Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 13
1.1 Повторные ОРЗ у детей - медикосоциальная проблема 13
1.2 Состояние иммунной системы у детей, повторно болеющих ОРЗ 18
1.3 Микробиота ротоглотки и кишечника и ее метаболическая активность у повторно болеющих ОРЗ детей 19
1.4 Комплексный подход к лечению и профилактике респираторных инфекций у повторно болеющих детей 33
Собственные исследования
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 40
2.1 Дизайн исследования 40
2.2 Наблюдавшийся контингент пациентов 42
2.3 Характеристика пробиотиков и условия их назначения у повторно болеющих ОРЗ детей 46
2.4 Методы исследования 51
ГЛАВА 3 Клиническое состояния и лабораторные показатели повторно болеющих ОРЗ детей в межморбидном периоде 57
3.1 Клинико-лабораторные показатели повторно болеющих ОРЗ детей в межморбидном периоде 57
3.2. Качественно-количественный состав и метаболическая активность микробиоты ротоглотки у повторно болеющих ОРЗ детей в межморбидном периоде 61
3.3 Качественно-количественный состав и метаболическая активность микрофлоры кишечника у повторно болеющих ОРЗ детей в межморбидном периоде 64
3.4 Состояние иммунитета (мукозального, клеточного, фагоцитарной активности нейтрофилов) и его взаимосвязь с метаболической активностью микрофлоры у повторно болеющих ОРЗ детей в межморбидном периоде 68
3.5 Особенности микробиологических нарушений у детей с отягощенными факторами анамнеза в межморбидном периоде ОРЗ 74
ГЛАВА 4 Клинико-лабораторная характеристика острого периода респираторного заболевания с поражением нижних отделов дыхательного тракта у повторно болеющих детей 80
4.1 Динамика течения острого периода ОРЗ с поражением нижних отделов дыхательного тракта у повторно болеющих ОРЗ детей 80
4.2 Состояние мукозального иммунитета у детей с повторными ОРЗ в остром периоде респираторного заболевания 81
4.3 Состояние микрофлоры ротоглотки у повторно болеющих ОРЗ детей в остром периоде респираторного заболевания 83
4.4 Состояние микрофлоры кишечника у повторно болеющих ОРЗ детей в остром периоде респираторного заболевания 91
4.5 Особенности метаболической активности микрофлоры в остром периоде респираторного заболевания у детей в зависимости от отягощающих факторов анамнеза 99
ГЛАВА 5 Эффективность применения пробиотиков у повторно болеющих ОРЗ детей в различные периоды наблюдения 109
5.1 Эффективность применения пробиотиков у повторно болеющих детей в комплексе оздоровительных мероприятий в межморбидном периоде 110
5.2 Эффективность применения пробиотика у повторно болеющих детей в остром периоде респираторного заболевания 147
Заключение 161
Выводы 182
Практические рекомендации 184
Перспективы дальнейшей разработки темы 185
Список сокращений 186
Список литературы
- Микробиота ротоглотки и кишечника и ее метаболическая активность у повторно болеющих ОРЗ детей
- Наблюдавшийся контингент пациентов
- Качественно-количественный состав и метаболическая активность микрофлоры кишечника у повторно болеющих ОРЗ детей в межморбидном периоде
- Состояние мукозального иммунитета у детей с повторными ОРЗ в остром периоде респираторного заболевания
Введение к работе
Актуальность проблемы. Острые респираторные заболевания (ОРЗ) являются одной из важнейших медико-социальных проблем во всем мире (А.Ю. Попова 2016, G.M. Allan 2014). В России ежегодно регистрируется более 50 миллионов случаев ОРЗ, обуславливая значительные экономические затраты (Ю.В. Лобзин 2015, В.К. Таточенко 2015).
Число педиатрических пациентов с частыми повторными ОРЗ остается по-прежнему высоким (до 70% в детской популяции), внося значительный вклад в общую заболеваемость (А.Л. Заплатников 2015, М.Г. Романцев 2010).
Среди многочисленных причин, обуславливающих повторную заболеваемость ОРЗ у детей, в последние годы уделяется основное внимание иммунной дезадаптации и микроэкологическим нарушениям (В. И. Бессикало 2016, З.С. Макарова 2014 M. El-Azami-El-Idrissi 2013). Исследования показали, что принципиальное клиническое значение имеет не количество отдельных популяций Т-лимфоцитов или симбионтных бактерий, а функциональная активность клеток иммунной системы и бактериальных видов в составе микрофлоры. Предложенный в последние годы метод исследования функциональной активности микрофлоры с определением коротко-цепочечных жирных кислот (КЖК) может обеспечить новый взгляд на характер ее изменений и их роль в формировании респираторной заболеваемости у детей (М.Д. Ардатская 2014, О.Н. Минушкин 2013). Комплексный подход, включающий изучение иммунного реагирования и состояние функциональной активности микробиологических локусов у повторно болеющих ОРЗ детей, ранее не применялся. За последние годы накоплен большой опыт применения иммуномодулирующей терапии, разработанный и внедренный преимущественно у детей дошкольного возраста (Л.С. Намазова-Баранова 2015, В.Ф. Учайкин 2014, С.А. Ляликов 2013). Несмотря на достигнутые успехи, принципиально снизить заболеваемость ОРЗ не удается. Дети старшего возраста незаслуженно обделены вниманием, хотя проблема для них также актуальна. Необходим поиск новых подходов, учитывающих наличие сопутствующей патологии.
