Введение к работе
Актуальность .Участвующие в реализации процесса исчерпывающего протеолиза пептидшдролазы в лизосомах представлены множеством ферментов, активных в кислой и слабокислой области рН, с различной, но перекрывающейся субстратной специфичностью. У животных значительный вклад в тканевый протеолиз вносят цистеиновые катепсины, способные переходить из латентного в активное состояние в присутствии тиоловых соединений. При исследовашш препаратов катепсина В постепенно открывали другие цистеиновые катепсины ( ЦК )- экзопептидазу катепсин В2 [ Otto К., 1967 ], катепсин L [ Kirschke Н., et al, 1977 ] , катепепн S [ Turk V., et al, 1980 ], катепсин H [ Kirschke Н., et al, 1977], катепсин N [ Turnsek et al, 1975], неГпральные пепидгидролазы [Локшина Л. A., et al 1983 ]. Цистеиновые катепсины - В, Н, L, N, S и другие ) участвуют в лизосомальном деструктивном [ ВоЫеу P., et al 1979 ] и наряду с другими клеточными пептидгидролазами в ограниченном протеолизе [ Young J. et al, 1993 ], в метаболизме межклеточного вещества [ Moin К., et al 1992 ]. Установлено их участие в ключевых стадиях процессшіга различных белков, в том числе, при процессшгге и презентацій! антигенов [ Katunuraa N., Matsunaga Y, Saibara Т., 1994 ]. Получешпле некоторыми авторами результаты указывают на то, что накопления в клетках значительных количеств промежуточных пептидов не происходит [Баррет А.Д., Хит М.Ф. 1980 ]. Изучение этого аспекта клеточного протеолиза в недалеком прошлом являлось ключевым в фундаментальной биохиміш [ Крнцман М.Г., Конникова А.С., 1968 ]. Нарушения протеолитических фушацш в тканях изучены недостаточно. Сложности возникают при идентифіжациіі активности пептадгидролаз и ее количественной характеристики.
Неполный протеолиз в патологических условиях может возникать из-за торможешш активности отдельных пептидгидролаз, например, со стороны многочисленной группы эндогенных ингибиторов. Наиболее показательно протекает накопление промежуточных продуктов деградации белков при патолопш почек, в віще низкомолекулярного пептидного материала в крови [Дубикайтис А.Ю., Белоцерковский М.В., Конюхова С.Г., 1991 ]. В ходе протеолиза происходит образование "выщепленных" при дсградащш различных белков полипептидов с выраженной биологической активностью, которые могут реализовать патологические механизмы через их иммуномодулирующие свойства, хсмотаксическую, цитотаксическую активность [ Янковский О.Ю., 1979, Katunuma N., Matsunaga Y., Saibara Т., 1994].
4 В связи с большой ролью почек в утилизации белка, исследование варьирования и роли цистеиновых катспсинов в данном органе в норме и при нарушении функции представляется весьма актуальным. К числу наиболее актуальных направлений современной медицинской патохимии и патофизиологии относятся исследования активности цистеиновых катепсішов в плазме крови при процессах опухолевого роста. Известно, что в опухолевых клетках не происходит образования специфических маркерных энзимов. При малигнизации ткани изменяется процессинг по крайней мере одного из ЦК- катепешт В [ Poole A.R., et al, 1980 ]. Это сопровождается образованием устойчивой при рН выше 7 формы фермента, т.е. отличающейся от обычных форм, которые не могут сохраняться в нативном энзиматически активном виде в крови [Pietras R.J., et al, 1979, Recklies A.D., 1982]. Эти аномальные формы могут секретироваться различными малштшзированными клетками [Дилакян Э. A., et al 1994, Sloane B.F., 1990, Rempel al S.A., 1994 ]. Исследование цистеиновых катепсинов при процессах тканевого роста и усовершенствование методов их анализа весьма актуальны для развития практической энзнмодиапюстики при онкопатологии [Pietras R.J., et al, 1979, Poole A.R., et al 1970, Poole A.R., et al, 1980 ].
Цель исследования. Целью работы было выявление и характеристика некоторых важнейших модгуляторов цистеиновых катепсішов, молекулярных форм этих фдіментов, выяснение их варьирования и ішдуцибельиости в тканях и плазме крови в норме, различных экспериментальных ситуациях и при некоторых видах патологии.
Основные задачи исследования.
-
Усовершенствовать методы получения высокоочшценных препаратов цистеиновых катепсішов В, Н, L из почек человека. Изучить феномен формирования множествсішьгх молекулярных форм катепсина В в целях выяснешш спектра фермента в тканях почки и повышешш выхода фермента при очистке.
