Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Патофизиология ИМ 13
1.2 Генетический полиморфизм белок-кодирующих генов как фактор предрасположенности к инфаркту миокарда (ИМ) 14
1.2.1 Методы исследования генетической предрасположенности к инфаркту миокарда
1.2.1.1 Полногеномный поиск ассоциаций (GWAS) 14
1.2.1.2 Подход "ген-кандидат" 22
1.2.2 Выбранные для исследования гены и их полиморфизмы 24
1.2.2.1Ген PCSK9 24
1.2.2.2 Ген LPL 26
1.2.2.3 Ген APOE 28
1.2.2.4 Ген eNOS 30
1.2.2.5 Ген MTHFR 33
1.3 Участие микроРНК в развитии ССЗ 35
1.3.1 МикроРНК и ее биогенез 36
1.3.2 Роль микроРНК в развитии атеросклероза 39
1.3.2.1 Участие микроРНК в липидном обмене 40
1.3.2.2 МикроРНК и дисфункция эндотелия 41
1.3.2.3 Регуляция ангиогенеза 43
1.3.2.4 Активация гладкомышечных клеток 44
1.3.2.5 Активация моноцитов 44
1.3.3 Использование микроРНК в диагностике и стратификации риска ИБС 46
1.3.3.1 МикроРНК и хроническая ИБС 46
1.3.3.2 МикроРНК и нестабильная стенокардия 48
1.3.3.3 МикроРНК и инфаркт миокарда 48
1.4 Заключение 51
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1 Диагностические критерии ИМ 53
2.2 Критерии исключения из исследования 54
2.3 Лечение больных с ОИМ 54
2.4 Исходные характеристики групп 55
2.5. Протокол исследования 57
2.6 Методы исследования 58
2.6.1. Генетический анализ 58
2.6.1.1 Выделение геномной ДНК из периферической крови 58
2.6.1.2. Геномное типирование 59
2.6.1.3. Анализ экспрессии микроРНК в плазме крови больных ИМ и здоровых контролей 63
2.6.2. Статистический анализ 64
Глава 3. Результаты исследования
3.1. Сравнение частот аллелей и генотипов полиморфных участков отдельных генов: 1420G>A гена PCSK9, 495T>G гена LPL, эпсилон-полиморфизма гена АPOЕ, 677C>T гена MTHFR и 786T>C гена eNOS у больных ИМ и в группе контроля 67
3.2 Оценка индивидуального генетического риска развития инфаркта миокарда в зависимости от носительства вариантов генов PCSK9, APOE, LPL и eNOS 71
3.3 Мультилокусный анализ совместного влияния носительства аллелей и генотипов исследованных полиморфных участков генов на риск развития ИМ 73
3.4Распределение частот аллелей и носительства аллелей и генотипов исследуемых полиморфных участков у больных ИМ c подъемом сегмента ST и без подъема сегмента ST в сравнении с контрольной группой 74
3.5 Распределение частот аллелей и носительства аллелей и генотипов исследуемых полиморфных участков у больных ИМ и контрольной группы в зависимости от пола 77
3.6 Распределение частот аллелей и носительства аллелей и генотипов исследуемых полиморфных участков у больных ИМ и контрольной группы в зависимости от возраста 82
3.7 Сравнение показателей липидного профиля крови у больных ИМ - носителей и неносителей генотипов риска по полиморфным участкам генов липидного обмена PCSK9, APOE и LPL 84
3.8 Влияние носительства аллелей и генотипов риска генов PCSK9, APOE, LPL, eNOS и MTHFR на прогноз по данным долгосрочного наблюдения 85
3.9 Экспрессия микроРНК у больных ИМ по сравнению с группой контроля 88
Глава 4. Обсуждение результатов
4.1. Влияние полиморфизмов 1420G>A гена PCSK9, 495T>G гена LPL, эпсилон-полиморфизма гена АPOЕ, 677C>T гена MTHFR и 786T>C гена eNOS на риск развития ИМ 90
4.2. Значение найденных генетических маркеров для прогноза постинфарктных неблагоприятных сердечно-сосудистыхсобытий 96
4.3. Экспрессия микроРНК у больных ИМ 99
4.4 Заключение 101
Выводы 102
Практические рекомендации 103
Список литературы 104
- Полногеномный поиск ассоциаций (GWAS)
- Геномное типирование
- Распределение частот аллелей и носительства аллелей и генотипов исследуемых полиморфных участков у больных ИМ и контрольной группы в зависимости от пола
- Влияние полиморфизмов 1420G>A гена PCSK9, 495T>G гена LPL, эпсилон-полиморфизма гена АPOЕ, 677C>T гена MTHFR и 786T>C гена eNOS на риск развития ИМ
Введение к работе
Актуальность исследования
ИМ представляет собой мультифакториальное заболевание, в развитии которого принимают участие как многочисленные внешние (приобретенные) факторы, так и генетические факторы. ИМ имеет полигенную генетическую природа, ему присущ не-Менделевский характер наследования, что является следствием взаимодействия ряда генов. Генетическая предрасположенность к ИБС хорошо изучена с помощью полногеномных ассоциативных исследований (GWASs), тогда как для ИМ как отдельной нозологии проведено относительно немного полногеномных исследований (Dai X. et al, 2016, Roberts R. 2014). Наблюдается плохая воспроизводимость ассоциаций
немногочисленных связанных с ИМ локусов, выявленных в отдельных работах, что может быть связано с этническими различиями между выборками. Хотя GWASs направлены на поиск генетических вариантов, которые позволили бы оценивать риск ИМ, пока они не привели к существенному прогрессу в изучении риска развития этого заболевания (Dehghan A. et al, 2016), а идентифицированные локусы объясняют только незначительную долю случаев ИМ.