В этой связи перспективным является применение пробиотиков как с профилактической, так и с лечебной целью, в том числе за счет доказанной их иммунотропной активности (Л.В. Феклисова 2015, Q. Hao 2015, B.R. Dong 2015, T. Wu 2015). Однако остается неизученной взаимосвязь профилактического эффекта пробиотиков с функциональной активностью иммунных клеток и микрофлоры различных локусов в остром периоде ОРЗ и межморбидном периоде.
Новый подход к оценке состояния микрофлоры пациентов с изучением метаболической функции биотопа позволит обосновать перспективные профилактические направления использования пробиотиков. Изучение роли сочетаний отягощающих факторов на состояние метаболической активности микрофлоры различных локусов может определить их влияние и дать возможность для разработки персонифицированной тактики лечения повторно болеющих ОРЗ детей.
Степень разработанности темы: на современном этапе доказана роль микрофлоры в развитии целого ряда хронических заболеваний у детей (R. Shamir 2015, A.B. Shreiner 2015, I.Vandenplas 2014). Установлено, что клиническое значение имеет нарушение соотношения различных популяций бактерий в микробиоме. Работы последних двух десятилетий свидетельствуют о влиянии кишечных комменсалов на формирование различных иммунных механизмов, обеспечивающих противоинфекционную защиту организма человека (F. Purchiaroni 2015, 2015). Подавляющее большинство результатов исследований основывается на изучении качественно-количественного состава микрофлоры и количественного определения соотношения популяций иммунных клеток, а не их функциональной активности (J. Qin 2011, A. Heger 2010, E. Cevenini 2010). В этой связи необходимо использование методов, позволяющих судить о функциональной активности микрофлоры (G. Besten 2013, V. Buccigrossi 2013) и ее возможной ассоциации с респираторной патологией 2015, 2015, T. Wu 2015).
Основным методом коррекции микрофлоры является применение пробиотиков (A. Guarino 2014, I. Hojsak 2014). Пробиотическая терапия включена в руководящие принципы лечения и профилактики острых кишечных инфекций у детей и антибиотик-ассоциированной диареи (M. Lentze 2015, A. Guarino 2014). В последнее время появились обнадеживающие клинические доказательства эффективности пробиотиков в лечении и профилактике ОРЗ (Q. Hao 2015, B.R. Dong 2015, S. Weichert 2012). Однако результатов клинических исследований недостаточно для рекомендаций их использования в рутинной практике инфекционистов.
Цель исследования: разработать тактику применения пробиотиков для лечения и профилактики ОРЗ у повторно болеющих детей, на основании изучения изменений функциональной активности различных звеньев иммунной системы и микробиоты ротоглотки и кишечника.
Задачи исследования:
1.Оценить клинико-лабораторные показатели детей 7-11 лет с повторными ОРЗ в
межморбидном периоде.
2.Изучить состояние микрофлоры задней стенки ротоглотки и кишечника классическим
бактериологическим и методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) у повторно болеющих
ОРЗ детей в остром и межморбидном периоде.
3.Изучить показатели клеточного, мукозального и фагоцитарного звена иммунитета у
повторно болеющих ОРЗ детей.
4. Определить влияние недавно перенесенного ОРЗ, хронической гастроэнтерологической
патологии (ХГЭП) на состояние метаболической активности микрофлоры ротоглотки и
кишечника.
5.Изучить эффективность и разработать тактику применения пробиотиков у повторно
болеющих ОРЗ.
Научная новизна исследования
Впервые показано, что в остром периоде и периоде реконвалесценции ОРЗ
обнаруживается значительное угнетение функциональной активности кишечной
микрофлоры, главным образом, продукции масляной кислоты, что негативным образом влияет на тканевое энергообеспечение и восстановление иммунных реакций.
В остром периоде ОРЗ определена различная направленность микробиологических изменений микрофлоры ротоглотки при пневмонии и бронхите (угнетение всех популяций бактерий при пневмонии и активация аэробной флоры при бронхите), взаимосвязанная с выраженностью воспалительного процесса.
Впервые показаны аспекты патогенетической роли изменений метаболической активности микрофлоры ротоглотки в развитии респираторных инфекций нижних дыхательных путей у детей. У повторно болеющих ОРЗ детей в межморбидном периоде обнаружены увеличение функциональной активности протеолитической микрофлоры и маркеры присутствия токсических метаболитов симбионтных бактерий в ротоглотке и кишечнике.
