coli К1 /180/.
1.3. Диагностическая значимость лабораторных методов диагностики шигеллёзов.
Обнаружение антигена.
Определение инфекционной антигенемии как этапа патогенеза при инфекционных заболеваниях, в том числе кишечных положило начало разработке и применению методов диагностики, направленных на обнаружение в крови и других биологических жидкостях антигенов возбудителей. Обнаружение специфического антигена позволяет подтвердить клинический диагноз уже в первые дни болезни, что важно для своевременного начала лечения и проведения противоэпидемических мероприятий.
Рядом авторов использовались для обнаружения О-антигенов шигелл в биологических жидкостях реакция агрегатгемагглютинации (РЛГА) /18,20,51/ и реакция коагглютинации /6/, которые за последние годы утратили своё значение в связи с появлением более перспективных методов, в частности, иммуноферментного анализа (ИФА) /24,33,42/.Основное достоинство ИФА состоит в высокой чувствительности и специфичности и в строго инструментальном количественном учёте результатов, что особенно важно для целей диагностики и изучения патогенеза шигеллёза. Изучение шигеллёзиой антигенемии с помощью ИФА проведено рядом авторов /1,18,25,39/. Чувствительность метода в бактериологически подтверждённых случаях составила 90,2-96,4% при шигеллёзе Зонне и 91,6-
96,4%- при шигеллёзе Флекснера; в случаях без бактериологического подтверждения диагноза-до 74,2%. РІФА позволил определять концентрации ЛПС в пределах от 0,5 до 1,0 нг/мл. Максимальный уровень антигена у больных составил 400-500 иг/мл, а в ряде случаев превышал 1 мкг/мл. Диагностическая специфичность ИФ тест систем равна 95,8-95,5% ( при шигеллёзе Зонне и Флекснера, соответственно ). Диагностически значимый уровень для обеих тест систем составил 40 нг/мл пробы. По данным Кравченко Н.В.( 1985) частота выявления антигенов у больных шигеллёзами Зонне и Флекснера равна 96,4%- на I неделе заболевания, 95,3-95,4%- на II неделе и 63,8%- на III неделе. Максимальные концентрации антигенов шигелл в крови определялись в острый период заболевания ( на I неделе ), на II неделе обнаруживалась тенденция к снижению средних уровней антигенемии с достоверным снижением изучаемого показателя на III неделе болезни.
Современные исследования свидетельствуют, что у больных шигеллёзами Зонне и Флекснера О-антигены в биологических средах ( крови и моче ) определяются в достаточно высоких концентрациях и в периоде клинического выздоровления /25,39/.
Наиболее высокие показатели антигенемии в периоде реконвалесценции ( на III неделе болезни) регистрировались у больных затяжным течением дизентерии /18,51/. Метод ИФА позволил выявить важные закономерности накопления специфических антигенов в крови больных при шигеллёзе: наиболее высокая частота и уровни антигенемии имели место у больных с более тяжёлым течением заболевания, при колитическом варианте по сравнению с гастроэнтероколитическим, в случаях выраженного воспалительно-деструктивного процесса в толстом кишечнике, а также при шигеллёзе Флекснера по сравнению с Зонне /1,25,39,51/.
Серебряковым М.10.(1988) и Маловым В.А.(1992) параллельно с кровью проведено определение О-антигенов в моче больных шигеллёзами методом
ИФА. В острый период заболевания О-антиген в моче выявлен у 89,1% больных шигеллёзом Зонне и у 93,5% больных шигеллёзом Флекснера.Установлено соответствие концентрации О-антигенов шигелл в сыворотке крови и моче больных во все периоды болезни.
Изучено также значение элиминации антигенов через циркулирующие иммунные комплексы ( ЦИК ) /6,17,56/. У больных шигеллёзами Флекснера и Зонне выявлено раннее нарастание уровней ЦИК в крови /17,51,56,58,116,117/. По данным большинства исследователей уровни ЦИК достигали максимальных значений уже в острый период заболевания и продолжали превышать показатели контроля в периоде реконвалесценции. Юсова ГА (1987) /56/ выявила с помощью реакции коагглютинации в ПЭГ- осаждённых ЦРІК К-антигены шигелл Зонне и О-антигены шигелл Флекснера у 80% больных бактериологически подтверждённой дизентерией Зонне и Флекснера на I неделе заболевания. С такой же частотой эти антигены определялись в ЦИК и на 2-3 неделе заболевания. Частота выявления антигенов не зависела от тяжести течения заболевания. У здоровых лиц в ПЭГ осаждённых ЦИК антигены шигелл не обнаруживались. Козько В.11.(1988) с помощью метода прямой иммунофлюоресцепции (РИФ) выявил гомологичные антигены в составе осаждённых из сывороток ЦИК у 70% больных дизентерией Зонне и Флекснера в ранние сроки заболевания. Антигены шигелл в составе ЦРІК у больных шигеллёзами Флекснера и Зонне обнаруживались значительно чаще, чем у доноров (р<0,001).
