Введение к работе
Актуальность темы. В последние десятилетия во всех странах мира наблюдается рост заболеваемости поверхностными и глубокими микозами. Особенно расширяется спектр грибковых заболеваний, вызванных условно-патогенными грибами Candida, повысилась их роль и в инфекционной патологии центральной нервной системы (ЦНС). Проблема профилактики и лечения кандидоза ЦНС в настоящее время приобрела исключительно важное значение. Учитывая тенденцию к росту заболеваемости кандидозной инфекцией и кандидозным менингитом, в частности, отсутствие достаточного набора эффективных препаратов для лечения этого заболевания, необходимы поиски новых про-тивокандидозных средств и одновременно важным является разработка оптимальных экспериментальных моделей кандидоза. Это в полной мере относится и к моделированию инфекции с преимущественным поражением ЦНС для углубленного изучения активности антимикотиков и оценки возможности их изучения или применения в клинике при кандидозе ЦНС.
Настоящая работа выполнялась в рамках научно-технической программы ГКНТ СССР 0.43.01 "Изыскать новые лекарственные средства, разработать технологию и освоить промышленное производство новых препаратов и их лекарственных форм" на 1980-1985гг. и 1986-1990гг. и Государственной программы РФ по улучшению лекарственного обеспечения и развития фармацевтической промышленности на 1991-1995гг.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось воспроизведение и изучение кандидозной инфекции мышей с преимущественной локализацией процесса в ткани мозга, а также определение возможности применения разработанной модели в химиотерапевтических опытах.
В связи с этим были намечены следующие задачи:
изучить особенности течения инфекции, развивающейся после интрацеребрального заражения мышей различными штаммами C.albicans;
сравнить характер развития инфекции у мышей в зависимости от интрацеребрального или внутривенного заражения;
- г -
разработать критерии оценки развивающегося процесса для создания химиотерапевтической модели;
оценить на данной модели сравнительную активность антими-котиков, применяющихся в клинике для лечения кандидоза;
изучить активность новых оригинальных химических соединений, синтезированных в ЦХЛС-ВНИХФИ.
Научная новизна исследования. Настоящая работа является оригинальным исследованием, посвященным изучению канди-дозной инфекции ЦНС в опытах на мышах с целью разработки химиотерапевтической модели. На разработанной модели кандп-дозного энцефаломенингита мышей впервые проведена экспериментальная оценка активности антимикотпков, применяющихся в клинике, в том числе противогрибковых препаратов производных азола - кетоконазола и итраконазола. Впервые на разработанной модели изучена активность новых оригинальных химических соединений—8 синтезированных в ЦХЛС-ВНИХФИ производных пирролохинолина, тиазолидиндиона и азоиндола, показавших активность в отношении С. albicans в опытах in vitro.
Практическое значение работы. Разработана модель кандп-дозной инфекции мышей с преимущественной локализацией в ткани мозга патологического процесса, сходного с таковым по патоморфологическон картине у человека. Это обосновывает использование модели для изучения особенностей течения канди-дозной инфекции с преимущественным поражением ЦНС. Модель позволяет выявить химиотерапевтическую активность соединений, а также различия в степени эффективности антимико-тиков и новых химических веществ в относительно короткие сроки. Модель рекомендуется для углубленного изучения анти-микотиков, а также новых химических соединений с целью определения их потенциальной активности при кандидозе ЦНС.
Публикации и апробапия работы. По материалам диссертации опубликованы 8 статей и тезисы двух докладов. Материалы экспериментальных исследований и обзор литературы доложены на конференциях молодых ученых и специалистов ЦХЛС-ВНИХФИ в 1982 и 1986 г.г., на международных симпозиумах "Актуальные вопросы медицинской микологии" и "Микозы и иммунодефициты" (г. Санкт-Петербург, 1987 и 1991г.г.).
Стуктура и объем диссертадии. Диссертационная работа изложена на і7О страницах и состоит из введения, обзора литературы, включающего 2 главы, 2 глав собственных исследований, заключения п общих выводов.
Материалы диссертации иллюстрированы 37 рисунками п 33 таблицами. Библиография включает 190 работ.
Животные. Эксперименты выполнены на 3200 белых беспородных мышах обоего пола массой 17±1,0 г.
Штаммы С.albicans. В работе использованы 9 штаммов С.albicans (2 музейных и 7 клинических).
Инфицирование мышей в мозг. Взвесь суточной агаровой культуры в физиологическом растворе вводили в мозг по описанной методике (М.Н.Лебедева и Д.М.Гольдфарб,1944). Область заражения - около средней линии черепа на 2-3 мм выше глазницы.