Традиционный подход «ген-кандидат» сохраняет свою значимость. Число выбранных генов-кандидатов в таких исследованиях невелико; как правило, изучаются гены, белковые продукты которых имеют прямое отношение к звеньям патогенеза заболевания (свертывающая система, метаболизм липидов и др.). Важно отметить, что задача выявления генов, аллельный полиморфизм которых определяет
предрасположенность к развитию ИМ, должна решаться отдельно для каждого этноса, поскольку значимость влияния отдельных генов на предрасположенность может варьировать в разных этнических группах вследствие различия у них частот аллелей одного полиморфизма.
В последние годы широко изучается значение генетических факторов при стратификации риска после ИМ, поскольку стабильность и неизменность генетических факторов является потенциальным преимуществом по сравнению с лабильным уровнем биомаркеров.
Наряду с генетическими исследованиями, активно проводится изучение эпигенетических процессов, в частности, роли микроРНК в регуляции функции сердечнососудистой системы (Saheli Samanta et al, 2016). Открытые в конце ХХ века микроРНК представляют особую регуляторную систему, которая контролирует экспрессию генов на посттранскрипционном уровне. Доказана их важная роль в становлении и поддержании гомеостаза биологических систем в норме, а также в формировании патологических изменений в случае болезни. К настоящему времени описаны около 5 тысяч микроРНК у животных и растений, из них более 1000 – у человека. Можно считать установленным, что они контролируют не менее трети человеческого генома. Показано, что нарушение правильного функционирования определенных микроРНК может приводить к развитию сердечно-сосудистых заболеваний, в частности, атеросклероза, ишемической болезни сердца, фиброза сердца, постинфарктного ремоделирования миокарда, хронической сердечной недостаточности и нарушениям ритма сердца. Тканеспецифичность и высокая скорость изменения экспрессии микроРНК в сочетании с возможностью выхода этих молекул из клеток в кровоток в стабильной форме делает их перспективными в качестве
новых диагностических и прогностических маркеров ряда заболеваний сердечнососудистой системы, в том числе для ИМ (Rokas Navickas et al, 2016).
Изучение генетической и эпигенетической природы ИМ продолжается во всем мире в направлении выявления как новых генетических полиморфизмов, ассоциированных с заболеванием, так и новых микроРНК, дифференциально
экспрессирующихся при ИМ, а также путем валидации полученных результатов в других популяциях. Работа проведена для индивидов русской этнической принадлежности; она направлена на выявление новых генетических маркеров и анализ экспрессии ряда микроРНК с целью изучения их влияния на развитие ИМ и прогноз после ИМ.
Степень разработанности темы
На протяжении десятилетий в мире проведены многочисленные исследования, посвященные поиску ассоциации различных полиморфных вариантов генов-кандидатов с развитием ИМ для различных этносов. В русской популяции широко исследованы гены ACE (Малыгина Н.А. 2002, Беркович О.А. 2001, Шахнович Р.М. 2010 и др), AGT и AGTR1 (Чистяков Д.А 2000), PAI (Затейщиков 2008, Селезнева Н.Д. 2008,), FGB (Закирова В.Б. 2008), MTHFR (Бондарь И.А. 2007), eNOS (Березикова Е.Н. 2010), ApoE (Мустафина О.Е. 2002), CRР(Сухинина 2012), ApoB (Воевода М.И. 2007), LPL (Сайгитов Р.Т. 2008) и TNF (Малыгина Н.А. 2011 и др), роль белковых продуктов которых в атерогенезе и патогенезе ИБС и ИМ давно известна. Для многих генов результаты противоречивы, что не дает возможности сделать однозначный вывод об их месте в общей картине генетической предрасположенности к ССЗ у русских. Расширение панели исследуемых генов, а также валидация результатов, полученных для исследованных ранее генов, с применением новых подходов, таких как комплексный анализ с поиском сочетаний аллелей и генотипов полиморфных участков различных генов и анализ кумулятивного эффекта этих сочетаний, - наиболее перспективные направления. Для нашего исследования мы выбрали гены, которые имеют отношение к механизмам атерогенеза и атеротромбоза.
Цель исследования
Комплексный анализ ассоциации носительства аллелей и генотипов полиморфных участков генов–кандидатов и их сочетаний, а также уровня экспрессии микроРНК, с риском возникновения ИМ; долгосрочный прогноз неблагоприятных сердечнососудистых событий у больных после перенесенного ИМ по результатам генотипирования.