Чрезвычайно важным с точки зрения диагностики и изучения патогенеза шигеллёзов является выявление антигенов шигелл в толстом кишечнике больных. Для выявления антигенов в фекалиях больных использованы РПГА с антительными диагностикумами и РНАТ /10,14/. С помощью РПГА антигены шигелл в кале были найдены у 78,7% больных, с помощью РНАТ-у 70,4%. Предел чувствительности РНАТ равен 105 -10 б баїсгерий в 1 мл субстрата. Чувствительность эритроцнтарпых диапюстикумов- до 10 4 клеток и 1-100 нг эндотоксина в 1 мл субстрата /47/. К одним из высокочувствительных и доступных методов экспресс-диагностики, привлекающих пристальное внимание исследователей, относится РИФ. Для выявления антигенов шигелл в толстом кишечнике больных острыми кишечными инфекциями в РРІФ первоначально в качестве исследуемого субстрата использовали испражнения, реже биоптаты слизистой оболочки кишечника больных /32/. Однако, в испражнениях концентрация шигелл сравнительно невелика 121, в то же время обилие баїсгерий, перекрёстно-реагирующих с шигеллёзными антисыворотками, значительно затрудняет диагностику /32,47/. При исследовании биоптатов слизистой оболочки кишки специфичность РИФ выше, чем при исследовании испражнений, но биопсия относительно трудоёмка и производится по строгим показаниям. Шуваловой Е.П. и Полоцким В.10.(1989) /53/ предложено использовать для диагностики дизентерии препараты-отпечатки со слизистой оболочки толстого кишечника больных с последующим исследованием их в реакции прямой иммунофлюоресценции. Использование метода позволило подтвердить диагноз шигеллёза Флекснера и Зонне у 93% больных на ранних сроках болезни. РИФ в препаратах-отпечатках чаще позволяла подтвердить диагноз дизентерии, чем бактериологический и серологический методы. В высоком проценте случаев положительные результаты РИФ были выявлены и при затяжном течении дизентерии, когда результаты бактериологического исследования были отрицательными. Таким образом, РИФ в мазках-отпечатках может быть использована как для ранней экспресс-диагностики дизентерии, так и для выявления длительной персистенции возбудителя в периоде реконвалесценции при затяжном течении заболевания.
Весьма перспективными для диагностики являются молекулярно-генетические исследования-ДНК-гибридизация, полимеразная цепная реакция, которые позволяют определять строго специфичные для каждого вида шигелл участки ДНК /64,89/. Однако, эти методы пока в широкой практике для диагностики дизентерии не используются.
Данные недавних исследований свидетельствуют о длительном выявлении антигенов шигелл в крови и выделениях ( фекалиях, моче и слюне) переболевших как дизентерией Флекснера, так и дизентерией Зонне /6,10/. Так, в фекалиях переболевших шигеллёзами Флекснера и Зонне гомологичные антигены выявлены в РПГА у 56,4% и 23,1% лиц, соответственно. Белой О.Ф. (1994) показано, что антигены шигелл могут циркулировать в крови в составе ЦИК и выделяться с копрофильтратами, мочой и слюной до 4-х недель и более после перенесенного заболевания. Важным явилось и выявление антигенов шигелл в биологических жидкостях здоровых лиц /10/. Антигены шигелл Флекснера в фекалиях, моче и слюне выявлены у 34,9%, 14,8% и 6,9% здоровых лиц, антигены шигелл Зонне-у 2,6-1,5%, соответственно. Частые находки антигенов Sh. flexneri у здоровых, по мнению авторов, являются результатом перенесенной дизентерии и длительной ретенции в организме переболевших антигена Sh. flexneri.
Системный антительный ответ на липополнсахариды шигелл.
Выявление антител к ЛПС Sh. flexneri и Sh.sonnei методом иммуноферментного анализа ( ИФА ).