-
Изучить важнейшие свойства цистеиновых катепсішов почек человека и животных, включая влияние восстановителей и окислителей, поверхностпоактивных веществ, ингибирование белками и пептидами.
-
Изучить возможность определения активности индивидуальных катепсинов В, Н, L в неочищенном материале. Усовершенствовать соответствующую методику анализа. Выявить влияние различных способов получения экстрактов тканей на активность катепсина В.
-
Изучить индуцибельность цистешювых катепсинов в тканях. Исследовать это явление в отношении индивидуальных активностей цистешювых катспсшюв в условиях различных влияний на обмен веществ в тканях: а) при голодании экспериментальных животных, б) при усилении ассимиляции в условиях беременности экспериментальных животных, в) при резком изменении окислительного метаболизма за счет гипероксии экспериментального животного. Исследовать варьирование катепсин В- подобной активности в ткани почки человека. Изучить формирование крупномолекулярных форм катепсина В при отторжения трансплантата почки.
-
Изучить возрастание активности катепсина Н в крови онкологических больных по сравнению со здоровыми донорами с помощью модифицированной методики анализа. Выявить и сравнить диагностсгческую значимость модифицированного метода анализа цистешювых катспсшюв В и Н крови. Исследовать варьирование активности этих ферментов в плазме крови человека и крысы.
6) Провести экспериментальную апробацию препаратов
цистешювых катепсинов в качестве протеолитических агентов
медицинского назначения. Исследовать препарат
модпфицировашюй формы цистсинового катепсина для
парентерального введения, предназначенный для активации
почечного протеолнза.
Научная новизна исследования. В настоящем исследовании использованы существенно модифицированные методы очистки и определения активности цистешювых катепсинов.
С помощью модифицированных методов анализа изучена индуцибельность цистешювых катепсинов в тканях и активность в плазме крови человека и экспериментальных животных. Показано, что несмотря на высокий уровень в тканях, активность катепсина Н в плазме крови у здоровых доноров не обнаруживается. Bnqrabie выявлено, что при удалении злокачествешп>гх новообразований и при отсутствии их рецидива активность катепсина Н в плазме крови не исчезает. При экспериментальной гипероксии, голодании и беременности крыс впервые показана преобладающая индуцибельность катепсина Н в тканях печени и почек по сравпегапо с катепсином В и суммарной активностью цистешювых
катепсинов. Показана индукция катепсшіа В в биоптатах почек человека при патологиях, сопровождающихся протсннурией, и, впервые обнаружено торможешіе актішности фермента при нарастании протешгурии за счет эндогенных ингибиторов. При отторжении трансплантировашвых почек выявлено накопление инертного по отношению к белковым субстратам катспсина В, связанного с аг - макроглобулином. Тем самым, впервые показана возможная роль эндогенных ингибиторов протеолиза плазмы крови в развитии патологических механизмов путем блокирования тканевого протеолиза.
Изучены реакции, катализируемые очищенными препаратами цистеиновых катепсинов. Показана пространственная удаленность существенной серы активного центра от поверхности контакта молекулы катепсшіа В с потенциальными субстратами. Выявлены особенности спектра молекулярных форм цистеиновых катепсинов в тканевом материале. Для тканей почек впервые показано существование двух основных форм катепсина В, а также образование крупномолекулярных форм этого фермента за счет способности агрегировать с эндогешпыми белками и ингибиторами.
При очистке катепсшіа В из почек человека показано, что этому ферменту не свойственна аминопептидазная активность, которая характерна для катепсшіа Н. Выявлено активирующее влияние восстановленных форм ішкотинамидньїх коферментов на существеннный атом серы активного центра цистеиновых катепсинов. Впервые показано, что окислнтельньш путь регуляции активности цистеиновых катепсішов в тканях не представлен. Их окислительная инактивация возможна при участии синтетического переносчика электронов фенозинмегасульфата ( ФМС ).
Практическая значимость работы определяется
предложеїшьіми вариантами методов очистки и анализа активности цистеиновых. катепсинов, а также изучением роли нарушений тканевого протеолиза при прогрессировашш патологического процесса почки в условиях протешгурии.
В нефрологической лечебной практике следует учитывать, что ингибиторы протеиназ из крови могут попадать в клетки тубулярного эпителия, блокируя сопутствующее протешгурии усиление тканевого протеолиза. В отличие от пептидгидролаз крови их угнетение в тканях эндогенными ингибиторами плазмы крови является неблагоприятшым фактором при прогрессировании патологического процесса.