Впервые у повторно болеющих ОРЗ детей в межморбидном периоде выявлен функциональный дефицит активности иммунных клеток, обеспечивающих реакции адаптивного иммунитета, а именно – обнаружены низкий уровень экспрессии активационного маркера HLA-DR на фоне умеренного субпопуляционного дисбаланса Т-лимфоцитов, а также сопутствующее существенное снижение фагоцитирующей активности нейтрофилов.
Доказано негативное влияние ведущих клинически значимых факторов (ХГЭП, недавно перенесенное ОРЗ) на метаболическую активность симбионтных бактерий ротоглотки и кишечника.
Патогенетически обосновано применение пробиотиков у повторно болеющих ОРЗ детей в межморбидном и остром периодах. Доказан положительный профилактический эффект сорбированного пробиотика и комплекса пробиотических штаммов с витаминно-минеральным премиксом на сокращение частоты и тяжести повторных эпизодов ОРЗ в течение не менее трех месяцев эпидемического сезона. Клинический эффект ассоциирован с восстановлением функциональной активности симбионтных бактерий и клеток иммунной системы.
Теоретическая и практическая значимость исследования
1.В ходе диссертационного исследования установлены корреляционные взаимосвязи нарушений качественно-количественного состава, метаболической активности микрофлоры ротоглотки и кишечника и иммунного ответа.
2. Представлено патогенетическое обоснование применения пробиотиков длительностью курса 3 недели в составе комплексной терапии для сокращения частоты и тяжести ОРЗ, так как их клиническая эффективность сочеталась с коррекцией функциональных нарушений микрофлоры и иммунитета.
-
Выделены клинически значимые факторы, влияющие на состояние повторно болеющих детей, и контингенты, нуждающиеся в дополнительных корригирующих мероприятиях в остром и межморбидном периоде, а именно: пациенты с ХГЭП, ОРЗ, перенесенным за предшествующие два месяца. Определены особенности изменений метаболической активности микрофлоры ротоглотки и кишечника у различных контингентов повторно болеющих детей.
-
Определено, что при ОРЗ развивается дефицит функциональной активности микрофлоры кишечника, сопровождающийся активацией протеолитической микрофлоры, способной, в свою очередь, повреждать эпителий. Обоснована необходимость применения пробиотиков в остром периоде респираторного заболевания.
-
Выявлена различная направленность изменений микробиоты ротоглотки в остром периоде ОРЗ в зависимости от глубины воспалительного процесса (при пневмонии и бронхите).
-
Разработана схема оздоровления повторно болеющих детей с применением пробиотиков в остром и межморбидном периоде.
Методология и методы исследования. В ходе диссертационного исследования осуществлено последовательное применение общенаучных и специальных методов научного познания. Работа выполнена в соответствии c поставленной целью и задачами, для решения которых были использованы современные клинико-лабораторные, инструментальные, аналитические и статистические методы.
Личное участие соискателя в получении результатов состоит в том, что автором выполнены: подбор и наблюдение пациентов, сбор материалов для лабораторных исследований, создание базы данных, статистический анализ и оценка полученных результатов с определением их научной и клинической значимости, оформление работы.
Положения, выносимые на защиту:
Для повторно болеющих ОРЗ детей характерно изменение функциональной активности микрофлоры, а именно: глубокий дефицит маслянокислого брожения и активация строгих протеолитических бактерий в ротоглотке и кишечнике.
Для повторно болеющих ОРЗ детей характерно взаимообусловленное взаимодействие изменений функциональной активности микрофлоры и иммунной системы.
Применение пробиотиков в межморбидном и остром периодах ОРЗ способствует сокращению частоты и тяжести респираторных заболеваний за счет восстановления метаболической активности и состава микробиоты.
Достоверность выводов и рекомендаций обусловлена репрезентативностью групп включенных в исследование пациентов, достаточным объемом выборки, рандомизацией исследуемой когорты, использованием современных методов исследования и статистической обработки, комплексным подходом к научному анализу.
Внедрение результатов работы в практику. Полученные данные внедрены в практику детского инфекционного отделения ГБУЗ МО МОНИКИ им М.Ф. Владимирского, детского инфекционного отделения ДГКБ св. Владимира ДЗМ, ФГБУЗ ЦКС «Малаховка»
ФМБА России, используются во время подготовки врачей на курсе детских инфекционных болезней при кафедре педиатрии ФУВ ГБУЗ МО МОНИКИ им М.Ф. Владимирского. Получен патент на изобретение №2608548 «Способ дифференциальной диагностики острого бронхита и острой пневмонии» от 19.01.2017 года. Опубликовано 20 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Апробация работы. Материалы исследования доложены на VII, VIII Ежегодном
Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, XIV Конгрессе детских
инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и
вакцинопрофилактики» (2015); на VI Всероссийской научно-практической конференции «Инфекционные аспекты соматической патологии у детей» (2012); Междисциплинарной научно-практической конференции «Микробиологические аспекты диагностики и лечения заболеваний органов дыхания у детей и взрослых» (2013); Научно-практической конференции врачей-бактериологов Москвы и Московской области «Микробиологические аспекты диагностики и лечения воспалительных заболеваний ЛОР органов и органов дыхания» (2013), заседании научно-практического общества инфекционистов Московской области и заседании инфекционной секции научно-практического общества педиатров г. Москвы (2016).