Развитие инфекционного процесса оценивали по следующим критериям:
а. Визуальное наблюдение за животными. Отмечали выжи
ваемость и суммарную продолжительность жизни животных при
наблюдении до 25-30 суток.
б. Высеваемость С.albicans из организма мышей изучали
через 4 часа, 1 сутки, 3, 6, 8, 9 и 10 суток после интрацереб-
рального заражения. Посевы на среде Сабуро инкубировали при
37 С в течение 48-72 часов. Результаты высеваемости оценива
ли по числу мышей, у которых выделена С. albicans (проанали
зирован материал от 100 животных).
в. Патоморфологическое исследование мозга и внутренних
огранов мышей, зараженных в мозг музейным штаммом №1 и
клиническим штаммом №1755. Изучение морфологических из
менений проведено на 126 животных в динамике на протяжении
10 суток после заражения, у отдельных выживших мышей - на
30-е сутки. Ткани фиксировали в 10%-ном растворе формалина
с последующим обезвоживанием и заливкой в парафин. Гистоло
гические срезы головного мозга и внутренних органов окрашива
ли гематоксилин-эозином. У части животных проводили окраску
материала ШИК-методом с докраской гематоксилином.
Для сравнения особенностей течения инфекции мышей, развивающейся после введения грибов Candida в мозг, с развитием инфекционного процесса после заражения в вену проведены опыты на 400 мышах; инфицирующую дозу (ИД) вводили внутривенно в объеме 0,2 мл.
Лекарственные препараты и химические соединения. В хи-миотерапевтических опытах использованы следующие антими-котики: 1) выпускающиеся в России нистатин-субстанция, мико-гептин-таблетки по 60 мг (50 тыс. ЕД), амфотерицин В - порошок для инъекций во флаконах по 50 мг (50 тыс. ЕД) и амфог-люкамин-таблетки по 100 тыс. ЕД; 2) кетоконазол (низорал) -субстанция и таблетки по 0,2 г, итраконазол-субстанция фирмы Janssen Pharmacentica, Бельгия; 3) 5-фторцитозин (анкотил) -таблетки по 0,5 г фирмы Hoffman-La Roche,Швейцария.
Изучена активность 8 оригинальных соединений из различных химических рядов, синтезированных в ЦХЛС-ВНИХФИ и показавших активность в опытах in vitro в отношении С.albicans в пределах минимальной подавляющей концентрации (МПК) < 32 мкг/мл.
Химиотерапевтические опыты проведены на мышах, зараженных в мозг клиническим штаммом С.albicans №1775 в дозе 4х107кОЕ, вызывающей гибель 90-100% на 10-12 сутки после заражения. При сравнении активности препаратов (кетоконазола и играконазола) на модели генерализованного кандидоза мышей ИД составила 5х10вКОЕ. Животных (60 мышей) заражали в хвостовую вену в объеме 0,2мл; гибель нелеченных контрольных животных наблюдалась в те же сроки, что и в опытах с интраце-ребральным заражением.
Препараты и химические соединения вводили мышам внутрь в крахмальном геле в объеме 0,5 мл через час после заражения. Амфотерицин В вводили также под кожу в области загривка в 5% -ном растворе глюкозы. Лечение проводили 1 и 2 раза в день в течение 5 или 10 дней. Длительность наблюдения -30 суток.
Эффективность лечения оценивали по показателям выживаемости и суммарной продолжительности жизни животных на 10-е и 30-е сутки (в опыте с микогептином - и на 60-е сутки), высеваемости С. albicans из организма мышей и результатам
морфологического исследования мозга и внутренних органов леченных животных в сравнении с контролем.
Высеваемость С. albicans из организма мышей изучали через 5, 10 и 30 суток после заражения (в опыте с микогептпном и на 60-е сутки). Инфицированный материал от 340 животных засевали на среду Сабуро п инкубировали при 37 С в течение 72 часов. Результаты оценивали по числу мышей, из организма которых выделена С. albicans. Для количественного определения обсемененности мозга грибами С.albicans после 5-дневного лечения антимикотпкамп разведенную в 100 раз физиологическим раствором суспензию мозга засевали на чашкп с агаризованнои средой Сабуро, инкубировали 72 часа и подсчитывали число выросших колоний или оценивали рост С. albicans в баллах.
Оценку морфологических изменений, развивающихся в тканях мозга, почек и сердца, проводили в условных единицах по разработанной 4-х балльной системе (в зависимости от характера патологического процесса п вегетации гриба), описанной в соответствующем разделе работы.
Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым методикам, указанным в диссертации.