Усовершенствованный метод очистки может быть использован: 1) для производства коммерческих препаратов и 2) для получения перспективного для энзимотерапии модифицированного препарата нистеинового катепсина с неиспользованным ранее механизмом действия при парентеральном применении.
Усовершенствованный спектрофотометрический метод анализа активности катепсина Н в крови больных с онкопатологией, пригоден для практического использования в качестве дополнительного диагностического критерия.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Цистеиновые катепсины В, Н, L представлены в тканях почек человека и животных и могут быть выделены в результате многоэтапной процедуры очистки. Катепсин В в тканях почки обнаруживается в двух основных молекулярных формах I и II и нескольких минорных. Форма II катепсина В из тканей почек человека в отличие от формы I обладает более высокой активностью по отношению к белковым субстратам и меньшим сродством к некоторым синтетическим субстратам трипсиноподобиых пептид-гидролаз. Обе формы катепсина В характеризуются пространственной удаленностью существенной серы активного центра от поверхности контакта с субстратом. Наряду с обычными, имеющими молекулярігую массу около 25 КД, в экстрактах тканей выявляются крупномолекуляршые формы катепсина В, содержание которых возрастает при нарушении функщш органа. В составе крупномолекулярных форм катепешіа В в тканях почек, отторгнутых после трансплантации, обнаруживаются формы фермента в составе комплексов с эндогенным ингибитором а2- макроглобулином.
-
Активность цистеиновых катепсинов в тканях может возрастать в несколько раз: А) за счет восстановления существенной серы активного центра и Б) более чем в 10 раз за счет активации биосинтеза (индуцибельностн). Высокая индуцибельность цистеиновых катепсинов крыс наблюдается в тканях печеші и почек при гипероксии ( 100% 02 , 16 час ) и при беременности. При голодашш наблюдается снижение этих активностей в почках и некоторое возрастание в печеші. Окислительный путь угнетения активности цистеиновых катепсинов в тканях почек не представлен. Вне зависимости от вида воздействия катепсші Н примерно вдвое более индуцибелен по сравнению с катепсшшм В. Катепсин В почек индуцибелен у человека при возрастании протеинурии. Индуцибельность фермента может сменяться торможением активности,
8 вероятной причиной этого феномена является реабсорбпия и накопление в лизосомалыюм аппарате канальцевого эпителия эндогенных ингибиторов протсиназ.
-
В крови здоровых доноров активность катепсина Н не обнаруживается. При злокачествешіьіх новообразованиях челюстно - лицевой областе у человека в плазме крови выявляется катепеші Н. Активность катепсина Н в плазме крови послеоперационных больных при отсутствии рецидива опухозш не исчезает полностью.
-
Из тканей почки могут быть выделены и посредством модификации получены формы катепсина В, приводящие при парентеральном введении к существешшму усилешио эндогенного протсошпа в тканях почки реципиента. Модифіщировашпле формы этого цистеинового катепсина можно отнести к препаратам пептидгидролаз с неизвестной ранее биологической активностью, перспективным для использования с целью усиления протеолитических функций почки.
Апробация диссертационного материала. Материалы работы доложены
-на симпозиуме с международным участием - "Структура и функции лизосом", проходившем в 1976г. ( Москва ), 1980 г. ( Новосибирск ), 1986 г. (Тбилиси),
-на 4 Всесоюзном съезде биохимиков в 1979 г.,
-на конференции республик Прибалтики, Белоруссии, и Ленинграда в 1981г. (Рига),
-на VI Пленуме Всесоюзного объединения нефрологов в 1984 г. (Ташкент),
-на Всесоюзной школе - семинаре для врачей биохимиков в Москве "Биохимический анализ в клинико- диагностических лабораториях", в 1986г,
-на Съезде нефрологов в 1986 г. ( Москва),
-на Всесоюзной конференции " Методы анализа биохимических препаратов ", в 1987 г. (Юрмала ),
-на школе- семинаре " Лазерная биология и лазерная медицина", в 1990г, (Тарту),
на III конферешиш нефрологов северо-запада в 1991 г. (Новгород), -на симпозиуме " Опухоли головы и шеи" в 1991 (Таллші), -на IV двугоднчном конгрессе международной ассоциации патологии ротовой полости в 1992 году ( Гамбург),
-на 12 - конгрессе Европейской ассоциации изучения рака в 1993 г (Брюссель).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 30 работ, из них 3 Авторских свидетельства.
9 Структура и объем диссертации:
Текст диссертации "Цистешювые катепсины и их особенности в зависимости от состояния клетки и организма" изложен на 249 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций. Библиография включает 296 источников ( 79- отечественных и 217- зарубежных ). Работа иллюстрирована 31 рисунком и 21 таблицей.