Задачи исследования
-
Провести сравнительный анализ у больных с ИМ и в контрольной группе здоровых лиц распределения вариантов полиморфных участков генов системы липидного обмена (PCSK9, LPL,ApoE), метаболизма оксида азота (eNOS) и гомоцистеина (MTHFR).
-
С помощью метода логистической регрессии оценить эффективность выявленных генетических маркеров поодиночке и в сочетании для предсказания индивидуального генетического риска развития ИМ.
-
Провести мультилокусный анализ совместного влияния носительства аллелей и генотипов исследованных полиморфных участков генов на риск развития ИМ.
-
Провести анализ влияния полиморфизмов изучаемых генов на предрасположенность к ИМ в зависимости от возраста, пола и варианта ИМ (с подъемом или без подъема ST).
-
Оценить значимость каждого из выявленных генетических маркеров и их сочетания (композитного генетического маркера риска ИМ) для прогноза
неблагоприятных сердечно-сосудистых событий у больных, перенесших ИМ, по данным долгосрочного наблюдения.
6. Провести сравнительный анализ уровней экспрессии 84 микроРНК, потенциально
вовлеченных в развитие воспаления, в плазме крови больных с ИМ и в контрольной
группе.
Научная новизна
Продемонстрирована ассоциация полиморфных участков 1420G>A гена PCSK9, 495T>G гена LPL, эпсилон-полиморфизма гена АpoE, 677C>T гена MTHFR и 786T>C гена eNOS с риском развития ИМ. Выявлена связь носительства генотипа MTHFR*677Т/Т с развитием неблагоприятных сердечно-сосудистых событий после перенесенного ИМ по данным долгосрочного наблюдения.
При сравнении уровней экспрессии 84 микроРНК, потенциально вовлеченных в воспаление, показана дифференциальная экспрессия микроРНК-21-5p и микроРНК-15b-5p в плазме крови больных ИМ.
Теоретическая и практическая значимость
С целью стратификации риска развития ИМ может быть использовано геномное типирование полиморфных участков 1420G>A гена PCSK9, 495T>G гена LPL, эпсилон-полиморфизма гена АpoE, 677C>T гена MTHFR и 786T>C гена eNOS. Полученные результаты позволят выявлять групп высокого риска развития ИМ.
На основании генетического типирования обнаружен новый генетический маркер неблагоприятных исходов у больных с ИМ: полиморфный участок 677C>T гена MTHFR.
Апробация и внедрение в практику полученных результатов
Результаты работы внедрены в научную и практическую работу ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ. Материалы диссертации доложены на межотделенческой конференции НИИ клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ по апробации кандидатских диссертаций 20.07.2017г., Протокол №48. Диссертация рекомендована к защите.
Публикации
По материалам исследований опубликовано 5 научных работ, из них 3 статей в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации.
Структура диссертации
Полногеномный поиск ассоциаций (GWAS)
Наиболее современным методом поиска новых генов, вовлеченных в формирование предрасположенности к полигенным заболеваниям, в том числе и к ИМ, является GWAS. Данный метод исследования генетической природы заболеваний человека основан на анализе различий в частотах распределенных по всему геному аллелей однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) в выборках неродственных больных и индивидов контрольной группы с использованием микрочипов или других технологий, позволяющих одновременно генотипировать от нескольких десятков тысяч до нескольких миллионов ОНП в одном образце.
К настоящему времени проведено большое количество GWAS по исследованию ИБС и ИМ: CARDIoGRAM [15], Coronary Artery Disease (C4D) Genetics Consortium 2011 [16], Wellcome Trust Case Control Consortium [17] и др. В результате этих работ выявлены новые локусы, вовлеченные в развитие ИБС, в том числе ИМ. Однако роль большинства найденных GWAS генов в патогенезе ССЗ пока неясна. Данные о результатах этих исследований, а также данные GWAS других заболеваний, в которых обнаруживают наследуемый компонент, но не проявляют четкого менделевского паттерна наследования (например, сахарный диабет 2 типа, артериальная гипертензия, аутоиммунные заболевания, рак, шизофрения и т.д.) представлены в регулярно обновляющемся каталоге NHGRI-EBI GWAS catalog [18,19], доступном на сайте (http://www.ebi.ac.uk/gwas/). Каталог включает в себя данные всех проведенных GWAS, использующих платформы с покрытием не менее 100 000 ОНП, и все найденные ассоциации с величиной р 1105 [19].