По данным большинства исследователей у больных шигеллёзами Флекснера и Зонне обнаруживается значительное нарастание титров сывороточных IgA-, IgM- и IgG- анти-Л ПС - антител /72,76,79,91,110,111,125,148,156/. Средние титры анти-ЛПС - IgA-, -IgM и -IgG уже в острый период заболевания значительно превышали показатели в контроле/76,90,110,111,148/. По данным Ciznar I et al. (1995) /76/, Oberhelman R.A. et al. (1991) /148/ уровни анти-ЛПС- IgG у больных шигеллезом Флекснера достигали максимальных значений уже в первые дни заболевания, а по данным Islam D. et al. (1995,1996) /110,111/ - на ЗО день болезни. Повышение анти-ЛПС - антител обнаруживалось во всех субклассах IgG.
Уровень антител класса IgG вначале повышался в порядке IgG2»IgGl>IgG3>IgG4 со сменой на IgG2»IgG3>IgGl>IgG4. Несмотря на повышение титров анти-ЛПС- IgG у больных шигеллёзом Флекснера не обнаруживалось изменений в уровнях общего IgG в крови. Другими исследователями не выявлено повышения средних титров по сравнению с контролем ни в одном из изотииов анти-ЛПС - антител в острый период заболевания /79/, либо выявлено нарастание лишь IgA- анти- ЛПС - антител /72,125,156/. Максимальные титры IgA- анти-ЛПС-антител выявлены на 10 день болезни, IgM- и IgG- анти-ЛПС-антител - на 14-28 день болезни. Уровень общих сывороточных IgM значительно снижался у больных шигеллёзом Флекснера по сравнению с контролем. Обнаруживалось нарастание как IgAl-, так и IgA2- анти-ЛПС- антител, причём IgA2 антительный ответ преобладал /ПО/.Отмечалась корреляция сывороточных анти-ЛПС- IgA с титрами анти-ЛПС- IgA в жидкости кишечного лаважа /76/. У больных сальмонеллёзом, вызванным сальмонеллами серогруппы В, установлена корреляция анти-ЛПС-^А2 (р<0,001) и, в меньшей степени, аити-ЛПС-IgAl ответа (р<0,02) с длительностью носительства /156/, что подтверждает установленное кишечное (слизистое) происхождение сывороточных IgA- анти-ЛПС антител /88,115,134,142,183,189/. Напротив, анти-ЛПС-IgGl ответ не коррелировал с длительностью носительства. Возрастание пропорции ^А2-содержащих клеток в желудочно-кишечном тракте в дисталыюм направлении /68/ объясняет преобладание IgA2 ответа у больных шигеллёзом в результате преимущественного поражения толстой и терминальной части подвздошной кишки. Титры анти-ЛПС-IgA снижались через 1 месяц, а титры анти-ЛПС-IgM и IgG - через 2-4 месяца по сравнению с периодом ранней реконвалесценции, однако все еще превышали показатели контроля. Спустя б месяцев средние титры анти-ЛПС-IgA, -IgM и -IgG у больных шигсллсзом Зонне не отличались от показателей контроля, между тем положительные титры IgG продолжали регистрироваться в 40-60 % проб сывороток. У больных шигсллсзом Флскснсра уровни анти-ЛПС- IgA снижались до показателей в контроле через 3-6 месяцев от начала заболевания, между тем, титры анти-ЛПС- IgG даже через 6 месяцев- 1 год после перенесенного заболевания продолжали значительно превышать показатели контроля. Иммунный ответ в периоде реконвалесценции у больных дизентерией Зонне был значительно выше, чем у больных дизентерией Флскснсра во всех классах Ig, наиболее высокими были титры IgA антител, уровень которых увеличивался в 10,5 раз по сравнению с контролем /79/. Более выраженный антительный ответ в периоде реконвалесценции отмечался у больных более тяжёлым течением заболевания и бактериологическим подтверждением диагноза/79,111/. В острый период заболевания Islam D. et al. (1996) выявил повышение титров анти-ЛПС- IgG лишь у больных средне-тяжёлым течением, тогда как у больных лёгким течением показатели анти-ЛПС- IgG не отличались от контроля. Напротив, Oberhelman R.A. et al.(1991) наблюдал более высокие уровни анти-ЛПС- IgG в острый период у больных лёгким течением шигеллёза Флекснера. Выявлены различия иммунного ответа к ЛПС Sh.flexneri в процессе заболевания у примированных и непримироваиных популяций /72,110,148/. Так, у шведов при шигеллёзе значительно нарастали анти-ЛПС- антитела всех изотипов с преимущественным нарастанием IgA- ( в 6,6±3,0 раза), значительным, но несколько меньшим -IgG- антител ( в 4,2 раза ) и умеренным- IgM- антител ( в 2 раза). У вьетнамцев обнаруживалось значительное, но менее выраженное повышение титров IgA-, и, в некоторой степени, IgG- анти-ЛПС антител, тогда как титры анти-ЛПС- IgM не были повышены .