Диссертация апробирована на совместной конференции сотрудников детского инфекционного и педиатрического отделений, кафедры педиатрии ФУВ ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, кафедры педиатрии ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава РФ, ДГКБ Св. Владимира (протокол №16) 16 сентября 2016 г., а также на заседании Апробационного совета ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора 15 декабря 2016 года.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, шести глав, включающих обзор литературы, описание клинического материала и методов обследования, трех глав собственных исследований, а также из обсуждения полученных результатов, выводов и практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 210 страницах машинописного текста. Указатель литературы содержит 135 отечественных и 73 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 62 таблицами, 21 рисунком и двумя выписками из историй болезни.
Микробиота ротоглотки и кишечника и ее метаболическая активность у повторно болеющих ОРЗ детей
Исследования последних лет убедительно доказали, что микрофлора организма представляет собой динамическую микроэкологическую систему, характеризующуюся единством и способностью к саморегуляции, и является интегральной частью организма хозяина [1,6,24,105-107,111-113,125,144]. Ряд авторов отводит микробиоте роль «незаслуженно обделенного невидимого метаболического органа» [1,106,112,125].
При трактовке результатовбактериологического исследованияпредложено условное подразделение микробиоты, в зависимости от показателя постоянства микробного вида на: резидентную (облигатная, автохонная или индигенная), встречающуюся более чем в 50% случаев, добавочную (факультативная, аллохтонная) - 25-50%, и случайную (транзиторную), менее чем в 25% случаев[1,2,112]. В организме человека микроорганизмы расселяются неравномерно: около 20% микробиоты обитают в полости рта, до 16% - в ротоглотке,40% - в различных отделах ЖКТ, до 18-20% - на кожных покровах, до 4% в урогенитальном тракте у мужчин и около10% в вагинальном биотопе женщин [1,2, 111-113,124-126,144,150]. Микробные экосистемы в организме человека распределяются от ротоглотки до дистальных отделов толстого кишечника (вертикально), так и от просвета до различных слоев слизистой оболочки (горизонтально) [1,2,7,133,134,144].
Метагеномные исследования последних лет показывают, что видовой и генетический состав бактерий различных локусов, особенно кишечника, у детей достаточно разнообразен и усложняется по мере взросления [105-107,124-126,144,150,151]. Микробные экосистемы слизистых ребенка развиваются постепенно в процессе сукцессии, заканчиваясь формированием относительно стабильного микробиоценоза у взрослого человека [1,2,150,170,171].
Взаимодействие микробиоты и организма осуществляется по принципу мутализма [107,112,177] и метаболической интеграции [124-126,161,165,170].
Показано, что микробиоценоз опосредованно выполняет различные функции макроорганизма, влияя на жизнедеятельность и здоровье человека [1,159,161,165-167,171]. Ряд важнейших функций, выполняемых микрофлорой можно подразделить на 3 основные: метаболическая, иммуномодулирующая и трофическая [165-167,169-171,177,179,190-192]. За счет метаболической функции микрофлоры поддерживается энергетический баланс организма человека, метаболиты микробиоты активно участвуют в иммуномодуляции, регуляции экспрессии генов, нейротрансмиссии и других регуляторных и сигнальных процессах [177,179,189,198]. Установлено, что микробиому, принадлежит физиологический феномен — обеспечивать неспецифическую резистентность, принимать активное участие в формировании иммунитета и поддержании его в состоянии адаптации [1,2,180,184]. Состояние микрофлоры определяет вероятность развития и прогрессирования инфекционного процесса в конкретном локусе макроорганизма [2,7,171,180,185,189]. Доказано, что нормобиота регулирует мукозальный иммунитет - рецепторы врожденного иммунитета контролируют запуск цитокинового каскада местной и антиинфекционной резистентности, приводящей к запуску воспалительной реакции и иммуноглобулинового звена [1,2,42,185,189,198]. Микробиота является универсальным иммуномодулятором, выполняющим как иммуностимулирующие, так и иммуносупрессивные функции [36,107,112148,152,189,191].
В литературе представлены достаточное большое число работ, посвященных изучению микрофлоры при ОРЗ классическим бактериологическим методом. Тем не менее, по-прежнему, отсутствует единый взгляд на критерии нарушений микрофлоры ротоглотки, хотя представленные данные существенных различий не имеют [1,2,25,26,30,34,43,144,179,196,205.].