Обычно GWAS предполагает два этапа исследования: начальный, использующий высокопроизводительные методы генотипирования; и репликационный (верифицирующий), когда изучаются наиболее значимо ассоциированные в первой стадии маркеры на новой выборке с помощью независимых методов генотипирования. Данные второго этапа GWAS из разных исследований (часто, на разных популяциях) иногда объединяют и проводят мета-анализ. Уровень значимости результатов полногеномных исследований в настоящее время соответствует значению р 5 108, в котором учтена поправка Бонферрони на 1 000 000 сравнений [20]. Увеличение выборки путем вовлечения в исследование людей разной этнической принадлежности создает проблему популяционной стратификации, которая заключается в риске ложноположительных результатов вследствие варьирования частот аллелей между разными этносами. Эту проблему частично можно обойти, включая в исследование представителей близких этнических групп [21], что в свою очередь ограничивает размер выборки. Еще одно направление – отдельный анализ данных для каждого этноса [22]. Объединение исследовательских центров в консорциумы сделало возможным проведение крупнейшего исследования CARDIoGRAM [15], в котором участвовало 88тыс человек. В этом исследовании была подтверждена значимость ранее открытых 10 генетических факторов риска и обнаружено дополнительно 13 новых локусов, ассоциированных с ИБС. В самом большом мета-анализе данных GWAS - CARDIoGRAMplusC4D [23], куда было включено 63746 больных ИБС и 130681 лиц контрольной группы, идентифицировано в общей сложности 46 генетических факторов риска развития ИБС. Вместе с локусом 6q21, являющегося фактором риска развития ИБС для китайской популяции [24] и дополнительно тремя локусами в исследовании IBC 50K [25]. Таким образом, с помощью GWAS найдено более 50 геномных локуса ассоциированных с ИБС, в том числе с ИМ (таблица 1).
В 2007г впервые в трех независимых GWAS была воспроизведена достоверная ассоциация локуса 9p21 с ИБС [28,29,30]. Было показано, что полиморфизм в области локуса 9р21 является независимым фактором риска. В этом локусе находится ген некодирующей регуляторной РНК ANRIL. Эта РНК может влиять на экспрессию ингибиторов циклин-зависимых киназ p15INK4a и p16INK4b, которые кодируются генами CDKN2A и CDKN2B, расположенными в той же области. Предполагают, что область 9p21 может влиять на экспрессию ингибиторов циклин-зависимых киназ, вовлеченных в процессы сосудистого ремоделирования, участвовать в патогенезе атеросклероза через регуляцию пролиферации и апоптоза гладкомышечных клеток[31].
Генетическая предрасположенность к ИБС хорошо изучена с помощью GWAS, тогда как для ИМ как отдельного фенотипа проведено относительно немного полногеномных исследований [32], и только для rs1333049 в области 9p21, ассоциация с ИМ была воспроизведена в трех GWAS [16,29,33] и подтверждена, не только для европеоидов, но и для других популяций [34,35,36,37,38]. Найденные с помощью GWAS локусы объясняют только незначительную долю риска ИМ. Хотя GWASs направлены на поиск генетических вариантов, которые позволили бы оценивать риск ИМ, отмечается, что пока они не привели к прогрессу в прогнозировании риска этого заболевания.
В исследований Fan и соавт. [39] с участием 2352 больных ИБС/ИМ и группы контроля из 2116 человек старше 60 лет, был выделен гаплотип локуса 9p21, включающий в себя rs518394 и rs1333049, который был связан с развитием ИБС. ОНП rs518394 был ассоциирован с ИМ у больных раннее страдающих ИБС, в то время как rs1333049 был ассоциирован с ИБС, ее ранним развитием и тяжестью атеросклеротического поражения коронарного русла [40,41]. Связь с ИМ при полном геномном поиске также обнаружена для гена, кодирующего фактор регуляции транскрипции в миоцитах (MEF2A), и гена LTA, гена, кодирующего галестин-2 (LGALS2), и ряда других генов [42]. В исследовании CARDIoGRAM [15] была показана взаимосвязь группы крови по системе ABO и ИМ. Фенотип А и В увеличивали риск развития ИМ примерно на 20%. Уровень фактора фон Виллебранда (vWF) на 25% было выше у носителей группы крови А, В или АВ, чем 0 за счет удлинения времени полураспада vWF. Напротив, у индивидов с группой крови О не было удлинено время полураспада vWF и риск развития тромбоза и ИМ бы ниже[43]. Кроме того, есть данные о связи локуса ABO с локусами маркеров воспаления при атеросклерозе, включая молекулу межклеточной адгезии 1, растворимые фракции P-селектина [44] и Е-селектина [45], фактор некроза опухоли . В исследовании Nurse s Health Study, где участвовало более 90 000 человек, с двадцатилетним периодом наблюдения, группа крови А и В были ассоциированы с увеличением частоты развития ИМ на 10% [46].
Геномное типирование
Геномное типирование проводили методами, основанными на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Использовали метод анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов продуктов ПЦР (метод ПЦР-ПДРФ), где олигонуклеотидная замена входит в состав сайта узнавания специфической рестриктазы, и генотипы определяют по наличию или отсутствию фрагментов рестрикции; и метод ПЦР с использованием аллелеспецифических праймеров (метод ПЦР-SSP), где генотипы определяют по наличию или отсутствию продукта амплификации в случае праймера, специфического для определенного аллеля. В каждый эксперимент в качестве отрицательного контроля включали пробу без ДНК-матрицы. ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (АО "ДНК Технология", Россия) или Genius (Techne, Великобритания).
Анализ полиморфного участка 1420G A гена PCSK9
Анализ однонуклеотидной замены G1420A (rs562556) гена PCSK9 осуществляли методом ПЦР в режиме реального времени с применением набора TaqMan SNP Genotyping Assay (Applied Biosystems).