Выявлен высокий уровень сывороточных антител изотипов IgA, IgM и IgG к ЛПС Sh. ilcxiieri различных серотипов у жителей эндемичных районов-Бангладеш /110/, Вьетнама/72,91/, Коста-Рики/60/.
Выявлены высокая чувствительность и специфичность ИФА при шигеллёзе Флекснера и Зонне /79,90,91,110,125/. Анти-ЛПС ответы по крайней мерс к 1 классу иммуноглобулинов обнаружены в 80-85% проб сывороток от больных (шведов и израильских военных) с бактериологически подтверждённым шигеллёзом Флекснера и у 49% лиц- с клинической дизентерией. В целом положительные результаты ИФА получены в 55,7% проб. Ekwall Е, Lindberg А.А. (1988) положительные титры IgA, IgM и IgG выявили у 79%,29% и 93% больных- шведов с бактериологическим подтверждением диагноза; у всех больных титры антител одного или более изотипов по крайней мере в одной пробе сывороток были положительными. Повышенные титры IgA в ранней фазе и титры IgG- в периоде реконвалесценции были лучшими -индикаторами Sh. flcxiicri инфекции. Положительные титры IgA и IgG отмечались в течение первых 4-х недель после начала заболевания. Спустя 1 год положительные титры IgA, IgM и IgG выявлены у 56%, 18% и 82% больных, соответственно. Вместе с тем, среди больных шигеллёзом Флекснера вьетнамцев высокая чувствительность метода ИФА обнаруживалась только среди детей младше 3 лет из-за высоких титров антител к Sh. ilexneri у здоровых взрослых и детей старших возрастных групп.
Между тем, диагностика, основанная на частоте сероконверсий, была низкой: в анти-ЛПС- IgA и -IgG ответе сероконверсия выявлялась лишь у 1 из 8 больных, инфицированных Sh. Ilexneri /76/. Показана высокая специфичность видовой диагностики шигеллёза Флекснера. Так, при исследовании в ИФА сывороток 34 больных острой дизентерией, вызванной шигеллами других видов, больных сальмонеллёзом, камнилобактериозом, иерсиниозом, у которых диагноз был подтверждён бактериологическим методом, положительные титры IgG выявлены только у 2 больных ( 6%). По данным Li A. et al. (1993) специфичность ИФА у больных шигеллёзом Флекснера составила 84%. Не обнаружено значительных антительных ответов ни в одном из 4-х субклассов IgG у больных шигеллёзом Флекснера к ЛПС Sh.dysenteriae 1 или к токсину Шига. Исследование специфичности антительного ответа у больных, инфицированных Sh. flexneri 1в, показало параллельное нарастание титров сывороточных антител к Sh.flexneri 2а и 4а во всех классах Ig ( отражающее нарастание титров антител к О-ПС эпитопам, общим для всех 3-х серотипов), что делало невозможным серотипепецифическую диагностику шигеллёза.
У больных шигеллёзом Зонне положительные титры IgA, IgM и IgG выявлены в 55%,45% и 36% проб сывороток в остром периоде и в 95%,85% и 85% проб сывороток, взятых через 14-28 дней от начала заболевания. Спустя 2-4 месяца от начала заболевания процент больных с положительными титрами IgA, IgM и IgG снижался до 48%, 48% и 72%, соответственно. От 79 до 94% больных с бактериологическим подтверждением диагноза имели по крайней мере 1 пробу сыворотки, где какой-либо класс иммуноглобулинов был положительным; у 85% были положительными 2 или 3 класса иммуноглобулинов. В случае отсутствия бактериологического подтверждения диагноза апти-ЛПС ответы по крайней мере к 1 классу иммуноглобулинов выявлены в 69% проб сывороток. Эффективность диагностики, основанной на выявлении частоты сероконверсий, была низкой: 4-х кратное и выше нарастание титра сывороточных IgG к ЛПС S. sonnei в периоде реконвалесценции по сравнению с острым периодом отмечено лишь у 3 из 9 больных /195/. Специфичность ИФА составила 82-90%. Положительные титры антител к ЛПС Sh. sonnei выявлены лишь у 10 из 56 больных (18%) с другими кишечными инфекциями- сальмонеллёзом, иерсиниозом, кампилобактериозом.