На основе многолетних бактериологических исследований разработаны критерии диагностики дисбиоза ротоглотки [1,2,25]. Выделяют облигатные микроорганизмы: и - гемолитические стрептококки (105-106КОЕ/мл) нейссерии (104-107 КОЕ/мл), лактобациллы и бифидобактерии (102-106 КОЕ/мл) [12,25,26]. В составе факультативной микрофлоры допустимо выделение в небольшом количестве (10КОЕ/мл) коагулазоотрицательных стафилококков, непатогенных типов гемофильной палочки и нетоксигенных видов коринобактерий в пределах 5-46%. В единичных случаях в количестве 102 -103 КОЕ/мл могут обнаруживаться микроорганизмы транзиторной группы - энтеробактерии, псевдомонады, -гемолитические стрептококки групп В, энтерококки и дрожжеподобные грибы. У 46,6% клинически здоровых детей выявляют один вид условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) у 10% - ассоциации из двух видов. Выявление монокультур, обнаружение представителей транзиторной микрофлоры в значительных количествах (104 КОЕ/мл) и их ассоциаций, а также полное отсутствие роста микроорганизмов относят к глубоким дисбиотическим нарушениям. По данным Воропаевой Е.А., Метельской В.А., Алешкина В.А., выделение УПМ в титре 106 КОЕ/мл и выше при наличии клинических изменений в ротоглотке, свидетельствующих о воспалительном процессе, данный микроорганизм можно рассматривать как возможный этиологический агент [83].
Слизистые респираторного тракта постоянно подвергаются воздействию различных вирусных и бактериальных антигенов, аллергенов и других чужеродных веществ. Особенностью данного локуса является его открытость и возможность обнаружения в нем микроорганизмов, относящихся как к микрофлоре респираторных путей, так и желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) [1,2,25,144,196]. Обеспечение барьерной функции достигается за счет колонизационной резистентности, включающей комплекс факторов местного иммунитета: ингибиторы микробной адгезии, биоцидные и биостатические продукты секретов, муцин, лизоцим, лактоферрин, биоценоз, механические факторы, антитела. Характер местного воспалительного процесса, по мнению ряда авторов, зависит от факторов колонизационной резистентентности, основным из которых является эубиоз слизистой ротоглотки и его метаболическая активность [189,190,196]. Доказано, что секреторный иммунитет, занимающий центральное место в неотложной защите слизистых оболочек верхних дыхательных путей непосредственно зависит от состояния микрофлоры, колонизирующей слизистые оболочки [1,47,78,52,75,76,189,190,205,207]. Как и в любом биотопе, основная роль обеспечения местного иммунитета слизистой ротоглотки принадлежит постоянным видам бактерий [1,2,25,26,48]. Воздействие различных факторов на слизистую ротоглотки сопровождается развитием дисбиоза, при котором снижается количество постоянных обитателей и увеличивается содержание УПМ и добавочных микроорганизмов [44,45,47,83144,184]. При нарушении симбиоза микрофлора-макроорганизм уменьшается устойчивость слизистой к адгезии и увеличивается риск колонизации микрофлоры, и реализация ее патогенных свойств [1,2,26]. Достижение определенного уровня микробных клеток в колонии, приводит к увеличению их функциональная активность и повышает вероятность реализации их патогенных свойств, изменению конечных продуктов метаболизма, что приводит к запуску инфекционного воспаления, способствуя в дальнейшем распространению воспаления [144,154,166,184,200].
Наблюдавшийся контингент пациентов
Микробиологические методы исследования проведены в лаборатории группы диагностики анаэробных инфекций ФГУН МНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского (зав.лабораторией - к.б.н. Е.А. Воропаева), эпидемиологии и диагностики кишечных инфекций (рук. – к.м.н. Л.В.Пожалостина) и лаборатории клинической микробиологии ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского (зав. – к.м.н. Е.В. Русанова). Качественно-количественное исследование микробиоты слизистой ротоглотки исследовано у 203 больных в мазках, взятых со слизистых оболочек задней стенки глотки и миндалин. Результаты сравнивались с показателями здоровых детей [31,34,36]. Качественно-количественное исследование микрофлоры фекалий по методу Р.В. Эпштейн-Литвак выполнено у 183 детей [250]. Для оценки показателей использовали данные отраслевого стандарта «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» [43]. Нижней границей референсного интервала общего количества бифидобактерий считали 109 КОЕ/г, лактобацилл – 106 КОЕ/г, кишечных палочек (ОККП) - 107КОЕ/г.
У 68,4% проведена оценка показателей иммунитета с изучением клеточного звена иммунитета (53,5%) и определения системы фагоцитоза в межморбидном периоде. Изучение фагоцитарной функции нейтрофилов проводили стандартной методикой с музейным штаммом Staphylococcus aureus 209Р с определением фагоцитарной активностинейтрофилов через 30 минут и 120 минут инкубации (ФА через 30 и ФА через 120 минут для оценки отсроченного эффекта активности процесса — % клеток вступивших в фагоцитоз от общего их числа) и фагоцитарного индекса (ФИ30 и ФИ120 мин — среднее число бактерий захваченных фагоцитами). Индекс переваривания (ИП) рассчитывали по формуле: ИП= (ФИ120 мин-ФИ 30 мин)/ФИ 30 мин) 100. Исследования проведены в лаборатории клинической микробиологии ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского (зав. – к.м.н. Е.В. Русанова) на аппарате АТСС № 6538 (Staph.aureus –для определения фагоцитарной активности нейтрофилов). Оценка результатов проводилась в сравнении с возрастными нормативами.