Анализ полиморфного участка T495Gгена LPL
Полимеразная цепная реакция. Для анализа однонуклеотидной замены T495G (rs320) в 8-ом интроне гена LPL фрагмент ДНК длиной 355 п.н., содержащий этот полиморфный участок, амплифицировали с использованием праймеров: 5 -GATGCTACCTGGATAATCAAAG -3 и 5 -CTTCAGCTAGACATTGCTAGTGT-3 [244]. Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 70 мМ Трис-HCIpH 9.0, 20 мМ (NH4)2SO4, 1.0 мМ MgCI2, 0.025% Tween 20, 0.025% NP-40, праймеры в количестве 5 пмоль каждый, 0.2 мМ dNTP, 0.5 ед. Taq полимеразы и 100-250 нг геномной ДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло.
Программа амплификации: 1) 94оС – 5 мин 2) 30 циклов: 94оС – 30 сек; 60оС – 30 сек; 72оС – 45 сек, 3) 72оС – 7 мин. ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (АО "ДНК Технология", Россия). Наличие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2%-ом агарозном геле в присутствии бромида этидия.
Рестрикция. По 5 мкл полученного продукта амплификации обрабатывали 8 ед. рестриктазы Hind III в течение 3 часов в реакционном буфере, поставляемом производителем фермента, при 37оС. Продукты рестрикции анализировали методом электрофореза в 2%-ом агарозном геле в присутствии бромида этидия. Наличие рестрицированных фрагментов длиной 217 и 138 п.н. свидетельствовало о присутствии аллеля Т в полиморфном участке 495, наличие интактного фрагмента длиной 355 п.н. – аллеля G.
Анализ эпсилон-полиморфизма гена ЛРОЕ
Полимеразная цепная реакция. Полиморфизм эпсилон-изоформ ароЕ (2, З и 4), кодирующихся аллелями є2, є3 и є4, определяется сочетанием двух однонуклеотидных замен в положениях Т3937С и С4075Т внутри четвертого экзона гена APOE. Для генотипирования амплифицировали фрагмент ДНК длиной 244 пары нуклеотидов (п.н.), содержащий оба эти участка, с использованием праймеров: 5 -AGATGCGGGCACGGCTGTTCAAGGA-3 и 5 -CCCTCGCGAGCCCCGGCCTGGTACAC-3 [245]. Амплификацию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 70 мМ Трис-НСІрН 9.0, 20 мМ (NH4)2S04, 2.0 мМ MgCI2, 0.025% Tween 20, 0.025% NP-40, праймеры в количестве 5 пмоль каждый, 0.2 мМ dNTP, 2 % DMSO, 0.5 ед. Taq полимеразы и 100-250 нг геномной ДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло.
Программа амплификации: 1) 96оС - 5 мин , 2) 50 циклов: 95оС - 15 сек; 67оС - 15 сек; 72оС - 30 сек , 3) 72оС - 10 мин. ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (АО "ДНК Технология", Россия).Наличие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2%-ом агарозном геле в присутствии бромида этидия.
Рестрикция. По 5 мкл полученного продукта амплификации обрабатывали 9 ед. рестриктазы Hhal (использовали изошизомер AspLEl) в течение 5 часов в реакционном буфере, поставляемом производителем фермента, при 37оС и анализировали методом электрофореза в 12%-ом полиакриламидном геле в присутствии бромида этидия. Состав 5х буфера для электрофореза: 3.6 М Трис-борат; 0.7 М борная кислота.
Наличие рестрицированных фрагментов длиной 91, 83 и 35 п.н. свидетельствовало о присутствии аллеля є2. Аллель є3 проявлялся в наличии продуктов рестрикции размером 91, 48 и 35 п.н.. Аллель є4 был представлен сочетанием фрагментов длиной 72, 48 и 35 п.н.
Анализ полиморфного участка Т786С гена eNOS
Полимеразная цепная реакция. Для анализа однонуклеотидной замены С-786Т гена eNOS фрагмент ДНК длиной 387 п.н., содержащий этот полиморфный участок, амплифицировали с использованием праймеров: eNOS786-l 5 TT-CTC-CAG-CCC-CTC-AGAG-3 eNOS786-2 5 -AGG-CCC-AGC-AAG-GAT-GTA-GT-3 (20 н.) [246]. Амплификацию проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 70 мМTris-HCl рН 9,0, 20 мМ (NH4)2 S04, 2,0 мМMgC12, 0,025% Tween 20, 0,025% NP-40, 0,4 моноклональных антител, специфичных для Taq полимеразы Taq Start(lot:WO958, АО «Мона»), праймеры в количестве 5,0пмоль каждый, 0,2 мМdNTP, 0,1 ед Taq полимеразы (Sileks, Россия) и 100-250 нг геномной ДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло.
Программа амплификации: 1) 94оС - 5 мин, 2) 45 циклов: 94оС – 1 мин.; 58оС – 1 мин.; 72оС – 1 мин, 3) 72оС - 7 мин. ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (АО "ДНК Технология", Россия)Наличие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия.