Таким образом, в литературе недостаточно отражены проблемы диагностической значимости выявления антигенов шигелл в мазках-отпечатках слизистой толстого кишечника в РИФ, накопления и длительности персистенции антигенов шигелл в слизистой у больных острым и затяжным течением шигеллёзов Флекснера и Зонне. Отсутствуют данные по сопоставлению уровней антигенов в кишечнике и крови. Не найдено данных о связи уровней сывороточных анти-ЛПС- антител IgA-, IgM- и IgG- изотипов с тяжестью течения, клиническим вариантом и наличием бактериологического подтверждения диагноза при шигеллёзе. Отсутствуют данные о роли сывороточных О- антител в формировании затяжного течения заболевания и бактерионосительства. Разноречивы данные об уровнях ЦИК у больных шигеллёзами в зависимости от тяжести течения заболевания, клинического варианта и у больных с затяжным течением. Уточнению и получению новых данных, касающихся вышеперечисленных вопросов, посвящено настоящее исследование.
Из большого количества предложенных для диагностики шигеллёзов методов, по нашему мнению, с учётом всех преимуществ особого внимания заслуживают следующие:
1.РИФ с мазками-отпечатками слизистой толстого кишечника как высокочувствительный, специфичный, простой и доступный метод выявления антигенов шигелл в толстом кишечнике больных. РИФ может быть использована для экспресс- диагностики дизентерии в различные периоды заболевания и в научных исследованиях.
2.РИГА с антительными диагностикумами как простой и доступный метод выявления антигенов шигелл в крови, обладающий достаточной чувствительностью и специфичностью.
З.РИФ с ПЭГ-осаждёнными ЦИК крови как высокочувствительный, специфичный, простой и доступный метод выявления антигенов в крови в связанном виде для решения задач диагностики и научных исследований.
4.ИФА- как высокочувствительный, специфичный и точный автоматизированный метод определения антител различных изотипов для решения задач диагностики и научных исследований.
Значение шигеллёзпых возбудителей и их антигенов в механизме иммунного ответа и воспаления при шигеллёзной инфекции.
Шигеллёз относится к инвазивным заболеваниям слизистой оболочки толстого кишечника человека. Этиологическим фактором заболевания являются шигеллы -грамотрицательные микроорганизмы, принадлежащие к семейству Enterobacteriacea. Работы последних лет внесли новые данные в схему патогенеза бактериальной дизентерии. In vitro было показано, что Sh. flexneri, в отличие от сальмонелл, неспособны проникать через апикальный полюс кишечных эпителиальных Сасо-2 или Т-84 клеток человека/139/. Проникновение происходит только на базалыюй стороне этих клеток. На лабораторных моделях заражения лигированных петель подвздошной кишки кроликов /154,155,192/ и внутригастралыюго заражения обезьян макак Sh. flexneri /179/ установлено, что раннее проникновение шигелл в слизистую толстого кишечника происходит через М клетки пейеровых бляшек (РР ), выполняющие функцию неселективного транспорта антигенов из просвета толстого кишечника к антигенпрезентирующим клеткам лимфоидных фолликулов. После проникновения через эпителиальный барьер инвазивные шигеллы исчезали из фагоцитарной вакуоли М клеток и вскоре трапслоцировались к фагоцитирующим клеткам, ассоциированным с фолликулярными структурами РР /154,155/. В результате инфицирования патогенами макрофагов активировался процесс апоптоза, который приводил к гибели клеток/77,200,201/. Инициация программы клеточной смерти шигеллами в макрофагах индуцировала освобождение ими больших количеств предшественника IL-la и зрелого u in vivo в лабораторных моделях шигеллёзной инфекции /178/ и у больных шигеллёзом людей /167,168/.