Численность основных субпопуляций лимфоцитов методом трехцветной проточной цитометрии определена у 68 детей в межморбидном периоде (прибор Cytomix FC-500, Beckman Coulter, реагенты Beckman Coulter): уровень лимфоцитов (CD45+), В-лимфоцитов (CD45+, CD19+), Т-лимфоцитов (CD45+, CD3+), ТH клеткок (CD45+, CD3+, CD4+), цитотоксических Тc-клеток (CD8+), регуляторных Тreg-клеток(CD4+ CD25+), природных клеток-киллеров (CD45+, CD56+, CD16+), активированных Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR, CD45+, CD69+), оценена экспрессия CD 69 в качестве маркера ранней активации, иммунорегуляторного индекса (соотношение ТH/Тs - CD45+, CD4+/ CD8+). У 165 пациентов пределено содержание иммуноглобулинов IgA, IgM, IgG, Sc в слюне (реакция иммунодиффузии в геле по Манчини) в иммунологической лаборатории ФГУН МНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского (к.б.н. Н.С. Матвиевская). Показатели сравнивали с таковыми у здоровых детей (IgG - 0,09 мкг/мл, IgM – 0 мкг/мл, IgA – 0,252 мкг/мл, sIgA – 0,43 мкг/мл [25].
Вирусологическое исследование мазка из носа методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) для расшифровки этиологии вирусных инфекций (грипп, парагрипп, респираторно-синициальная инфекция, метапневмовирусная инфекция, аденовирусная инфекция) проведено двукратно 60 детям в остром периоде ОРЗ, находящимся на стационарном лечении, в иммунологической лаборатории ФГУН МНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского (к.б.н. Н.С. Матвеевская). Оценка метаболической активности микрофлоры ротоглотки и кишечника произведена у 203 детей (однократно у 38 детей, двукратно у 165 (всего 718 анализов) методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с определением КЖК в слюне и фекалиях с использованием аппаратно-программного комплекса для медицинских исследований на базе хроматографа «Хроматек-Кристалл 5000» (Гос. реестр средств измерений №18482-08. Сертификат RU.С.39.004.А. №31051, О.А. Иконников и др. Патент РФ №9910669/12) в микробиологической лаборатории эпидемиологии и диагностики кишечных инфекций (рук. – к.м.н. Л.В.Пожалостина) ФГУН МНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского.
При изучении состояния метаболической активности локуса макроорганизма в хроматограмме принято оценивать следующие показатели: абсолютные концентрации С2, С3, С4, iС4, С5, iС5, капроновой (С6), изокапроновой (iС6) кислот [13,57,81]. Общий уровень КЖК (ОУ КЖК) - суммарное содержание КЖК позволяет судить об интегральной активности микрофлоры, а его увеличение или снижение говорит о соответствующих изменениях в ферментативной активности и численности бактерий биотопа. Оцениваются расчетные показатели – анаэробный индекс (АИ) и индекс изокислот (ИИ). АИ рассчитывается как отношение суммы концентраций С3, С4, С5, С6, и изо-форм КЖК (iС4,iС5,iС6) кислот к концентрации С2. Значение АИ используют как показатель инфраструктуры микробиоценоза – соотношения анаэробных и факультативно анаэробных (аэробных) микроорганизмов [57]. ИИ рассчитывается как суммарное соотношение суммы изо-кислот к нормальным кислотам, и характеризует соотношение активности сахаролитической и протеолитической микрофлоры. В профиле КЖК принято рассчитывать относительные доли С2, С3, С4, характеризующие сбалансированность микрофлоры. Установлено, что КЖК находятся в прямой зависимости от возраста, с целью унификации показателей каждый показатель представлен в относительном выражении (в процентах по отношению к референсному значению) [57,81]. В качестве референсных значений были приняты данные О.А. Кондраковой и др. [57]. Низкими абсолютными концентрациями КЖК, АИ, ИИ и iС4/С4, iС5/С5, iС6/С6 считали значения 70% от нормы, а высокими 130% от нормы. Поскольку доли С2-С4 (особенно, С2) в профиле КЖК характеризуются менее значительным индивидуальным разбросом показателей, то снижением (повышением) долей С3 и С4 считали отклонение от нормы более чем на 10%, а С2 – более чем на 5% [57].
Качественно-количественный состав и метаболическая активность микрофлоры кишечника у повторно болеющих ОРЗ детей в межморбидном периоде
В ходе анализа показателей метаболической активности микрофлоры выявлена прямая положительная корреляция между уровнем С4 в слюне и уровнем С4в кале (R=+ 0,311; р 0,05).