Рестрикция. По 5 мкл полученого продукта амплификации обрабатывали 5 ед. рестриктазы MroNI (либо NaeI) (“СибЭнзим”, Россия) в течение 24 часов в реакционном буфере, поставляемом производителем фермента, при 37оС. Продукты рестрикции анализировали методом электрофореза в 3% агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Наличие рестрицированных фрагментов длиной 155 и 232 п.н. свидетельствовало о присутствии аллеля C в полиморфном участке -786, наличие интактного фрагмента длиной 387 свидетельствовало о присутствии аллеля Т.
Анализ полиморфного участка C677T гена MTHFR
Полимеразная цепная реакция. Фрагмент ДНК длиной 418 п.н., содержащий этот полиморфный участок, амплифицировали с использованием праймеров: 5-GCCCAGCCACTCACTGTTTTA-3 и 5-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3[247]. Амплификацию проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 70 мМ Tris-HCl pH 9,0, 20 мМ (NH4)2 SO4, 2,0 мМ MgCl2, 0,025% Tween 20, 0,025% NP-40, 0,4 моноклональных антител, специфичных для Taq полимеразы Taq-Start (lot:WO958, АО «Мона»), праймеры в количестве 5,0 пмоль каждый, 0,2 мМ dNTP, 0,1 ед Taq полимеразы (Sileks, Россия) и 100-250 нггеномнойДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло.
Программа амплификации: 1) 94С – 5 мин; 2) 40 циклов: 94С–1 мин; 58С– 1 мин; 72С–1 мин; 3)72С – 7 мин. Наличие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия.
Рестрикция. По 5 мкл полученного продукта амплификации обрабатывали 5 ед рестриктазы HinFI («СибЭнзим», Россия) в течение 5 часов в реакционном буфере, поставляемом производителем фермента при 37С и анализировали методом электрофореза в 3% агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Полиморфный участок C677T характеризуется фрагментом 77 и 341 п.н. в случае аллеля С и 165 и 176 п.н. в случае аллеля Т, помимо этого, в каждой пробе должен присутствовать фрагмент длиной 77 п.н., являющийся положительным внутренним контролем.
Распределение частот аллелей и носительства аллелей и генотипов исследуемых полиморфных участков у больных ИМ и контрольной группы в зависимости от пола
Проведено сравнение частот аллелей и генотипов полиморфных участков 1420G A гена PCSK9, 495T G гена LPL, эпсилон-полиморфизма гена АPOЕ, 677C T гена MTHFR и 786T C гена eNOS при разделении групп больных ИМ и лиц контрольной группы по полу.
У мужчин наблюдалось значимое различие в частоте встречаемости генотипа PCSK9 1420A/G (таблица 11), который чаще встречался в контрольной группе (p=0.03, OШ=0.59, 95%ДИ:0.36-0.95). Между подгруппами женщин, больных ИМ и в контрольной группе, значимых различий в частоте встречаемости, носительстве аллелей и генотипов выявлено не было.
При сравнении частот аллелей и генотипов полиморфного участка 495T G гена LPL у больных ИМ мужчин генотип LPL 495G/G встречался значимо чаще по сравнению с мужчинами из группы контроля (p=0.024, OШ=2.72, 95%ДИ:1.03-7.20), а частота носительства аллеля LPL 495Т была выше в группе контроля (таблица 12). Между подгруппами женщин – больных ИМ и здоровых – значимых различий в частоте встречаемости, носительстве аллелей и генотипов значимых различий выявлено не было.
При сравнении частот аллелей и генотипов эпсилон-полиморфизма гена АPOЕ у мужчин и женщин в группах ИМ и контрольной группе выявлено, что частота встречаемости аллеля 4 достоверно выше у мужчин с ИМ (p=0.006, OШ=0.54, 95%ДИ: 0.29-0.98). Генотип 3/4 значимо выше в группе контроля как у мужчин, так и женщин (таблица 13) (p=0.018, OШ=0.42, 95%ДИ: 0.22-0.82; p=0.02, OШ=0.35, 95%ДИ: 0.15-0.81).
Частота аллеля С гена eNOS была значимо выше в подгруппе мужчин с ИМ (p=0.024, OШ=1.43, 95%ДИ:1.01-2.00), а частота встречаемости аллеля Т достоверно выше у мужчин в контрольной группе (p=0.024, OШ=0.70, 95%ДИ:0.50-0.98). Между подгруппами женщин больных ИМ и в контроле выявлены значимые различия в носительстве генотипов. Генотип eNOS 786С/Т встречался значимо чаще у женщин с ИМ (p=0.02, OШ=1.85, 95%ДИ:1.07-3.20), а генотип eNOS 786Т/Т чаще обнаруживали у женщин контрольной группы (p=0.021, OШ=0.55, 95%ДИ:0.32-0.94), (таблица 14). Частота носительства аллеля eNOS 786С была выше у женщин с ИМ по сравнению с группой контроля (p=0.021, OШ=1.80, 95%ДИ:1.05-3.09).