Из макрофагов шигеллы диссеминировали в близлежащие энтероциты путём межклеточного распространения или после трансцитоза, или лизиса макрофагов инвазировали энтероциты через их базолатеральный полюс /192/.Выделение больших количеств IL-1 в результате инфицирования и апоптоза макрофагов стимулировало ранний воспалительный ответ, сопровождающийся иммиграцией большого количества лейкоцитов, особенно ПЯЛ, которые , взаимодействуя с антигенами шигелл и подвергаясь активации в очаге воспаления, значительно усиливали каскадный эффект воспаления /154,155/. Мигрируя через эпителиальный слой в просвет кишечника, ПЯЛ повреждали межклеточные соединения эпителиального барьера , позволяя шигеллам инвазировать базолатеральный полюс эпителиальных клеток и завершали таким образом процесс инвазии эпителия патогеном/155/.In vitro показано, что инфицирование эпителиального клеточного монослоя шигеллами является многоэтапным процессом , включающим: 1) адгезию бактерий к клеточной поверхности; 2) проникновение путём индуцированного фагоцитоза; 3) исчезновение из фагосомы, которое завершает процесс проникновения; 4) внутриклеточное размножение ; 5) межклеточное распространение . Факторы вирулентности шигелл принимают непосредственное участие в патогенезе шигеллёза. К основным факторам вирулентности шигелл относят белки, ассоциированные с внешней мембраной, кодируемые плазмидой в 220 кв, отвечающей за инвазивпый фенотип бактерий
Плазмида вирулентности шигелл содержит два главных локуса- регион инвазии и IcsA. Регион инвазии содержит гены, кодирующие четыре секретнруемых Гра белка , среди них Іра В (62 Кда), 1ра С(42 Кда) и Іра Д (38 Кда) считаются инвазинами шигелл Флекснера, т.е. секретирусмыми белками, которые при контакте с поверхностью эукариотической клетки запускают фагоцитарный процесс /136/ и затем осуществляют лизис мембраны вакуоли /107/, т.е. являются главными эффекторами в процессе проникновения. Антигены инвазии шигелл также значительно усиливают апикальный захват бактерий М клетками /154/ и участвуют в адгезии шигелл к эпителию /150/. Кроме того, Іра белки отвечают за лизис мембраны фагосомы макрофага и индукцию их апоптоза шигеллами /200/. Наконец, Іра белки обуславливают индукцию деграпуляции нейтрофилов при их контакте с шигеллами /172/. IcsA белок отвечает за внутриклеточное и межклеточное распространение шигелл /65/. IcsA белок локализуется во внешней мембране на одном полюсе бактерии, где он катализирует полимеризацию актина клетки хозяина.
Клиническая характеристика обследованных больных дизентерией флексиера и зонне
Проведено клинико-лабораторное обследование 165 больных дизентерией. Диагноз дизентерии устанавливался на основании клинико-эпидемиологических данных и был подтверждён бактериологическим и/или серологическими методами исследования, что позволило выделить 2 группы больных острой дизентерией-Флекснера (101 чел.) и Зонне (64 чел.).
В группе больных дизентерией Зонне бактериологическое подтверждение составило 70,3%, дизентерией Флекснера-31,7%. Результат бактериологического подтверждения диагноза острой дизентерии в общей группе больных составил 46,7%. Помимо бактериологического метода проводилось серологическое исследование по выявлению специфических антител в РПГА. Специфические антитела в РПГА в диагностических титрах выявлялись при дизентерии Флекснера в 39,4 %, при дизентерии Зонне-в 40,7 %. В работе использовалась клиническая классификация шигеллезов, изложенная в методических рекомендациях В.И.Покровского (1991). Распределение больных по возрасту и полу представлено в табл. 1. Как видно из таблицы, острая дизентерия Зонне диагностирована у 64 больных, острая дизентерия Флекснера-у 101 больного.
В группе больных дизентерией Зонне распределение мужчин и женщин было одинаковым. В группе больных дизентерией Флекснера преобладали мужчины (64,4%). По возрастной структуре в обеих группах заболевание приходилось в основном на возраст до 40 лет ( 84,4% и 80,2%, соответственно).
Среди больных острой дизентерией Флекснера выделялась группа из 20 человек с затяжным течением болезни, в связи с чем при обсуждении степени тяжести ( табл. №2) и частоты встречаемости симптомов ( табл. №3) при острой дизентерии она рассматривалась отдельно.