Определена прямая корреляция концентрации sIgA и ОУ КЖК в слюне (R= +0,343; р=0,006) и С4 (R=+ 0,341; р=0,02). Нельзя исключить, что в условиях нарушения регенерации эпителия дефицит бактериальных метаболитов за счет снижения энергообеспечения [53] определенным образом влияет на функционирование иммунных клеток не только в кишечнике, но и в ротоглотке. Выявлена прямая положительная корреляционная связь между уровнем В лимфоцитов CD3- CD19+ уровнем ОУ КЖК в слюне (R=+0,296; р 0,05), С4 (R=+ 0,346; р 0,05) и; прямая корреляция уровня IgG в слюне и В лимфоцитов CD3-CD19+ (R=+0,308; р 0,05), IgA (R=+0,205; р 0,05 факторов. При нарушеннии барьерной функции слизистой для снижения вероятности возникновения воспалительного процесса компенсаторно происходит активации клеточного иммунитет.
В ходе анализа нами получены свидетельства взаимосвязи функциональной активности состояния Т-лимфоцитов и метаболической активности микрофлоры кишечника. Выявлено, что ОУ КЖК кала прямо положительно коррелировал с CD3+HLA-DR+ в крови (R=+0,397, р 0,05): низкие значения ОУ КЖК (Ме 70% от нормы) сопровождались снижением уровня экспрессии CD3+HLA-DR+ на Т-лимфоцитах ( 50%), что является признаком нарушенного иммунного гомеостаза и риском развития бактериальной инфекции [132].
Определена корреляция ИИ и NK-клетки (CD3-CD16+CD56+) (R=минус0,301, р 0,05), что может косвенно свидетельствовать о преобладающей активности протеолитических бактерий в микрофлоре кишечника в условиях неадекватного иммунного ответа (нарушенной клеточно-опосредованной цитотоксичности). Существуют свидетельства влияния кишечных бактерий – коменсалов на реализацию иммунного ответа[198]. Согласно полученным при анализе данным подтверждена взаимосвязь микрофлоры кишечника и клеточного иммунитета.
В исследовании подтвежден современный взгляд влияния микрофлоры кишечника не только на адаптивный иммунитет, но и на факторы доиммунного ответа (фагоцитоза). Выявлена прямая корреляция функциональной активности микрофлоры кишечника и функциональной активности нейтофилов. ОУ КЖК в фекалиях прямо коррелировал с ИП (R=+ 0,378, р 0,05). Прямая положительная корреляция определена между ИП и уровнем С4 в фекалиях (R=+0,441, р 0,05), С3 и (R=+ 0,458, р 0,05).
Выше изложенное свидетельствует, о возможном взаимном влиянии функциональной активности микрофлоры и функционального состояния иммунной системы. 3.5. Особенности микробиологических нарушений у детей с отягощенными факторами анамнеза в межморбидном периоде.
Представленные материалы по изучению функционирования механизмов неспецифической иммунной защиты выявили значительный разброс в показателях, что побудило нас рассмотреть их зависимость от коморбидных факторов у повторно болеющих ОРЗ детей. По данным полученным сотрудниками детского инфекционного отделения ГБУЗ МО МОНИКИ им М.Ф. Владимирского у детей с ОКИ, указания в анамнезе на повторные ОРЗ, перенесенное до ОКИ ОРЗ, ХГЭП приводят к более выраженным микробиологическим изменениям в микрофлоре кишечника, и соответственно к длительным срокам течения ОКИ [16,81].
Нами проведено сравнение детей из группы повторно болеющих ОРЗ. Все дети были поделены на 3 подгруппы: повторно болеющие ОРЗ, не имеющие интересующих коморбидных факторов, вторая - повторно болеющие ОРЗ, имеющие ХГЭП. Третья - повторно болеющие ОРЗ, перенесшие ОРЗ в течение двух предшествующих исследованию месяцев.
Качественно количественный состав микрофлоры ротоглотки в подгруппах не отличался. Выявлено, что для подавляющего числа детей характерен дефицит С4 (в 90,0 - 100,0%) в слюне и преобладание микроорганизмов с протеолитической активностью в структуре микрофлоры (высокий ИИ регистрировался в 86,4 – 97,0%). У повторно болеющих ОРЗ детей без отягощающих факторов анамнеза регистрировался нормальный уровень С2, низкий С3, С4 в слюне. Протеолитическая микрофлора в основном была представлена продуцентами iC4, iC6.
При сопоставлении групп выявлено, что самые глубокие нарушения регистрировались у повторно болеющих ОРЗ детей, перенесших ОРЗ, а именно: резкая активация протеолитических анаэробов и увеличение концентрации iC4/С4 (маркера воспалительного процесса) в слюне. Указанные изменения могут свидетельствовать об определенных метаболических преимуществах протеолитических бактерий в условиях воспаления. И сохранении глубоких нарушений в микрофлоре в течении двух месяцев после перенесенного ОРЗ. Определено, что изменения в микрофлоре ротоглотки у детей с ХГЭП, были связаны с угнетением продуцентов С3 и С4 - факторов, при которых повышается адгезия и инвазия микроорганизмов к слизистой ротоглотки [138,141,143]. В то время как протеолиз у них имел меньшую активацию (табл. 18). Полученные данные могут свидетельствовать об отличительных тригерных механизмах при возникновении клинических проявлений ОРЗ у разных групп повторно болеющих детей.