Таблица 14. Распределение аллелей и генотипов полиморфного участка -786T C гена eNOS (rs2070744) у лиц, перенесших ИМ, в сравнении c контрольной группой в зависимости от пола
Частота аллеля MTHFR 677C была значимо выше в подгруппе мужчин, больных ИМ (p=0.025, OШ=1.42, 95%ДИ:1.02-1.98), а частота встречаемости аллеля Т достоверно выше у мужчин в контрольной группе (p=0.025, OШ=0.70, 95%ДИ:0.50-0.98). Между подгруппами женщин больных ИМ и в контроле значимых различий в частоте встречаемости, носительстве аллелей и вариантах генотипов полиморфного участка 677C T гена MTHFR значимых различий выявлено не было (таблица 15).
Влияние полиморфизмов 1420G>A гена PCSK9, 495T>G гена LPL, эпсилон-полиморфизма гена АPOЕ, 677C>T гена MTHFR и 786T>C гена eNOS на риск развития ИМ
Проведенный методом «случай – контроль» анализ ассоциации полиморфных вариантов PCSK9 (rs562556), APOE (эпсилон-полиморфизм, rs7412 и rs429358), LPL (rs320), MTHFR (rs1801133) и eNOS (rs2070744) с риском развития ИМ позволил выявить значимо ассоциированные с ИМ аллели/генотипы PCSK9, APOE, LPL и NOS.
Каждый из исследованных генов системы липидного обмена – PCSK9, LPL и APOE – оказался ассоциированным с риском ИМ. ОШ для генотипов риска лежит в пределах от 1.45 до 1.96, однако уровень значимости невелик (от 0.013 до 0.032). Вовлечение генов системы липидного обмена в развитие ИМ хорошо согласуется с общеизвестным фактом, что нарушения обмена липидов и повышение уровня холестерина и индекса атерогенности приводят к атеросклеротическим поражениям интимы артерий. Однако, данные литературы об участии изученных нами вариантов генов системы липидного обмена в формировании ССЗ противоречивы.
В нашем исследовании генотип А/А полиморфного участка 1420G A гена PCSK9 (rs562556) оказался генетическим маркером риска развития ИМ. rs562556 в гене PCSK9 определяет замену Ile на Val в положении 474 кодируемого белка, что, по всей видимости, не влияет на уровень его продукции [254]. Этот полиморфизм в большинстве популяций не связан с изменениями в концентрации ЛПНП [85,86]. В нашем исследовании так же не было выявлено ассоциации данного полиморфизма с показателями липидного обмена (ОХЛ и ТГ). Однако у японцев этот ОНП был ассоциирован с повышенным уровнем холестерина, хотя при этом не наблюдали различий в распределении вариантов rs562556 у больных с ИМ и в контрольной группе [88]. Выявлена связь между полиморфизмом rs562556, присутствием антифосфолипидных антител и развитием у носителей этих антител тромбоза - фактора риска [89]. Ассоциация с ИМ других вариантов гена PCSK9, а именно rs11206510 [255] и rsll591147 [92], была показана в различных популяциях. Таким образом, полученные нами данные об ассоциации гена PCSK9 с возникновением ИМ находятся в соответствии с данными литературы.
Полиморфизм эпсилон- РШ определяется сочетанием двух однонуклеотидных замен в положениях Т3937С и С4075Т внутри четвертого экзона гена АРОЕ. Замена нуклеотидов может приводить к изменению сродства АроЕ к рецепторам, что влияет на уровень холестерина и другие показатели липидного обмена. При оценке аллельных частот полиморфизма гена ApoE в мире установлено, что аллель є3 является самым распространенным во всех популяциях (60-88%) [111]. Частота аллеля 2 подвержена значительным колебаниям. У жителей Европы она лежит в пределах 5-8%. Однако этот аллель практически не встречается у аборигенов Чукотки и Аляски, его частота мала в популяциях Японии (около 2%) и значительна у жителей Новой Гвинеи (14%). Аллель 4 также варьирует по частоте, он редко встречается в популяции Китая (6%), но часто в популяциях коренных жителей Северной Европы (23%) и Северной Азии (24%) [256]. В нашем исследовании в русской популяции распределение частот аллелей гена АРОЕ совпадает с распределением аллелей для европейской популяции (2 - 8,5%, 3 - 86%, 4 - 5,5%).
Отдельные аллельные варианты включенного в наше исследование эпсилон-полиморфизма гена АРОЕ практически во всех популяциях ассоциированы с ССЗ, и, в частности, с ИМ. Согласно проведенным мета-анализам, с риском развития ИМ ассоциирован аллель 4, а 2 служит протективом [257]. Однако, выводы, полученные при мета-анализе, включающем различные этносы, нельзя автоматически распространять на отдельные популяции, для которых наблюдается большой разброс в оценке роли отдельных аллелей в предрасположенности к ИМ. В некоторых исследованиях частота аллеля є4 и генотипа єЗ/є4 выше в группе больных, страдающих ССЗ, в том числе ИМ [115,117]. В то же время, в исследовании W. Koch и соавт.не было показано протективного эффекта аллеля 2 и генотипа 2/3, также не было выявлено ассоциации носительства аллеля 4 с ИМ [118]. В нашем исследовании носительство аллеля 4 и генотипа 3/4 было значимо выше в контрольной группе, что говорит об их негативной ассоциации с ИМ. Вероятно, основной причиной плохой воспроизводимости результатов отдельных исследований является существенная разница в частотах аллелей в различных популяциях, и даже в одной и той же популяции, проживающей на разных территориях [258]. В частности, в нашем исследовании, выполненном для русских из центральной России, генотипом риска оказался 3/3, а в выборке мужчин из сибирской популяции - генотип 2/3 [259]. Показано, что примерно 7 % индивидуальных фенотипических вариаций в уровне сывороточного холестерина связаны с эпсилон-полиморфизмом АРОЕ [260]. Однако, в ряде исследований, как и в нашем, не обнаружено влияния данного полиморфизма на уровень ОХЛ и ТГ [113].