Частота выявления О-антигенов возбудителя ( в РПГА ) при дизентерии Зонне и Флекснера и их диагностическая значимость
При дизентерии Зонне в острый период заболевания О-антигены выявлены лишь у 4 (6,2+3,0%) больных (Рис 1.), в группе бактерионосителей О-антиген обнаружен лишь у 2 больных, что составило 18,2±11,6%. При дизентерии Флекснера частота выявления О-антигена составила 58,0+5,5% в острый период, 85,7±13,2% - у больных с формирующимся бактерионосительством и 45,0±11,1% - при затяжном течении дизентерии.
Установлена закономерность частоты выявления специфических О-антигенов в различные сроки заболевания и при бактерионосительстве .
У больных острым течением дизентерии Флекснера частота выявления О-антигенов шигелл в сыворотках крови была максимальной на I неделе заболевания (54,3±5,5%), имела тенденцию к снижению со 2-й недели (до 39,5±5,4%) и достоверно снижалась на 3-й неделе болезни ( до 34,4±6,1%); (р 0,05). На 4-5 и 6-й неделях болезни О-антиген обнаруживался лишь в 25,9±6,0 - 22,2±5,6% случаев. При затяжном течении дизентерии Флекснера частота выявления О-антигенов шигелл колебалась от 45„0±11,1 до 29,4±11,0%.
Содержание специфических О-антител Ig A, Ig М и IgG изотипов в сыворотках больных острой дизентерией Зонне и Флекснера
Результаты исследования уровня 0-антител к ЛПС Флекснера в сыворотках больных ОД Флекснера в зависимости от тяжести течения процесса и его исходов представлены в табл.12 и па рис.6. Острая дизентерия характеризовалась наличием сывороточных специфических 0-антител всех 3-х изотипов. У больных лёгким течением болезни уже на I неделе заболевания выявлялся достоверно более высокий по сравнению с контролем уровень специфических 0-антител всех изотипов(р 0,001; р 0,001; р 0,001- для IgA-, IgM-u IgG 0-антител, соответственно), максимальное количество которых определялось уже на I неделе заболевания. В последующие сроки исследования ( на III-IY неделе ) сохранялись повышенные уровни IgM-u IgG-O- антител и лишь IgA-O-антитела достоверно снижались на IY неделе ( р 0,05 ), превышая показатели контроля(р 0,001).
Содержание циркулирующих иммунных комплексов у больных дизентерией Зонне и Флекснера
Изучение уровней ЦИК у больных шигеллезами осуществляли с помощью осаждения ПЭГ по методу Дижона в динамике заболевания. Обследован 71 больной острой дизентерией Флекснера, в том числе 7 больных с исходом в реконвалесцептное бактерионосительство и 18 больных - с затяжным течением дизентерии. Исследованы сыворотки 61 больного острой дизентерией Зонне, из которых у 11 отмечалось формирование бактерионосительства.
Анализ уровней и динамики циркулирующих иммунных комплексов в зависимости от тяжести течения и исходов заболевания при острой дизентерии Флекснера представлен в таблице 21 и на рис.9.
У больных лёгким и средне-тяжелым течением болезни содержание ЦИК на 1-ой неделе заболевания в 3,5 - 3,8 раза превышало показатели контроля (р 0,001). На 2-ой неделе отмечалась лишь незначительная тенденция к повышению уровней ЦИК у больных легким течением и их значительное нарастание у больных средне-тяжелым течением (р 0,05 ). С 3-й недели заболевания уровень ЦИК у больных данных групп достоверно снижался ( Р 0,01 и Р 0,001, соответсвешю).На 4-ой неделе заболевания уровень ЦИК продолжал снижаться (тенденция), однако все еще превосходил показатели контроля ( Р 0,01 и Р 0,001,у больных средне-тяжёлым и лёгким течением, соответственно).
Таким образом, различий в уровнях ЦИК у больных средне-тяжелым и легким течением не отмечалось. Тяжелое течение сопровождалось накоплением в крови ЦИК с 1-ой недели заболевания, достигающих максимальных показателей на 3-й неделе ( Р 0,01-по сравнению с 1-й неделей) с последующим сохранением их уровней па 4-й педеле. Показатели 1-й недели были достоверно ниже по сравнению с легким и средне-тяжелым течением ( Р 0,05 ), а 3 - 4 недели - выше ( Р 0,05- но сравнению с легким течением ). Иными словами, тяжелое течение сопровождалось постепенным накоплением ЦИК и длительным их сохранением в периоде реконвалесценщш.