Состояние мукозального иммунитета у детей с повторными ОРЗ в остром периоде респираторного заболевания
Таким образом, в микрофлоре кишечника у повторно болеющих детей в остром периоде ОРЗ с поражением нижних отделов дыхательного тракта, отмечен глубокий дефицит кишечной микрофлоры до уровня 57-70% от нормы и преобладание протеолитических анаэробных бактерий на фоне выраженного дефицита продуцентов бутирата.
Выявленные изменения следует учитывать при выборе корригирующих мероприятий у повторно болеющих детей в остром периоде респираторного заболевания.
Резюме
Для повторно болеющих детей в остром периоде ОРЗ характерно нарушение мукозального иммунитета, дисбиоз и нарушение функциональной активности микрофлоры ротоглотки и кишечника.
Структурные изменения микрофлоры ротоглотки и кишечника, выявленные у повторно болеющих детей в остром периоде респираторного заболевания, и в динамике болезни, свидетельствовали о выраженных нарушениях в состоянии микрофлоры различных локусов. Изменения характеризовались качественно-количественным снижением облигатной и активации транзиторной микрофлоры, изменением метаболической активности: выраженным дефицитом бутирата (признак повреждения эпителия) и активацией протеолитической микрофлоры (следствие изменения состава субстратов бактериального брожения на фоне воспаления).
В ходе анализа не выявлено существенных различий микрофлоры ротоглотки при использовании классического бактериологического метода у детей с бронхитом и пневмонией за исключением тенденции к более высокой обсемененности энтеробактериями при бронхите.
С помощью метода газожидкостной хроматографии с определением КЖК удалось обнаружить существенные различия в состоянии микрофлоры ротоглотки при бронхите и пневмонии. У детей с бронхитом наблюдались признаки гиперактивации аэробных бактерий, что сочеталось с обсемененностью энтеробактериями на фоне гиперемии ротоглотки при осмотре. У детей с пневмонией отмечен существенный дефицит метаболической функции микрофлоры с преобладанием в структуре микрофлоры строгих анаэробов и существенной активацией бактериального протеолиза, что косвенно отражает глубину поражений дыхательной системы и выраженность воспалительной реакции. Дефицит метаболической активности микрофлоры и главным образом С4, являясь признаком выраженной воспалительной реакции, может быть принят во внимание (при обязательном учете клинической картины болезни) в качестве критерия для решения вопроса о необходимости применения антибактериальной терапии, что особенно важно у пациентов с бронхитом.
У всех повторно болеющих детей в остром периоде респираторного заболевания отмечено нарушение мукозального иммунитета, связанное с отсутствием нормальной дифференцировки эпителия и микробиологическими расстройствами, возникшими в условиях повторяющихся респираторных инфекций. При контакте с новым антигенным раздражителем выявленные изменения усугубляются, что формирует «порочный круг» по заболеваемости ОРЗ у данной кагорты.
Особенности метаболической активности микрофлоры ротоглотки в остром периоде респираторного заболевания c поражением нижних отделов дыхательного тракта(бронхит) у повторно и эпизодически болеющих детей.
На основании полученных достоверных отличий метаболической активности микрофлоры ротоглотки у повторно болеющих детей в сравниваемых группах «пневмония» и «бронхит» для уточнения влияния повторных респираторных инфекций в течение года на изменение метаболической активности проведено сравнение показателей функциональной активности микрофлоры ротоглотки повторно и эпизодически болеющими детьми с ОРЗ с поражением нижних отделов дыхательного тракта (бронхит).
При исследовании метаболической активности микрофлоры ротовой полости в периоде разгара клинических проявлений выявлен значительный разброс показателя общего уровня КЖК от 2,08 до 2624,8 ммоль/мл как у всех детей с бронхитом. Частота обнаружения низких и высоких показателей представлена на рисунке 2, из данных которого видно, что у половины пациентов концентрации основных кислот (С2–С4) были ниже нормы, но продукция изоформ КЖК (главным образом iC4 и iC6) превышала 130% от нормы у большинства пациентов (70–73%). Это свидетельствовало о преобладании протеолитических бактерий над сахаролитическими (рис.2А,В).
В момент госпитализации у всех детей с бронхитом выявлена высокая метаболическая активность и преобладание в микрофлоре ротоглотки аэробных бактерий с протеолитической активностью (табл.29). Обнаружены высокие концентрации С2, нормальные – С3 и низкие – С4, что указывает на преобладание аэробных бактерий (на фоне угнетения продуцентов С4) и подтверждается повышением удельного веса С2 в профиле КЖК и низкими значениями АИ. Выявлено, что у повторно болеющих отмечено достоверно большая активация бактерий с протеолитической активностью (ИИ 152,17 против 104,1 % от нормы р=0,05), прежде всего за счет продуцентов iC4 и iC6 кислот. Для эпизодически болеющих характерна достоверно большая (не выходящая за пределы нормы) активация продуцентов С5 (см.табл.29).