rs320, известный также как Hindlll полиморфизм, определяет замену Т на G в 8-ом интроне гена LPL. Предполагают, что он находится в регуляторной области и влияет на экспрессию LPL [261]. В нашем исследовании при сравнении групп больных ИМ и контроля выявлена значимая позитивная ассоциация ИМ с генотипом 495G/G гена LPL. Связь этого полиморфизма с развитием ИМ была показана также в ряде других исследований [262,263] в том числе и у русских [264]. В одном из исследований генотип Hindlll Н +/+ гена LPL (он же - генотип G/G rs320 гена LPL) был связан с развитием ОКС как с подъемом, так и без подъема сегмента ST. Причем у лиц с генотипом Н +/+ риск развития ИМпST увеличивался в 2 раза [104]. В нашем исследовании генотип LPL GIG тоже чаще встречается у больных с ИМбпБТ по сравнению с контрольной группой, но не достигает достоверных различий у больных с ИМпST. Таким образом, носительство генотипа LPL G/G может рассматриваться как генетический маркер предрасположенности к ИМбпST.
Описаны и другие полиморфизмы этого гена, ассоциированные с ИМ [265]. Однако данные об ассоциации отдельных аллелей с ИМ не всегда совпадают.
В некоторых исследованиях для полиморфного участка 495T G гена LPL выявлена ассоциация с высоким уровнем ТГ [266]. В других исследованиях, напротив, показано, что носительство аллеля 495G гена LPL связано с более низким содержанием ТГ в плазме крови и меньшей вероятностью развития атеросклероза [102,103]. По нашим данным для исследуемого ОНП LPL не выявлено связи с уровнем ОХЛ и ТГ. Эти данные, вероятно, связаны с этническими различиями исследуемых популяций. Они не позволяют без экспериментальной проверки переносить результаты, полученные для одной популяции и свидетельствующие о функциональной значимости полиморфизма 495T G гена LPL, на другие популяции.
Еще один локус, вариант которого значимо ассоциирован с ИМ в нашей работе – это rs2070744 гена eNOS. Этот полиморфный участок находится в промоторной области гена. Частота встречаемости и частота носительства аллеля С данного полиморфизма были значимо выше среди больных ИМ. Носительство этого аллеля ассоциировано с уменьшением уровня мРНК и, соответственно, уровня белка eNOS [267]. В ряде исследований, как и в нашем, обнаружено влияние носительства аллеля С на риск развития ИМ [268]. Поскольку различий в частотах носительства аллеля eNOS -786С у больных с ИМбпST и больных ИМпST не наблюдается, можно заключить, что аллель С является маркером риска обеих этих форм ИМ.
После деления группы больных ИМ по возрасту, в котором произошел первый ИМ - моложе и старше 60 лет, по нашим данным, основной вклад в предрасположенность к ИМ у лиц 60 лет вносит носительство аллея С полиморфного участка -786T C гена eNOS. Таким образом, исследуемый полиморфизм гена eNOS может служить маркером развития раннего ИМ. Замена C на T в rs1801133 гена MTHFR приводит к замещению Ala в положении 222 белка на Val [137] и почти к 50%-ному снижению ферментативной активности метилентетрагидрофолатредуктазы [139]. В большинстве исследований не наблюдали ассоциации rs1801133 с риском развития ИМ для различных этносов, включая европеоидов [157] и русских[154]. Мы также не выявили ассоциации вариантов rs1801133поодиночке с риском развития ИМ у русских при сравнении больных с ИМ с контрольной группой. Однако с помощью мультилокусного анализа мы показали, что носительство аллеля С rs1801133 гена MTHFR в сочетании с носительством аллеля С полиморфного участка 786T C гена eNOS высокозначимо ассоциировано с риском ИМ. По-видимому, кумулятивный эффект генов в составе сочетания возникает в результате суммирования их малых независимых вкладов. Более того, при делении больных ИМ по гендерному признаку мы наблюдали достоверную связь полиморфизма 677C T гена MTHFR с риском развития ИМ у мужчин. Оказалось, что среди мужчин частота аллеля С достоверно выше в группе больных ИМ, а частота аллеля Т - в контрольной группе. Попарное сравнение частот носительства аллелей и генотипов в подгруппах женщин значимых различий не выявило. Таким образом, с помощью двух подходов показано вовлечение rs1801133 гена MTHFR в развитие ИМ и выявлен половой диморфизм в распределении его генотипов у больных ИМ и здоровых.